文摘
它一直被发现,人类多能细胞可以隔绝囊胚的胚胎状态,人类胚胎干细胞(ESCs)。这些细胞可以无限期地适应和传播文化的一种未分化的方式以及细胞分化成代表三大微生物层:内胚层、中胚层和外胚层。然而,人类从捐赠的胚胎多能细胞的来源有限,限制了伦理问题。因此,探究了各种方法,并证明了他们的成功。人类多能细胞也可以推导出核重编程体细胞实验。这些技术包括体细胞核转移(SCNT)、细胞融合和多能性基因的超表达。在本文中,我们讨论这些方法核重编程的技术挑战,包括他们的优点和局限性。我们还将突出的可能应用这些技术在干细胞生物学的研究。
1。介绍
多能细胞可以产生任何胎儿或成人细胞类型,200多个特定的细胞类型。那些能够与祖细胞分化成有限数量的细胞命运被描述为多功能细胞,如造血祖细胞。第一个多能人类胚胎干细胞(为来自人类的内细胞团的隔离和培养(ICM) [1]。方法推导为保持一样的原始协议多功能鼠标ESCs的推导2]。根据第一个协议,详细描述为其的传播,胚泡的外trophecodermal层是第一个被免疫外科学和ICM随后镀到gamma-irradiated或丝裂霉素C-treated小鼠胚胎成纤维细胞(mef)的高血清浓度。几天后在文化、hESC殖民地开始形成(1,3]。未分化的殖民地大部分为显示紧凑nucleus-cytoplasm比率高的形态和留住多能在这两种能力在体外和在活的有机体内实验。他们能够形成拟胚体导致自发分化为三个胚胎胚芽层(4]。为也可以形成畸胎瘤当植入SCID小鼠(5,6),这反映了他们在活的有机体内分化能力。畸胎瘤细胞贡献区域代表所有三个胚胎胚芽层,包括内脏和腺体上皮(内胚层的象征),软骨,骨骼和平滑肌(中胚层的象征),和神经上皮细胞和胚胎神经节(表明胚层)[1,3]。然而,由于道德约束,无法在人类系统进行测试。hESC建立的主要限制是捐赠的体外受精胚胎的可用性和伦理限制在一些国家。这带来了发展替代核重编程的方法来获得人类多能细胞,为相似。长期以来一直认为,细胞分化时,它就失去了他们的可塑性和永久不再需要灭活基因。最近发现了三核重编程的方法,(1)体细胞核移植,(2)细胞融合,(3)直接重编程体细胞hESC超表达的转录因子。然而,提高成功率的派生人类多能细胞,有必要了解多能性的关键监管网络,因为这些知识将提高人类多能细胞的推导能力和文化条件。因此,本文打算描述基本的人类多能细胞多能性网络是接着讨论上述重组方法的技术挑战。
2。多能性:人类胚胎干细胞的调控机制(为)
为其自我更新是受内在和外在因素。内在因素是转录因子,维持hESC身份至关重要。最好的学习内在因素OCT4 NANOG和SOX2在老鼠和人类的ESCs发挥重要作用。POU5F1 OCT4、编码的轨迹,是homeodomain POU家族的转录因子。OCT4多能性是必要的,所定义的基因敲除和转基因小鼠实验(7]。的RNAi Knockingdown OCT4为迫使他们分化成胚胎外的内胚层血统(8]。研究定义了几个目标OCT4基因。依赖OCT4基因活动的表达包括FGF4 [9],REX1 [10],Lefty-1 [11]虽然人体绒毛膜促性腺激素(HCG)由OCT4压抑的活动(12]。Nanog和SOX2也为中高度表达,大幅下调细胞分化[3,13,14]。像OCT4、NANOG表达似乎是维护ICM和为其的关键;删除NANOG导致ICM细胞脏层和壁内胚层的命运而采用过度阻碍分化为和部队维护未分化表型(15]。类似于OCT4, SOX2维持多能性为其状态是很重要的。SOX2由RNAi的缺乏是造成hESC向滋养外胚层分化(13]。SOX2在多能性的重要作用已经得到证实的能力表达的重组人成纤维细胞成为多能细胞SOX2 OCT4、KLF4,原癌基因(16]。
