SCI 干细胞国际 1687 - 9678 SAGE-Hindawi访问研究 715341年 10.4061 / 2011/715341 715341年 研究文章 羊水干细胞:生长动力学和分化潜能在cd - 117为基础的选择过程 这些后 年代。 1 涂胶器 年代。 2 哈特曼 K。 1 拉伯 O。 1 查尔顿队 K。 2 Wenisch 年代。 1 Hoopmann M。 3 阿塔拉 安东尼 1 美国兽医解剖学 Justus-Liebig-University吉森 98年法兰克福Straße 35392吉森 德国 uni-giessen.de 2 解剖学系我 科隆大学 50924年科隆 德国 uni-koeln.de 3 对妇产科诊所 图宾根大学 72016年Tuebingen 德国 uni-tuebingen.de 2011年 18 01 2011年 2011年 18 08年 2010年 25 10 2010年 09年 01 2011年 2011年 版权©2011 s .这些et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

羊水(AF)已成为一个有趣的胎儿干细胞的来源。然而,房颤包含异构和多个部分分化的细胞类型。从羊水隔离后,细胞是关于他们的形态学特征和生长动力学。他们按磁相关使用表面标记CD 117细胞分类。为了显示干细胞多能性和评价等特点可能治疗的应用这些细胞,房颤fluid-derived沿着脂肪形成的干细胞分化,成骨,chondrogenic以及神经元缺氧条件下血统。我们的研究结果显示,磁性相关的细胞分类(MACS)不显著影响生长特性演示的一代倍增时间。然而,对于一个改变脂肪形成的影响,成骨,chondrogenic选定的细胞分化能力分数。相比之下,在未经选择的细胞群神经元分化增强。

 1。介绍

胎儿干细胞代表一个相对较新的领域的细胞群干细胞研究,表现出独特而迷人的特性,而最近的研究提供了新的见解干细胞生物学以及新的假定的策略来利用他们的治疗潜力。这些细胞可以从胎儿本身或者羊水等支持胚胎外的结构( 1]。胚胎外的的组合,为细胞提供相对容易获得收获使胎儿的羊水中一个重要的替代来源的干细胞( 2, 3]。

然而,众所周知,羊水代表一个不同的人口,包括细胞来源于胎儿膜以及胎儿本身。羊水衍生细胞分类的基础上他们的形态,生化和生长特性,与三组amniotic-fluid-derived epithelial-like细胞等细胞识别羊膜fluid-specific细胞,细胞和纤维母细胞( 4]。

初的羊膜fluid-derived细胞培养的amniotic-fluid-specific细胞优先epithelial-like细胞可以被发现,而成纤维细胞等细胞通常出现后,所有液体样品。这些细胞被认为是由纤维结缔组织和真皮成纤维细胞 4, 5]。

特定文化的发展对AF-cells协议允许隔离和扩张的多功能干细胞羊水6。因此,这些干细胞表现出典型的间充质干细胞标记,如CD 29, 90 CD, CD 166、73年CD, CD 105年,49岁的CD, CD 117 2,它们是负面的造血表面标记CD 45, CD 34岁和CD 14 ( 6, 7]。进一步的调查显示,这些细胞也有多功能干细胞的特征,证明干细胞标记物的表达,如Oct-4和SSEA-4 [ 2, 3]。除了沿中胚层分化潜能谱系分化成成骨细胞和软骨细胞的分化成神经血统一直记录( 6]。进一步调查使用CD 117积极AF-cells证实这些细胞分化的潜能神经细胞系( 2]。对他们是一个有吸引力的自体多能性细胞来源胎儿组织工程应用。到目前为止,自体羊水细胞组织工程结构已经成功地用于新生儿修复的隔膜和胎儿气管重建 8),他们有可能形成胎儿心脏瓣膜体外(传单 9]。一个增强神经标记的表达不灭的羊水细胞已被证明在应用神经感应( 10]。

