羊水-液干细胞：生长动态和分化潜能一个CD-117为基础的评选程序后

抽象的

羊水(AF)已成为一个有趣的来源胎儿干细胞。然而，AF包含异质性和多分化、部分分化的细胞类型。从羊水分离后，细胞的形态和生长动力学特征。利用表面标记cd117进行磁性相关细胞分选。为了显示干细胞的特性，如多能性，并评估这些细胞可能的治疗应用，房颤液体来源干细胞在缺氧条件下沿着成脂性、成骨性、软骨性以及神经元谱系分化。我们的研究结果表明，磁性相关细胞分选(MACS)对生长特性没有显著影响，这可以通过加倍世代时间来证明。然而，在选定的细胞片段中，有关于脂肪生成、成骨和软骨分化能力改变的影响。相反，在未选择的细胞群中，神经元分化增强。

1.介绍

胎儿干细胞代表了干细胞研究领域中一个相对较新的细胞群，显示出独特和迷人的特征，而最近的研究提供了新的见解，干细胞生物学和新的假设策略，以开发其治疗潜力。这些细胞可以来自胎儿本身，也可以来自支持胚胎外结构，如羊水[1].由于羊水是胚胎外的，而且相对容易获取细胞，因此羊水是胚胎干细胞的重要替代来源[2，3.]．

然而，众所周知，羊水代表了一个非常不均匀的群体，包括来自胎膜和胎儿本身的细胞。根据羊水来源细胞的形态、生化和生长特征，已对其进行了分类，确定了三组羊水来源细胞，如上皮样细胞、羊水特异性细胞和成纤维细胞样细胞[4]．

在羊水源性细胞培养开始时，从羊水特异性细胞中优先发现上皮样细胞，而成纤维细胞样细胞通常出现较晚，并不是在所有的羊水样本中。这些细胞被认为来自纤维结缔组织和真皮成纤维细胞[4，5]．

用于AF-细胞的特异性培养协议的发展已经允许从羊水6。因此分离和多能干细胞的扩张，这些干细胞表现出典型的间充质干细胞标记物，如CD 29，CD 90，CD 166，CD 73，CD 105，CD 49和CD 117 2，它们是阴性的造血表面标记CD 45，CD 34和CD 14 [6，7]．进一步的研究发现，这些细胞也具有多能干细胞的特征，如干细胞标志物Oct-4和SSEA-4的表达[2，3.]．除了沿中胚层谱系分化潜能的分化为成骨细胞和软骨细胞也分化为神经谱系已经被记录在案[6]．使用cd117阳性af细胞进行的进一步研究证实了这些细胞向神经谱系分化的潜力[2]．在他们的多能性的方面，他们是胎儿组织工程应用有吸引力的自体细胞来源。到目前为止，自体羊水基于细胞的组织工程化构建体已经被成功地用于膜片的新生儿修理和胎儿气管重建[8，它们有潜力在体外形成胎儿心脏瓣膜叶[9]．应用神经诱导后，不朽羊水细胞的神经标记物表达增强[10]．

因此，在我们的研究中，我们从普通amniocenteses以及来自amniodrainages获得不同的培养条件研究AF细胞的生长特性。我们研究的重点是使用MACS系统的表面标志CD的基础上，细胞分选程序后AF细胞的分化潜能117.我们的数据显示，从积极的分数AF细胞表现出改善的分化特征为骨和软骨形成细胞谱系，而从负级分的细胞，有利地显示了神经分化的能力。成年大鼠脑内移植后，细胞表现出显着的整合和分化能力。

2.材料和方法

2．1．羊水来源细胞的起源

羊水取自人羊膜穿刺术样本。羊膜穿刺术是妊娠15-20周进行产前诊断的临床常规手术。这是一个道德认可和接受的程序。或者，从羊水过多患者的羊水引流中提取羊水。细胞遗传学分析未发现重大异常时，才使用细胞样本。所有患者均给予书面知情同意，并详细告知我们根据本研究方案完成诊断的程序，该方案已获得当地医院伦理委员会的批准。