外在因素,如生长因子信号通路,为调节自我更新的也很重要。但是,与内在因素,保持自我更新所需的信号通路的老鼠和人类的ESCs似乎非常不同。虽然ESCs最初是孤立的和由coculture mitotically灭活MEF饲养细胞,他们可能需要不同的信号给料机保持未分化状态的细胞。而制的推导及其传播处于未分化状态需要的生活(17],hESC自我更新需要FGF2 [3]。一个可能原因这种差异可能源于不同的生长因子受体在老鼠和人类的ESCs表达谱。制表达白血病抑制因子(生活)受体/ gp130受体复合物,结合生活和调解多能性通过激活下游STAT3 (18]。相比之下,为不表达生活受体或gp130受体(19]。FGF信号目前被认为是主要的机制hESC多能性维持的文化。发现未分化为表达FGFR1、FGF2的同源受体,越发比分化细胞(19]。等其他FGFRs FGFR2, FGFR3, FGFR4,似乎也丰富的未分化为(20.]。除了FGF信号、苯丙酸诺龙/节点路径还维护多能性为其通过机制的FGF2充当能力因素(21]。希望,多能性的不同机制为其未揭露的,重要的生长因子,细胞因子,和信号分子会被发现,这可以改善人类多能细胞的维护和推导效率的简化,但最优,系统的时间太长。
3所示。人类多能胚胎干细胞的诞生为)
汤姆森等人报道,在1998年第一个建立为捐赠的体外受精胚胎的囊胚(1]。增长为其灭活mef或MEF-conditioned媒体介绍的存在潜在的转移异型生物质病原体从老鼠到人体组织。因此,后来,推导hESC线使用人类馈线和血清为了避免潜在污染xenoproteins报道和异种的组织(22]。这些实验表明,新的hESC线路可以派生xeno-free系统,从而允许他们在未来治疗应用。然而,这是一个问题,利用馈线细胞如馈线细胞的变异,在大规模生产带来的不便,分子由馈线细胞产生的怀疑。已取得显著进展最近在了解如何保持为feeder-free环境中由于各种细胞因子的补充,要么独自FGF2 [23)或结合‘诺金’(24)或苯丙酸诺龙(25,26]。进一步hESC申请临床行,它显然是一个优先级,最终完善hESC文化系统以达到GMP标准,包括文化条件、物理环境、设施建设、设备、和维护(27]。的一个关键问题导致hESC技术用于细胞和组织治疗人类组织相容性28]。近期数据支持这一概念,为其及其分化后代拥有immune-privileged属性,表明细胞诱导免疫耐受为其可能提供一个潜在的工具(29日]。然而,只有一些可用hESC线,导出为临床级和有一个遗传稳定性的担忧后,为其长期的放大在体外(30.]。更重要的是,破坏人类胚胎的道德争论在很大程度上已经禁止大量的推导hESC线。的发现为其打开了应用程序的可能性的人类多能细胞移植疗法,药物筛选和毒理学研究。然而,前面提到的障碍必须克服这种潜力才能实现。在另一个场景中,术语“个性化的多能细胞”创造的,人们可以用自己的体细胞重编程回到多能细胞状态。以下消息强调的挑战创造人类多能细胞的各种方法。
4所示。体细胞核转移(SCNT):核重编程的经典方法
当分化的体细胞的细胞核,如皮肤细胞,移植到一个无核的卵母细胞,核重编程是启动,导致生成一个完整的个体,这是原始体细胞克隆的基因完全相同。代的多能细胞在小鼠模型(SCNT已经被很好地记录下来了31日,32]。指出SCNT的过程是由多个阶段和技术要求。核移植技术原理包括体细胞供体细胞和未孕,无核的卵母细胞。体细胞的核供体细胞移植到无核的卵母细胞显微操纵器,导致联盟的组件。这个重建细胞刺激胚胎发育。刺激可以由电脉冲或化学制剂(33]。统一方面的重编程体细胞核转移后的鸡蛋是生化变化建立约束遗传潜力是相反的。这种逆转的效率很可能决定了后续发展的核移植胚胎的成功。这是意识到核,核移植重组无核的卵母细胞是一个低效的过程。虽然有零星的报道效率高、后代的整体发展速度是1 - 3%的(34]。的卵母细胞在SCNT可以是使用在活的有机体内或在体外成熟细胞,但是在活的有机体内成熟卵母细胞似乎给一个更好的囊胚发育率(35]。解释这个事件就是从性发育成熟卵母细胞的动物更发展主管,因为他们有更好的供应因素改造时细胞核转移到细胞核。除了卵母细胞的来源,供者细胞的起源也影响SCNT-derived胚胎的质量。相对较少的分化供者细胞胚泡发展导致更好的结果相比,更多的分化细胞(34]。