因此,在我们的研究中,我们调查了房颤细胞的生长特性在不同文化条件下从普通羊膜穿刺术获得从amniodrainages以及。我们研究的重点是AF细胞后,细胞的分化潜力排序过程使用mac系统的基础上表面标记CD 117。我们的数据表明,房颤细胞从正分数显示提高成骨和chondrogenic谱系分化特征,而细胞从负分数,有利地显示神经分化能力。在成年大鼠颅内移植后,细胞表现出显著的集成和分化能力。

 2。材料和方法 2.1。羊膜Fluid-Derived起源细胞

羊水是人类羊膜穿刺术获得样本。羊膜穿刺术是临床常规程序执行在15 - 20周中妊娠的产前诊断。这是一个伦理批准和接受过程。另外,羊水被从amniodrainages羊水过多患者。细胞样品时只使用没有发现重大异常的细胞遗传学分析。所有病人给详细书面知情同意和被告知我们的诊断程序履行根据本研究的协议,这是当地医院伦理委员会批准。

 2.2。细胞培养的羊膜Fluid-Derived细胞

羊膜fluid-derived细胞常规培养在最低基本培养基( αmem;英杰公司、德国卡尔斯鲁厄)补充10%胎牛血清的边后卫,PAA, Colbe,德国在100毫米培养皿和孵化37°C和5%湿润有限公司2。或者细胞培养在先进的杜尔贝科进行修改鹰介质(ADMEM英杰公司)补充5%的边后卫。后的第一个媒介改变了5天,以避免任何机械应力。10到14天后,当文化融合已经达到80%,细胞收获使用Accutase (PAA),和山肩在2000个细胞/厘米2。这些细胞被保存在文化6通道。实验细胞来自通道2。

或者对标准培养条件,羊膜fluid-derived细胞培养在一个氛围,减少O2张力。正常进行组织文化孵化器有限公司为5%2用于21%氧气的文化。减少氧文化,盘子O种植的2%2。

 2.3。评价细胞动力学

细胞动力学研究了确定代细胞倍增时间从amniodrainages和羊膜穿刺术以及选择和没有房颤细胞。细胞被镀在培养基1×10的密度3细胞/厘米2在细胞培养中融合菜肴和允许用直到80%。附着AF细胞被取消和计算在每个通道血球计。(GDT代翻倍)和数字(CD)计算血细胞计数器计数和细胞培养时间为每个通道(CT)根据以下两个公式: CD = ln ⁡ ( N 1 / N 2 ) ln ⁡ ( 2 ) , GDT = CT CD ( N 1 :细胞的数量在融合之前使 N 2 :细胞的数量使后播种)。

 2.4。建设HC-Ad向量和细胞标记

高容量adenoviral向量(HC-Ad)生成如前所述[ 11]。向量HC-Ad。FK7表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP-enhanced绿色荧光蛋白)也被描述( 11]。房颤细胞被感染使用股票供订购2×10的浓度6传染性单位/ μ50 L,对应于多样性的感染(MOI)为单个细胞。转导效率进行了分析后24 h转导通过确定的人口占总细胞数与EGFP的表达在细胞标记的赫斯特染核染色(没有显示)。

 2.5。免疫选择的CD117

的免疫选择c-Kit-positive细胞从单细胞悬浮体,这些细胞被孵化的兔多克隆抗体CD117 (c - kit),特定的蛋白质的细胞外领域(氨基酸23 - 322)(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)。

cd117阳性细胞纯化的孵化与磁山羊Anti-Rabbit免疫球蛋白微和选择Mini-MACS装置(Miltenyi研究,Bergisch-Gladbach,德国)协议后推荐的制造商。房颤细胞亚文化例行的稀释1:4 - 1:8和不允许扩大超出70%的融合。

 2.6。CFU化验

mac排序和扩张后CD117 +和CD117−羊膜fluid-derived细胞被镀在10,50岁,100年,500年,1.000和10.000细胞/ 100毫米直径的培养皿。After12天的文化,细胞被固定和沾1%甲酚紫100%甲醇。殖民地> 50个细胞的数量统计。