2．2.羊水来源细胞的细胞培养

将羊水来源的细胞常规培养在最低必需培养基(α.mem;Invitrogen公司，卡尔斯鲁厄，德国)添加10%胎牛血清(FBS, PAA, Cölbe，德国)，置于100mm培养皿中，37℃，5%湿化CO孵育₂．细胞在添加5%胎牛血清的advanced Dulbeccos Modified Eagles培养基(ADMEM, Invitrogen)中进行培养。第一次介质变化是在5天后进行的，以避免任何机械应力。10 ~ 14天后，当培养物达到80%汇合时，用Accutase (PAA)收集细胞，并以2000个/cm的速度复制²．细胞培养可达6代。实验用的细胞取自第2代。

与标准培养条件不同，羊水来源的细胞在还原氧的气氛中培养₂张力。含5% CO的正常湿化组织培养箱₂用于21%氧培养。对于低氧培养，在2%氧的存在下培养平板_2.

２．３．细胞动力学评价

通过测定来自羊膜引流和羊膜穿刺术以及来自选定和未选定AF细胞的细胞倍增时间来研究细胞动力学。细胞按1 × 10的密度被置于培养基中^3. cells/cm²在细胞培养皿中，使其增殖至80%汇合。然后在每条传代时取贴壁的心房颤动细胞，用血球计计数。根据每个传代的血细胞计数和细胞培养时间(CT)计算代加倍次数(GDT)和细胞数(CD)，计算公式如下: （:传代前汇合处细胞数：细胞数传代后接种）。

２.４.HC-Ad载体的构建及细胞标记

如先前所述产生的高容量腺病毒载体（HC-AD）[11]．向量HC-Ad。表达增强GFP (egfp增强绿色荧光蛋白)的FK7也有报道[11]．用浓度为2 × 10的原液AdV感染AF细胞⁶传染性单位/μL，对应单个细胞的50个感染倍数(MOI)。转导后24小时，通过测定Hoechst染色核染色标记的总细胞群中EGFP表达的细胞群来分析转导效率(未显示)。

2．5．免疫选择的CD117

为了从单细胞悬液中对c-Kit阳性细胞进行免疫选择，将细胞与兔CD117多克隆抗体(c-Kit)孵育，该多克隆抗体针对该蛋白的细胞外结构域(氨基酸23-322)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)。

通过与磁性山羊抗兔IGG微珠微珠孵育纯化CD117阳性细胞，并在制造商推荐的协议之后，在迷你MAC抗兔IGG微珠微珠微珠和选择迷你 - MACS设备（Miltenyi Biotec，Bergisch-Gladbach，德国）。将AF细胞常规递推1：4至1：8的稀释，并且不允许膨胀超过70％的汇合。

2.6。CFU化验

在MACS分选和扩增CD117+和CD117−后，将羊水来源的细胞分别在10、50、100、500、1.000和10.000个细胞/100 mm直径的培养皿中培养。培养12天后，细胞固定，用1%甲酚紫100%甲醇染色。计数>50细胞的菌落数量。

2.7。af细胞的体外分化

如前所述，间充质干细胞进行了体外分化[12]．分析细胞以分化成骨质发生和软骨内谱系的能力。分化在单层中进行。细胞以3×10的密度镀层^3. cells/cm²，并在37°C培养在潮湿的大气中（5％CO₂)。培养基每周更换三次。

通过在成骨培养基中培养AF细胞3周（OM）来诱导骨酸分析。OM由含有10％FCS的DMEM（Invitrogen）组成，0.05mM抗坏血酸-2-磷酸，10毫米β甘油磷酸盐和0.1μ地塞米松。通过观察ASCs的形态变化和钙化细胞外基质(ECM)的沉积来评价ASCs的成骨分化。

在三维(3D)颗粒培养中进行软骨分化诱导。对于3D颗粒培养，AF细胞以5 × 10密度重悬⁵ cells/mL. The chondrogenic medium was supplemented with insulin-transferrin selenium (ITS) 1 : 100 v/v (1.0 mg/mL insulin from bovine pancreas, 0.55 mg/mL human transferrin, and 0.5 μg/mL亚硒酸钠)，0.1μM地塞米松，0.05毫米抗坏血酸，50 μM - l-脯氨酸，1毫米丙酮酸钠(Sigma, Deisenhofen，德国)。细胞悬液(500μL)取15 mL聚丙烯离心管(Eppendorf, Hamburg, Germany)， 500 g离心5 min。如前所述[12]．软骨形成培养基中加入5 ng/mL TGF-β1(σ)。每隔3天加入新鲜培养基。培养基中无TGF-β以1为对照培养基进行对照3D培养。试管置于37°C、5% CO的湿化气氛的培养箱中₂长达3个星期。管子的盖子被松开，以便空气交换。