此外,供体细胞培养时间越长在体外一般开发囊胚(减少的根本原因36]。这个原因的可能性是低分化细胞的细胞核更多的塑料和更容易能够移除和替换影响转录的蛋白质比细胞核分化细胞。这也与各种压抑的染色质结构组装的渐进稳定发展收益(37]。除了所有这些考虑,SCNT-derived胚胎含有孕产妇在卵母细胞线粒体DNA (mtDNA)。mtDNA的突变可能导致细胞功能障碍,癌症和疾病(38- - - - - -40),限制的潜在使用多能细胞获得这种不完美的卵母细胞。替代的成功成熟的非人类的灵长类动物线粒体基因组的最近报道(41]。这种方法是由主轴转移从一个鸡蛋一个无核的染色体复杂,线粒体的鸡蛋。重建的卵母细胞和线粒体替换能够支持正常受精,胚胎发展,健康的后代。甚至这种技术熟练的;它可以很快应用于人类卵母细胞的突变mtDNA。
通过核移植重组技术尚未得到广泛的证明在人类系统访问以来的人类卵母细胞来源不仅是一个难得的机会,也是一个道德问题的时刻42]。除了低可用性,这个过程还取决于自愿捐赠的卵子和这种技术的成功率相当低(43,44]。最近,体细胞核移植到无核的受精卵导致克隆胚胎干细胞的生成和老鼠。在这种技术中,小鼠受精卵暂时使用药物诺考达唑在有丝分裂被捕。由此产生的胚胎发展成老鼠,从而支持体细胞核重编程(45]。这个过程的应用对人类系统可能是适用的;然而,最近,这个过程被限制在人类的翻译。种间克隆,将人类体细胞核移植到阐明动物卵母细胞,揭示了超越人类卵母细胞的可用性的限制。2007年,介绍在英国有争议的提议允许创建跨物种的胚胎,希望获得一个足够数量的混合hESC行研究[46]。但这带来了一个巨大的观点对人类克隆生成的可能性,并在一些国家这个选项已经被完全禁止。此外,由于核重编程的替代方法的发展,克隆人类种间不再是科学家关注的。
5。异核体:混合多能细胞的生成
另一种方法来生成人类多能细胞之间的细胞融合体细胞和为其47)这是导致“异核体的诞生。“异核体这个词意味着一个包含多个基因不同的细胞细胞核。与无核的卵母细胞,细胞质ESC缺乏重组体细胞的能力,但ESC核(48]。概念上相关的方法重编程体细胞核的细胞融合后的主要基因型和表现型为核体细胞杂交后的重新编程。建立的混合细胞细胞融合显示为极为相似的特点。这是假定为其的细胞内容组成的重组因子可能影响体细胞的细胞核的表观遗传状态回到多能状态(49,50]。这些重新编程细胞表达关键多能性基因,Oct4、Sox2, Nanog [47),也可以生成所有三个胚胎胚芽层在体外和在活的有机体内(51]。这个过程包括胚胎干细胞和体细胞融合,重组细胞的染色体细胞组件。发现神经干细胞是cocultured ESCs表明收购成人神经干细胞多能性的可能是由自发的多能细胞的细胞融合。这些细胞被发现保险丝和留住成人标记和多功能(52,53]。这种融合杂种细胞的多能性可能不是完全来自体细胞基因组,作为体细胞基因组可能由多能细胞基因组的关键调控基因控制。
然而,它是具有挑战性的,因为混合细胞来源于融合体细胞和为其重新编程细胞含有染色体物质从细胞以及细胞染色体四倍体。到目前为止,还没有报道的成功去除遗传内容为混合动力车的电池。这是希望如果hESC基因组成功移除从hESC-somatic细胞混合动力车,它有可能获得immune-matched多能细胞来自患者自身的细胞。使用hESC细胞质有核的中期阶段是另一个可能的选择(54]。然而,所有这些可能性,还有一个警告,必须认真考虑。尽管混合动力车可能导致所有三个胚胎胚芽层,进一步的调查关于他们后生异常是必要的。需要澄清是否分化后代从混合细胞功能,不存在任何基因/表观遗传畸变随后可能导致细胞转化。最后,负责监管的因素融合体细胞核的混合动力车之前必须为他们找到治疗方法的有效性。
6。由转录因子诱导多能性:调制的核心基因调控网络