 2.7。AF-Cell体外分化

进行了体外分化为间充质干细胞(前面描述的 12]。分析了细胞能分化成成骨和chondrogenic血统。在单层分化了。细胞被镀在3×10的密度3细胞/厘米2,培养在37°C在湿润的气氛中(5%股份有限公司2对各个时期)。中了三次一个星期。

成骨分化培养房颤引起的细胞为3周成骨的介质(OM)。OM的DMEM(表达载体)含10% FCS, 0.05毫米抗坏血acid-2-phosphate 10毫米 β甘油磷酸盐和0.1 μ地塞米松。成骨分化对asc的评估评价形态变化和钙化的细胞外基质(ECM)沉积。

chondrogenic诱导分化进行了在三维(3 d)颗粒文化。对3 d颗粒文化AF细胞的密度resuspended 5×105细胞/毫升。chondrogenic介质与insulin-transferrin补充硒(其)1:100 v / v(1.0毫克/毫升从牛胰腺胰岛素,0.55毫克/毫升人类转铁蛋白,和0.5 μ0.1 g / mL亚硒酸钠) μM地塞米松,0.05毫米抗坏血酸,50 μM l-proline, 1毫米丙酮酸钠(σ,Deisenhofen,德国)。细胞悬液(500 μL)整除为15毫升聚丙烯离心管(埃普多夫,汉堡,德国),并在500 g离心液5分钟。如前所述( 12]。chondrogenic介质是补充TGF - 5 ng / mL β1(σ)。新鲜培养基添加每一个第三天。中没有TGF - β1是用作控制媒介控制3 d文化。孵化器的管被放置在37°C在湿润的气氛中有5%的公司23周。管帽的放松让空气交换。

 2.8。细胞类型检查

对于组织学染色过程,根据成骨细胞,培养或chondrogenic PFA感应过程是固定的4%,脱水,嵌入在石蜡,切成5 μ米的部分。细胞碱性磷酸酶染色,冯Kossa或阿尔新蓝染色为了演示成骨和chondrogenic分化潜力,分别。冯Kossa染色的细胞被固定为4%甲醛在室温下为30分钟。细胞与蒸馏水冲洗,然后用1%的硝酸银(wt /卷)解决方案在没有光的30分钟。这些细胞被洗了几次蒸馏水和与核快红复染色。

 2.9。神经诱导羊膜Fluid-Derived细胞

增强的神经分化,amniocyte-derived细胞无血清培养系统转移到(DMEM / F12,英杰公司)的生长和分化因子补充FGF8 (100 ng / mL)结合维甲酸(RA) 1 μM和镀的密度2000细胞/厘米2在Poly-Ornithine-Laminine镀膜玻璃盖玻片在4文化板块。另外,他们在DMEM培养/火腿F12补充10%的边后卫,表皮生长因子(EGF、20 ng / mL,研发系统、威斯巴登,德国),碱性纤维母细胞生长因子(bFGF, 20 ng / mL),和N2(表达载体)。在这些诱导细胞培养5天媒体前处理采用调查。

 2.10。EGFP-Labelled AF细胞的移植

脑室注射,成人Wistar鼠(250 - 300 g)被使用和保持按照联邦政府的指导方针。动物麻醉的6毫克/公斤甲苯噻嗪和氯胺酮60毫克/公斤。动物被转移到一个立体定向仪。一个切口在前囱侧头皮3毫米。毛刺洞尾0.3毫米和2.5毫米侧前囱用牙钻。10 μL predifferentiated和GFP标记AF-cells慢慢注入到纹状体的深度4.5毫米的硬脑膜( 13]。后人类AF-cell注入动物收到每日皮下环孢菌素(瑞士Sandoz)注射(10毫克/公斤)。后7、14和21天,老鼠牺牲深麻醉下心脏内的灌注与甲苯噻嗪和氯胺酮与肝素和procainhydrochloride PBS补充,其次是4%的甲醛。大脑被移除,前脑修剪,和样品冷冻cryoprotection后18%的蔗糖。低温恒温器部分(20 μ米)的识别处理GFP-expressing移植细胞和免疫荧光分析。