2.8。细胞类型考试

用于组织学染色程序，即分别根据成骨或软骨诱导过程培养物用4％PFA的细胞，脱水，包埋在石蜡中，并切成5 μ米的部分。细胞分别用碱性磷酸酶、von Kossa和Alcian blue染色，以显示成骨和成软骨分化潜能。von Kossa染色用4%甲醛室温固定细胞30分钟。用蒸馏水冲洗细胞，然后在无光条件下覆盖1% (wt/vol)硝酸银溶液30分钟。用蒸馏水洗涤细胞数次，用核坚牢红反染。

2.9。羊水来源细胞的神经诱导

为了增强神经分化，将羊膜细胞来源的细胞转移到无血清培养基(DMEM/F12, Invitrogen)中，添加生长和分化因子FGF8 (100 ng/mL)并结合维甲酸(RA) 1μM和被镀在密度为2000细胞/厘米²在4孔培养板中的聚甘氨酸层层涂层玻璃盖玻璃上。或者，它们在补充有10％FBS，表皮生长因子（EGF，20ng / ml，研发系统，威斯巴登，德国），碱性成纤维细胞生长因子（BFGF，20ng / ml）和N2的DMEM / HAMS F12中培养它们（Invitrogen）。在处理免疫细胞化学研究之前，在这些诱导培养基中培养细胞5天。

2.10。egfp标记的AF细胞移植

对于脑室注射，使用成人Wistar大鼠（250-300g），并按照联邦政府准则保存。用6mg / kg甲嗪和60mg / kg氯胺酮的混合物麻醉动物。将动物转移到立体定向装置中。将切口在胸部3mm的头部3mm中进行。使用牙科钻，将毛刺孔与2.5mm的尾部垂直到2.5毫米。10 μL预分化和GFP标记的af细胞缓慢注入距硬脑膜4.5 mm处的纹状体[13]．在人af细胞注射后，动物每天皮下注射环孢素A(瑞士山德士)(10 mg/kg)。7、14、21 d后，在深度麻醉下用氧嗪、氯胺酮、肝素、盐酸普鲁卡因和4%甲醛补充PBS灌注大鼠。大脑被移除，前脑被修剪，样本在18%的蔗糖中冷冻后保存。低温恒温器部分(20μm)用于表达gfp的移植细胞的鉴定和免疫荧光分析。

2.11。细胞免疫细胞化学染色

为了研究羊水来源的细胞的神经标记物表达，将5个独立培养的细胞用0.1 M含4% PFA的PBS冲洗后固定。冷冻器的脑切片也用于免疫组化分析。细胞和组织切片用由2%山羊血清和5%胎牛血清组成的封闭液处理30分钟。在需要标记细胞内表位的实验中，细胞和组织切片进一步用0.025% Triton X-100处理30分钟，然后用PBS冲洗。

本研究使用的一抗见表1．

4°C孵育过夜。二抗使用如下稀释:Cy3或cy2结合亲和纯化山羊抗小鼠或抗兔IgG (Rockland, Gilbertsville, PA, USA) 1:1000。

用biotin标记的山羊抗豚鼠(Sigma，德国)稀释1:400检测豚鼠产生的抗gfap抗血清，然后用FluoroLinkTMCyTM3标记的链霉亲和素(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg，德国)稀释1:1000检测。室温孵育1h。抗体培养后用Hoechst Dye 33342对细胞核DNA进行染色。准备工作被Entellan(默克，达姆施塔特，德国)覆盖。使用Axiophot荧光显微镜(Zeiss, Oberkochen, Germany)对安装的标本进行分析。