突破在iPSC研究由于初始多利羊的克隆实验(55]。然后,一些研究显示,重组因子在卵子的细胞质和ESCs能够在体细胞诱导多能性56]。在2007年,它被发现,4个关键转录因子的过度表达,Oct4、原癌基因,Sox2, Klf4,为他想细胞重组人类成纤维细胞,被称为人类诱导性多功能干细胞(hiPSCs) [16]。万能的成功证实了从多个组,后者的研究包括不同因素的组合,Nanog和Lin28 [57]。细胞则通过了最严格的考试对于基因表达谱,多能性、自我更新和胚层分化在体外和在活的有机体内(16,58),确认为其显著的相似性。hiPSC技术的发展及其特点为再生医学开辟了新的希望。然而,最近的报告发现hiPSCs仍然保留起源细胞的表观遗传记忆(59),这可能导致分化的倾向则启动细胞的谱系。这个问题似乎限制hiPSCs的进一步应用,特别是细胞疗法。
在过去的几年中,主要人类多能干细胞的来源主要是集中在万能。尽管超表达重组因子重组的过程听起来很简单,目前iPSC技术两个主要问题:(1)hiPSC大幅低效率小于0.1%的成纤维细胞成为hiPSCs [16,58,60,61年),(2)使用病毒作为一个向量可以导致随机病毒DNA整合到宿主细胞基因组。与其他策略相比,使用病毒载体,逆转录病毒,和慢病毒基因转移被认为是一个高效的工具;因此,病毒转染正成为最受欢迎的选择pluripotency-inducing转基因的表达(16]。然而,重组基因的病毒载体转移似乎是万能的劣势在人类临床设置,比如移植,因为病毒DNA整合到宿主细胞基因组改变宿主细胞基因组的常态和可能导致细胞转化(62年]。有许多研究发现使用病毒载体进行重编程体细胞。这些技术包括使用质粒转染和piggyBac换位系统(63年]。另一种病毒性载体转染的方法是使用一个multiprotein表达载体包含原癌基因的编码序列,Klf4, Oct4, Sox2与2肽重组两个老鼠和人类成纤维细胞(61年]。一旦实现重组,使用瞬态Cre表达转基因可能会被删除。piggyBac系统是一个转座子基因在哺乳动物细胞。piggyBac系统能够提供大的遗传成分没有显著降低效率。这个系统是用来重组人类成纤维细胞细胞则(60]。研究还探讨了应用修改信使rna和蛋白质,由这些重编程基因编码(64年,65年),显示通过使用这些分子重组过程的成功。然而,与病毒载体相比,这些替代品的能力显著降低重组细胞的数量和生产这些重组分子需要特定的实验室。尽管有许多挑战,有可能有多个优势hiPSCs为,从个人可以生成前,保持一个人的遗传素质和身份。此外,则代表一种分化细胞基因相同的起源可能有用的人筛选药物对个人形式的病理学和移植组织的来源。
7所示。未来的挑战
这是一个漫长而有趣的历史的核重组日益复杂的技术已经成为可访问。比较多能细胞来源于这三个不同的方法表现出某些共同的属性,包括基因表达谱和分化能力。此外,端粒的延长和复活人类端粒酶逆转录酶普遍存在于这些“重编程”的细胞。然而,对于所有核重编程策略,有些体细胞比其他人更容易重新编程。因此,这些特性可以利用不同调查多能性原理机制。三种方法不同,每个人都有自己的优点和缺点。例如,SCNT特点是快速重组过程(66年和理想的拨款是阐明早期胚胎发育和生殖生物学的基本原理,以及产生足够数量的为其治疗目的。相反,细胞融合技术简单。当使用细胞融合形成杂交物种产生,不扩散,多能性基因被激活快速、效率高(67年]。因此这种方法特别适合于展示控制核重编程的发病分子机制,但它不产生临床级细胞。另一方面,迫使多能转录因子的表达可以提供这样的细胞。由于缓解iPSC技术,现在全球在世界各地的实验室学习。此外,则提供了一个工具来研究人类疾病(68年和药物发现69年]。在不久的将来,可能得多核重编程的新方法可能会出现目前的安全策略和比目前更高的效率。
缩写
| hESC: | 人类胚胎干细胞 |
| ICM: | 内细胞团 |
| MEF: | 小鼠胚胎成纤维细胞 |
| SCNT: | 体细胞核转移。 |
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
那些作品作者道歉不是引用由于空间的限制。这项工作被Suranaree科技大学的支持。