 2.11。采用免疫染色的细胞

调查神经标记表达式的羊膜fluid-derived细胞,细胞5独立的文化清洗后被固定在0.1 M PBS PFA在4%。免疫组织化学分析低温恒温器部分大脑的处理。细胞和组织部分与屏蔽解决方案治疗30分钟的边后卫山羊血清组成的2%和5%。在实验中需要胞内抗原表位的标签,细胞和组织部分进一步处理0.025% Triton x - 100 30分钟在PBS和冲洗。

在这项研究中使用的主要抗体是在表 1。

抗体 源 稀释
117年Anti-CD兔多克隆 圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国 1:11
Anti-pan细胞角蛋白,mAb Abcam,英国剑桥 1:40
反 α-internexin马伯 Chemicon泰梅库拉,加州,美国 1:1000
Anti-GFAP马伯 σ,Deisenhofen,德国 1:400
反 β-III-tubulin,兔抗血清产生 Covance,里士满,CA,美国 1:8000
Anti-HNK-1马伯,杂交瘤细胞上清液,TIB的200 美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美式文化集合 1:10

孵化项目进行一夜之间在4°C。二次抗体被用于以下稀释:Cy3或Cy2-conjugated affinity-purified山羊anti-mouse或anti-rabbit免疫球蛋白(美国罗克兰Gilbertsville, PA) 1: 1000。

Anti-GFAP抗血清产生在几内亚猪被Biotin-conjugated山羊antiguinea检测(σ,德国)的稀释1:400年后跟FluoroLinkTMCyTM3标记链霉亲和素(Amersham淀粉微球生物科技、弗莱堡,德国)的稀释1:1000。在室温下孵化项目进行1 h。抗体孵化项目核DNA与赫斯特染料染色后33342年。准备与Entellan盖玻片(默克公司,达姆施塔特,德国)。安装标本进行了分析使用一个Axiophot荧光显微镜(蔡司、从、德国)。

消极的控制是由省略主要抗体。特异性的神经标记测试使用适当的细胞群,如神经干细胞和神经stem-cell-derived神经元和神经胶质细胞。

 2.12。统计分析

这些细胞被认为使用一个Axiophot荧光显微镜(蔡司、从、德国)。细胞在连续五个随机领域是计算每个盖玻片。细胞的数量被表示为平均数±标准差至少两到四盖玻片从三个独立的实验。统计分析,包括评估ELISA调查,学生进行了应用 t 以及或者单向方差分析(方差分析)使用Microcal起源软件(北安普敦,妈,美国)。

 3所示。结果 3.1。羊膜Fluid-Derived细胞的体外描述

房颤细胞被允许坚持塑料培养皿中,增长了4 - 5个段落 α修改鹰介质( αmem)补充10%胎牛血清(的边后卫)或者在一个先进的杜尔贝科修改鹰介质(ADMEM)补充5%的边后卫。在这两种媒体第一电镀后24小时贴壁细胞可以识别。形态学检查发现,细胞不形成单层细胞培养皿底部附着。而不是几个致密细胞集群可以观察到。在第一段,同质细胞层(单层)可以看到,然而,由此产生的细胞群,而异构。生长在岛屿或在细胞组织,细胞显示多边形形态建立密切联系邻近的细胞。除此之外,也有细长纺锤形细胞,类似于间充质细胞体外。

第一段后房颤细胞显示显著的形态学差异依赖于所使用的培养基。一起的异质性的细胞群仍明显,但在细胞培养 αmem和10%的边后卫是主要和细长纺锤形的过程,细胞培养与5%的边后卫ADMEM形态类似于上皮细胞体外(数字 1(一)和 1 (b))。