阴性对照采用省略一抗的方法进行。使用合适的细胞群如神经干细胞、神经干细胞来源的神经元和胶质细胞来检测神经标志物的特异性。

2.12。统计分析

使用Axiophot荧光显微镜观察细胞（蔡司，Oberkochen，德国）.对每个盖玻片在五个连续的随机场中的细胞进行计数。从三个独立实验的至少两个盖玻片到四个盖玻片，细胞数量以平均值±SD表示。应用学生进行统计分析，包括ELISA调查的评估-使用Microcal Origin软件(Northampton, MA, USA)检验或单因素方差分析(ANOVA)。

3.结果

３．１．羊水来源细胞的体外特征

使AF细胞粘附在塑料培养皿中，并生长4-5α.-改良老鹰培养基(α.-MEM）补充10%胎牛血清（FBS）或补充5%胎牛血清的高级Dulbeccos改良Eagles培养基（ADMEM）。在这两种培养基中，第一批贴壁细胞可在电镀24小时后鉴定。形态学检查显示，细胞不会形成单层细胞粘附在培养皿底部。相反，可以观察到几个密集的细胞团。然而，在第一次传代后，可以看到同质细胞层（单层），然而，产生的细胞群是相当异质的。在岛状或细胞群中生长的细胞呈现多边形形态，与邻近细胞建立紧密接触。此外，还有细长的梭形细胞，类似于体外培养的间充质细胞。

第一次传代后，AF细胞根据所使用的培养基表现出明显的形态差异。总的来说，细胞群的异质性仍然是明显的，但当细胞培养α.-MEM具有10％的FBS主要是具有细长工艺的主轴形状，在ACMEM中培养的细胞具有5％FBS的形态在体外类似上皮细胞（图1(一)和1 (b))．

比较两种不同培养基中AF细胞的增殖能力。在这两种介质中，倍增时间可确定为30 ~ 40小时。在媒介中(α.-MEM)中添加10%胎牛血清的细胞在第10代的第60天显示了稳定的增殖率，而在添加5%胎牛血清的ADMEM中培养的细胞在第30天或第4至第5代时只能观察到稳定的生长(图)1 (c)和1 (d))．由于这些更稳定的培养条件，为进一步的实验只培养细胞α.-MEM(10%胎牛血清)。

下一步，比较普通羊膜穿刺术细胞与羊膜引流术细胞的生长情况。由于羊膜引流的羊水体积比羊膜穿刺的羊水体积大1000倍，因此羊膜引流的细胞产量也明显较高。形态学上，在羊膜引流液培养皿中可见大量脱皮的上皮细胞。然而，尽管羊膜引流制备的原始细胞数量明显较高，但细胞密度约为700-1200细胞/cm²两种细胞群之间是相似的。比较两种细胞群的长期培养很明显，衍生自羊膜膜的细胞的生长特性更恒定，平均存活时间为60至80天。因此，对于我们进一步的实验，只使用那些细胞（图1 (e)和1 (f))．

3.2.磁珠相关细胞分离

采用磁性微球(MACS)免疫选择程序从异质羊水来源的标本中分离c-Kit - (cd117)阳性干细胞群，因为cd117被认为是间充质干细胞的特异性[2]．选择程序后，CD117+细胞的百分比为总细胞群的3.2±1.03%。此外，在细胞分离后，CD117+细胞的形态学部分显示了间充质干细胞的典型特征，细胞体拉长(图)2(一个))，而CD117−细胞部分由细胞组成，在体外显示出类似上皮细胞的多形性形态(图2 (b))，用免疫细胞化学方法显示后一种细胞表达上皮细胞典型的细胞角蛋白(图中插图)2 (b))．产生倍增时间在未被选择的单元，以及在CD 117阳性和CD 117阴性细胞级分进行评价。从生长动力学数据表明，平均为30-40小时的倍增时间产生的选择过程之后没有改变。它保持不变，直到文化60天（未显示）。

３．３．CFU化验

通过使用CFU测定分析自我更新的潜力。将细胞在10，50，500，1.000，5.000，和10.000个细胞/ 100mm的培养皿的密度铺板并扩增12天。即使在低密度（如5和10个细胞/培养皿）下覆盖AF细胞，也产生单个菌落。平均速率为启动AF细胞群的30％，表明细胞群在体外具有自我更新能力。CD117 +和CD117-细胞之间没有差异（图3.)．