房颤细胞的形态和生长特性在不同文化条件。(一)房颤细胞培养的存在 αmem补充10%的边后卫展览一个细长的形态。(b)在ADMEM面前的边后卫细胞显示为5%,而上皮样的形状。(c)细胞培养 αmem的边后卫(10%)显示均一一代倍增时间(GDT) (d)与培养在ADMEM(5%的边后卫)( n = 5 )。GDT (e)的细胞来源于羊膜穿刺术相当同质的平均存活时间60 - 80天。(f)细胞来源于amniodrainages揭示一些更长的生存时间比细胞来源于羊膜穿刺术和生长动力学是不均一的( n = 5 )。酒吧在a和b = 25 μm。

房颤细胞的增殖能力比较以及在两种不同培养基培养。在这两种媒体代倍增时间可以确定为30到40个小时。而在中( αmem)补充的边后卫细胞显示稳定增殖率为10%,直到60通道10天,而与细胞培养在ADMEM补充5%的边后卫稳定增长只能观察到,直到一天30或第四第五段(数字 1 (c)和 1 (d))。因为这些更稳定的文化进一步的实验只有细胞培养条件 αmem的边后卫(10%)。

作为下一步细胞生长的细胞来源于普通羊膜穿刺术是细胞从amniodrainages获得的相比。随着体积的羊水amniodrainages高出1000倍,从羊膜穿刺术,因此细胞产量amniodrainages也明显更高。形态,在培养皿中从amniodrainages大量脱屑上皮细胞可以被发现。然而,尽管原始细胞数量明显更高的amniodrainage-derived准备大约700 - 1200细胞的细胞密度/厘米2两个细胞群之间的相似。比较两种细胞群的长期文化很明显,细胞的生长特性来源于羊膜穿刺术更恒定的平均存活时间60 - 80天。因此,对于我们进一步的实验只使用这些细胞(数字 1 (e)和 1 (f))。

 3.2。磁Bead-Associated细胞分离

一个免疫选择过程与磁性微球(mac)是为了隔离c - kit - 117 (CD)积极从异构羊膜干细胞群fluid-derived标本117 CD被认为是特定于间充质干细胞( 2]。选择程序后CD117 +细胞的比例为3.2±1.03%的细胞群。此外,在细胞分离形态CD117 +细胞分数显示与细长的间充质干细胞细胞的典型特征(图 2(一个)),而CD117−细胞分数由细胞揭示一种类似上皮细胞在体外的变形形态(图 2 (b)),用免疫细胞化学可以显示这些后者细胞表达细胞角蛋白典型上皮细胞(插图图 2 (b))。一代没有细胞倍增时间是评估以及CD 117积极和CD 117 -细胞分数。增长的数据动态显示,生成倍增时间平均30 - 40小时后不改变选择的过程。它保持不变直到60天文化(没有显示)。

CD117 +和CD117 - AF细胞的形态分析。(一)CD117 +细胞显示典型的细长的间充质干细胞的形态学,(b) CD117−AF细胞显示,而变形的上皮细胞在体外,插图,CD117−细胞上皮标记可以被染色的细胞角蛋白(红色荧光)与核标记赫斯特复染色染料(蓝色),酒吧在a和b = 25 μm和b = 15中的插图 μm。

 3.3。CFU化验

分析了潜在的自我更新使用CFU化验。细胞被镀的密度,50岁,500年,1.000,5.000,和10.000细胞/ 100毫米培养皿,扩大了12天。单个菌落生成即使AF细胞被镀在低密度等5和10个细胞/培养皿。开始AF-cell人口的平均率为30%,表明分组人口与体外自我更新能力的细胞。没有区别CD117 +和CD117−细胞(图 3)。

CFU的演示和比较分析的自我更新潜能CD117−和CD117 + AF-cells。电镀非常低的细胞数量会导致生成单独的殖民地(CFU)证明了甲酚紫染色。1000 (a)集落形成后镀CD117每100毫米(−)细胞培养皿。1000 (b)集落形成后镀CD117(+)细胞每道菜。比例尺= 1厘米。

 3.4。房颤细胞的体外分化潜力

调查multipotentiality羊水衍生的细胞,AF-cells在特定培养诱导媒体描述的成骨,chondrogenic和神经元在体外分化潜力。

细胞的成骨的潜在人口测试条件下培养期后21天是合适的诱导msc分化为成骨的血统12。在抗坏血酸盐、地塞米松和 β甘油磷酸盐,细胞迅速扩散,形成密集的殖民地。在文化、致密颗粒领域出现个别殖民地和在时间内形成多层细胞通常在这些文化。成骨细胞分化在未经选择的评估房颤以及CD117 +和CD117−细胞分数。有明显更强的高山CD117 +细胞染色强度的人口比CD117−或未经选择的细胞分数( n = 5 )(数据 4(一)- - - - - - 4 (c))。

体外分化潜力的AF细胞向成骨的(高山染色),脂肪形成的,chondrogenic(阿尔新蓝染色)血统。(一),而只有疲软的高山染色的CD117−细胞分数,(b)这是明显更强的CD117 +细胞群。(c)没有AF-cells也显示出一个相当弱成骨分化,证明了弱高山染色。(d)虽然没有去证实的石油重做染色可以观察到在CD117 -细胞分数,(e)强阳性油红O染色可以观察到在CD117 +分数,(f)在未选中的人口只有一个小数量的细胞表现出红油O阳性染色。(g)后chondrogenic感应在CD 117 -细胞扩散阿尔新蓝染色检测。(h) chondrogenic感应CD 117阳性细胞分数后形成一个公司与强大的阿尔新蓝染色颗粒皮质区。丸有透明cartilage-like形态学裂陷形成基于特征包含圆的椭圆形状的细胞类似于软骨细胞,发生单独或在两到三个细胞巢。(我)扩散阿尔新蓝染色在未经选择的细胞也可以检测到。(j)光密度分析的阿尔新蓝染色不同的实验组,每组有显著较高的染色强度CD117 +细胞分数比没有选择或CD117−细胞( n = 6 )。(ⅰ)= 100比例尺 μ米,在insets(胃肠道)= 50 μm。

类似于高山活动,连续增加钙沉积分析的冯Kossa染色可以证明(没有显示)。脂肪形成的差异化是类似的评估使用红O染色油( n = 5 )。而在CD117−细胞没有去检测,这是最突出的CD117 +细胞分数。没有露出一个温和的脂肪形成的细胞分化能力(数据 4 (d)- - - - - - 4 (f))。

Chondrogenic分化诱导使用三维颗粒文化( 14)( n = 5 )。在这些条件下三维细胞聚集可以检测到已经两天后chondrogenic归纳。

骨料逐渐增加的大小总培养段三个星期。后这段时间总量是固定的,cryoprotected,嵌入在组织Tec和冻结在−80°C。Cryosections丸的使用阿尔新蓝染色法染色特定蛋白聚糖(数字 4 (g)- - - - - - 4(我))。根据与chondrogenic分化成骨分化也有明显更强的阿尔新蓝染色强度相比,CD117 +细胞分数没有和CD117−细胞群。以防CD117 +细胞群这是明显更强( P < 。 05年 )比在适当控制细胞培养没有chondrogenic分化因素(图 4 (j))。

为了进一步证明房颤细胞的分化潜能和建立他们的可能应用在神经退行性疾病的细胞疗法也神经元分化能力评估在CD117 +以及CD117−和未经选择的细胞。

神经元分化的神经元进行诱导因素以及在缺氧条件下(2% pO2)。的神经分化潜力CD117−和刺激细胞分析使用特定神经标记等 β三世微管蛋白、αinternexin和GFAP(图 5)。此外,增加神经元分化后神经元感应是量化相比,没有细胞的决心以及CD117 +细胞表达的早期神经元标记HNK-1 [ 15]。评估HNK-1表达式表明,有一个更强大的表达式的标志-细胞分数比没有选择以及CD117 +细胞群(图 6)。