3．4．AF细胞的体外分化潜能

为了研究羊水来源细胞的多潜能，我们在特定的诱导培养基中培养af细胞，以确定其体外成骨、成软骨和神经元分化潜能的特征。

在适合诱导MSCs分化成成骨谱系12的条件下，培养21天，检测细胞群的成骨潜力。在抗坏血酸，地塞米松和β甘油磷酸盐，细胞增殖迅速形成密集的菌落。在培养中，致密粒状区域出现的单个菌落内以及经常形成在这些培养物中的细胞的多个层的时间。成骨细胞分化中未被选择的AF细胞以及在CD117 +和CD117-细胞级分进行评价。有比在CD117-或在非选择单元分数CD117 +细胞群具有显着更强的ALP染色强度（)（数字4(一)- - - - - -4（c）)．

与ALP活性相似，von Kossa染色分析显示钙沉积持续增加(未显示)。用Red Oil O染色同样评估成脂分化().在CD117时− 未检测到脂肪细胞分化，这在CD117+细胞组分中最为突出。未选择的细胞显示中等脂肪细胞分化能力（图4（d）- - - - - -图4（f）)．

使用三维颗粒培养诱导成软骨分化[14) ()．在这些条件下，三维细胞聚集在软骨诱导后两天就可以检测到。

在3周的栽培期内，团聚体的大小逐渐增加。在此之后，将聚集物固定、冷冻、嵌入组织Tec中并在−80°C冷冻。冰冻切片用蛋白聚糖专用的阿利新蓝染色进行染色(图)4 (g)- - - - - -4(我))．根据成骨分化和软骨分化，与未选择的和CD117−细胞群相比，CD117+细胞部分的阿利新蓝染色强度明显更强。在CD117+细胞群中，这明显更强()比无软骨分化因子培养的适当对照细胞(图4 (j))．

为了进一步证明AF细胞的分化潜能，并建立其在神经退行性疾病的细胞治疗中的可能应用，我们还对其在CD117+、CD117−和未选择细胞中的神经分化能力进行了评估。

在神经元诱导因子以及缺氧条件下进行神经元分化（2％po₂)．使用特定的神经标记物分析CD117−和受刺激的细胞的神经分化潜能βIII微管蛋白、α-间连接蛋白和GFAP（图5)．此外，通过测定早期神经元标志物HNK-1的表达，量化了神经元诱导后神经元分化的增加，与未选择的细胞和CD117+细胞相比[15]．对HNK-1表达的评估显示，在阴性细胞部分，该标记物的表达明显强于未选择的细胞和CD117+细胞群(图)6)．

3.5。CNS移植后AF细胞的神经元特征

选择培养基培养的表达gfp的AF细胞定向注射到成年Han Wistar大鼠的纹状体中。注射一周后，细胞可以很容易地通过其在注射部位的组织学切片上的GFP表达来识别(图)7(一))．那时细胞形态呈圆形、均匀，无突起，为未分化细胞的典型特征[16].移植后1-3周内，可在不同位置检测到细胞。细胞具有典型的神经细胞形态，具有神经突起样突起。移植后2周，大多数EGFP表达细胞排列成细胞簇，部分共表达GFAP（图7 (b)）;移植后3周可见细胞播散。形态学研究显示典型的神经元形态，具有突出的突起(图)7 (c)和7 (d)).使用抗GFAP抗体进行的免疫荧光分析显示，EGFP标记的AF细胞在形态上整合到纹状体内宿主细胞的环境中，尤其是在脑室下间隙，GFP和GFAP明显共标记（图7 (e)- - - - - -7 (g))．

4.讨论

结果表明，羊水细胞的培养条件和来源对某些亚型异源性房颤细胞的培养和扩增具有决定性作用。

根据文献报道，高血清含量（20%FBS）与α-MEM培养基结合可促进细胞的间充质表型[6]．在我们的研究中，这些细胞显示出相当恒定的生长特征，而使用血清含量低至5%的ADMEM可以富集更多的上皮细胞群体，而没有任何统一的生长动态。此外，为了获得更均匀的细胞群，羊水提取的方法是相当重要的。如果从羊水引流中获得羊水，完整的间充质细胞的细胞产量相当低。相反，有大量脱皮的上皮细胞干扰了完整细胞的粘附。贴壁细胞也显示相当不均匀的生长动力学。据我们所知，这是第一次比较来自于用于缓解羊水过多的羊水引流的细胞或来自于妊娠15周至20周期间正常情况下的羊水中的细胞。