神经标记表达式的证明神经分化的潜能。后神经选拔程序的表达等神经标记(a) α-internexin, (b) β三世微管蛋白,(c)以及GFAP可以显示。二次抗体对所有主要抗体Cy2共轭(红色荧光)。细胞核与赫斯特标记染料33342核染色(蓝色荧光)。比例尺(a - c) = 10 μm。

HNK-1 AF细胞表达神经元分化能力的确认CD 117积极和消极细胞分数和低氧(2%啊2文化条件。(a)温和HNK-1(橙色荧光,箭头)表达在未经选择的细胞和(b)的弱表达早期神经元标记HNK-1(箭头所指)。(c)虽然有更强的HNK-1表现117年CD -细胞分数检测(箭头),(d)的量化图形显示HNK-1表情没有,CD117 +和CD117−细胞分数。(*)显著增加的HNK-1 immunopositive细胞相比,控制。二次抗体Cy2共轭(红色橙色荧光。整个细胞群与赫斯特发现核染色染料(蓝色荧光)( n = 5 , P < 。 05年 )。规模的酒吧(f) = 25 μm。

 3.5。神经中枢神经系统移植术后房颤细胞的特征

GFP-expressing房颤在选择培养基上培养细胞stereotactically注入成年汉Wistar鼠纹状体。注射后一周,细胞很容易被他们的GFP表达在注射部位的组织部分(图 7(一))。当时细胞显示和统一的形态没有任何流程,这是典型的未分化细胞( 16]。在移植后1 - 3周,细胞可以发现在不同的位置。细胞有典型的神经细胞形态学neurite-like流程。在移植后2周,大多数EGFP-expressing细胞排列在细胞集群和部分coexpressing GFAP(图 7 (b));在3周后移植细胞的传播是可见的。形态调查显示典型的神经元形态与突出的过程(数据 7 (c)和 7 (d))。使用抗体对GFAP免疫荧光分析显示EGFP-labeled AF细胞形态整合到宿主细胞内纹状体的环境,优先在subventricular空间明确colabeling GFP和GFAP(数字 7 (e)- - - - - - 7 (g))。

集成和分化的GFP标记(绿色荧光)predifferentiated CD117−AF细胞在移植到成年大鼠的纹状体。(一)GFP标记细胞可以找到在纹状体注射部位。(b)一周后嫁接GFP表达细胞仍安排在注射部位附近的集群,在公司与星形胶质细胞标记GFAP染色(Cy2共轭二次抗体,红色荧光)(c)和(d)典型的神经细胞GFP表达细胞的形态与细长的流程可以检测到2周后嫁接与早期costaining神经元标记 α-internexin (Cy2、红)、(e)的密集网络GFP表达过程是可见的,(f)与星形胶质细胞标记显示co-staining GFAP (Cy2,红色)。(g)覆盖的GFP(绿色)和GFAP表达细胞(红色)。酒吧在(a) = 20 μ米,(b) = 15 μm和(c)和(d) = 10 μm。

 4所示。讨论

证明文化条件和推导培养羊水细胞是决定性的和扩张的某些亚型的异构AF衍生细胞。

根据文献报道,血清含量很高(20%的边后卫)会同αMEM培养基可以促进间充质细胞的表型( 6]。在我们调查这些细胞显示相当恒定的生长特性,而使用ADMEM血清含量低至5%的结果更浓缩的上皮细胞的人口没有任何统一的增长动力。此外,为了获得更均匀的细胞群,羊水检索的方法是相当重要的。如果流体从amniodrainages,获得完整的间充质细胞的细胞产量很低。相反,有大量脱屑的上皮细胞,扰乱了完整细胞的粘附。贴壁细胞也透露,而非齐次增长动力。据我们所知这是第一个比较细胞来源于amniodrainages为了缓解羊水过多或从羊水在正常情况下患者在怀孕期间15至20周妊娠。