为了获得更均匀的细胞群体，并以分离的间充质干细胞，一种选择是一个表面标记相关联的细胞分选作为实现由MACS技术。然而，对于AF细胞中观察到的表面标记物是不从不同组报告之中一致。虽然一些实验室已经发现，AF细胞是CD117 [负6，17]另一组能够用CD117界磁性微球分离AF细胞[2]．然而，其他表面标记物如CD105的表达水平也被发现在不同研究组之间存在差异。一些研究小组发现，CD105在AF细胞中强烈表达[2，17]，而另一组报告CD105只是弱表达[6]．关于AF细胞的表达谱有很多不同的报道，因此有必要对这些细胞进行深入的研究。我们的结果表明，只有大约2-5%的细胞群CD117呈阳性。然而，在细胞分离后，CD117+细胞片段显示间充质干细胞的典型特征，而阴性细胞群体具有相当上皮的形态。相反，令人惊讶的是，所有三个细胞群:未选择的细胞，cd117阳性细胞部分以及cd117阴性细胞显示出相似的生长特征。这表明，尽管羊水中的细胞群是异质性的，但多种细胞群共存是可能的。

采用成脂、成骨、成软骨和神经元分化的方法研究cd117阳性细胞和阴性细胞的分化潜能。不出所料，与阴性或未选择的AF细胞相比，cd117阳性细胞组分显示出明显更好的成脂、成骨和软骨分化特征。这些数据再次显示了所选细胞群的间充质特性，因此与之前关于AF细胞广泛多能性质的报道一致[14，18]．

相反，根据早期神经元标志物HNK-1的表达，cd117阴性细胞比cd117阳性细胞具有更高的神经元分化潜能。这与De Coppi等人的报告形成了鲜明对比。[2他的研究表明cd117阳性细胞具有神经分化潜能。

这种差异可能部分是由原始细胞群的巨大异质性以及培养条件（包括使用的血清批次）造成的。另一方面，如前所述，有应用流式细胞术的研究表明，羊水细胞对CD117呈阴性[6]．事实上，这可能实际上指示存在存在于羊水，其中一个是CD117 +两种不同的干细胞群，另一个是CD117-。后者将是一个在我们的研究与改进的神经元分化潜能。无论如何，都CD117 +和CD117-在我们的研究中分离羊水细胞显示自我更新的特性并表现出多向效力，质量和方法途径包括分离过程是可比较的和可靠的那些在现有文献描述。

我们和其他研究小组之前也曾描述过羊水来源细胞的神经元特征[10，19]我们的研究中的神经元分化是在缺氧培养条件下进行的，因为众所周知，缺氧刺激缺血脑内的神经再生[20.]．

神经元的性质和分化特征也可以通过我们的移植研究得到证实。在GFP标记后，为了明确检测羊水- (AF-)来源的细胞，可以证明整合到中枢神经室的各个部分。细胞显示神经细胞的典型特征，具有多个突起。此外，细胞还共同表达一些神经元和胶质标记物，如GFAP，表明它们的整合和沿着神经谱系的原位分化。这些数据与早期关于AF细胞在大鼠脑中的整合能力的报告一致[21骨髓间充质干细胞在成年大鼠脑移植后的神经分化潜能及其整合特性的观察[13]．

5.结论

总之，我们的数据揭示了来自羊水的干细胞的多潜能，强调羊水细胞可能是一种有趣的替代来源的干细胞治疗各种疾病。然而，根据所需的细胞分化或治疗应用，分离程序必须相应地调整。虽然间充质细胞可以分化为成骨、成脂或成软骨谱系，但包括上皮细胞在内的其余细胞群可以顺利地分化为神经谱系。特别是，在新生儿医学中，从羊水中提取的干细胞可以作为自体细胞来源，用于治疗成骨性、软骨性缺陷等出生后必须直接治疗的疾病和早产儿视网膜病变等神经退行性疾病。

资金

这项工作的部分资金来自德国的Elke-Kröner-Fresenius-Stiftung。

承认

作者谨感谢C. Hoffmann、J. Kozlowski、S. Kettner和A. Damm提供的专家技术援助。

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