为了获得更均匀的细胞群和分离间充质干细胞,一个选择是一个表面标记细胞相关排序mac技术实现的。然而,细胞表面标记观察AF报告来自不同团体之间是不一致的。虽然一些实验室发现房颤细胞为阴性CD117 [ 6, 17),另一组能够隔离AF细胞CD117-bounded磁性微球( 2]。然而,其他表面标记如CD105的表达水平还发现了不同研究小组之一。一些组织已经发现CD105在房颤细胞中表达的强烈 2, 17),另一组报道,CD105只是弱表达( 6]。因为有那么多不同的报告关于房颤细胞的表达谱,还需要进一步描述这些细胞进行深入的调查。我们的研究结果表明,只有2 - 5%的总细胞群CD117是积极的。然而,在细胞分离CD117 +细胞比例显示间充质干细胞的典型特征,而消极的人口,而上皮形态。相反,令人惊讶的是这三个细胞群:没有细胞,CD 117阳性细胞比例以及CD 117 -细胞显示类似的生长特性。这表明尽管羊水内细胞群是异构的,共存的各种细胞群是可能的。

CD 117积极和消极的分化潜能的细胞,分别研究了它们的脂肪形成的,成骨,chondrogenic及其神经元分化的潜能。不出所料,CD 117阳性细胞脂肪形成的分数显示明显更好,成骨的以及chondrogenic分化特征相比,负面的或者没有房颤细胞。这些数据再次显示选定的细胞群的间充质属性,因此根据先前的报道对房颤的广泛的多功能质量细胞( 14, 18]。

证明相反的神经分化潜力的表达神经元标记HNK-1早期,是117年CD -细胞分数高于117年CD积极的细胞群。这是形成鲜明对比的报告骑绝尘De et al。 2),表明CD 117阳性细胞显示神经元分化的潜能。

这种差异可能部分是由于原始细胞群的异质性和文化条件,包括血清批量使用。另一方面正如前面已经描述的有研究应用流式细胞术,这表明羊水细胞为阴性CD117 [ 6]。事实上,这可能表明,有两种不同的干细胞数量出现在羊水中,一个CD117 +,另一个是CD117−。后者将在我们的研究与改进的神经元分化的潜能。无论如何,既CD117 +和CD117−羊水细胞隔离在我们的研究中显示一个自我更新的属性和显示multidifferentiation效力,质量和方法论的方法包括隔离过程具有可比性和当前文献中描述的那样可靠。

神经元的特点羊膜fluid-derived细胞也被我们前面所述,其他组( 10, 19]。神经元分化在我们的研究中进行了低氧培养条件下众所周知,缺氧刺激本次在缺血性脑 20.]。

神经元的功能属性和神经元分化特征也可以证实我们的移植研究。GFP标记后为了明确检测羊水——(AF)派生细胞,融入各个部分中枢神经舱可以证明。细胞显示神经细胞的典型特征与众多的流程。此外,细胞也coexpress几个神经元和神经胶质标记如GFAP指示他们的集成以及原位沿神经谱系分化。这些数据符合先前的报告关于房颤细胞在老鼠大脑的综合能力( 21)和自己的观察骨骨髓来源间充质干细胞的神经元分化潜力及其集成属性后移植到成年鼠大脑( 13]。

 5。结论

总之,我们的数据显示从羊水干细胞的multipotentiality,强调羊水细胞可能会感兴趣的另一个来源的干细胞治疗各种疾病。然而,依赖于所需的细胞分化或治疗性应用程序分离过程做出相应调整。在间充质细胞分化成成骨的,而是脂肪形成的,或chondrogenic血统,剩下的细胞群包括上皮细胞可以直接进入神经血统相媲美。尤其是在新生儿医学从羊水干细胞可以应用作为疾病的自体的细胞来源,出生后直接治疗如成骨的或chondrogenic缺陷以及神经退行性疾病包括早产的视网膜病变。

 资金

这项工作是由Elke-Kroner-Fresenius-Stiftung部分中,德国巴特洪堡。

 承认

作者要感谢c·霍夫曼,j·科兹洛夫斯基,s . Kettner和a·达姆专家技术援助。

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