血管指南：微观脚手架图案的感应新生血管

抽象

当前组织工程技术由血管形成和细胞支架构建体的灌注不足的限制。通过聚合物支架内仿生血管通道的微结构图案化可能诱导新血管形成，从而允许大工程化的构造制造。在患者的前 - 顶缺损内的血管通道的网络，从脑膜中动脉前支始发，使用计算机辅助设计（CAD）技术，并随后并入到聚己内酯被建模（PCL）支架使用熔融沉积制造成型（FDM）。骨髓来源的间充质干细胞（MSC）接种到支架和植入到大鼠模型中，与在血管网络的近端插入程度动静脉丛。3周后，将支架升高作为预制复合组织的聚合物片和使用显微外科技术传送。植的支架的组织学检查显示沿着图案化的信道，具有丰富的毛细管和整个实验支架结缔组织形成的血管向内生长，同时控制支架仅表现出肉芽组织。作为转移游离皮瓣预制的所有结构存活下来，并可行的。我们称这个概念“血管指导，通过脚手架中定制的通道引导新生血管形成。我们的技术有可能制造出比目前技术更大的组织工程结构，以及基于CT扫描数据和CAD技术的患者特定血管网络的定制结构。

1.简介

在组织工程技术临床转化的主要限制仍然是不充分的血管形成，因此细胞支架结构的灌注。在使用骨组织工程聚合物支架许多研究中，组织形成一直局限于立即构建体的表面下方的区域，由于在该支架的深处细胞的差介质灌注，导致营养物和生长因子的受损递送，以及因缺氧氧合不佳。

早期对聚l -乙醇酸(PLGA)泡沫的研究发现，骨组织的穿透深度限制在190-220μ从组织工程构建物的表面米[1]。利用生物反应器[后续策略2]和材料的修改结合到羟基磷灰石的聚合物支架[3.]，穿透深度分别为3.7 mm和1.4 mm。随着新型仿生支架结构的使用，如模拟小梁骨[4，组织深度达到10毫米。最近，我们小组和其他人报道了熔融沉积建模(FDM)的使用，这是一种快速原型技术，用于设计具有完全互连的几何对称聚己内酯(PCL)支架，使骨组织形成贯穿整个细胞支架构造[5- - - - - -7]。

虽然这些技术可能让整个小聚合物支架的整个范围组织形成，他们将不足以确保大的组织工程结构，这将需要为绝大多数临床应用的足够的灌注。这些的实例包括一个颅骨骨瓣为颅骨成形术，或经工程改造的长骨段来替换节段性末端的缺陷。

我们以下的聚合物支架内的开放通道设计可能允许自然感应新血管形成，从而形成支架允许将其全部优良灌注假定微结构图案化通过创造仿生血管通道。其结果是，大型复杂工程细胞的支架的构建体可潜在地创建的，表示向临床应用的骨组织工程技术前进了一大步。对于我们的临床模型，我们选择了颅骨骨瓣模型。

2.材料和方法

2.1。概念化和血管腔的设计

在标准的颅骨切除术中，额顶骨瓣抬高会导致明显的颅骨缺损(图)1(一))。上骨瓣的内部方面，所引起的脑膜中动脉槽可以看出（图1 (b)），其在arborize分支图案灌注颅盖，具有前部和后部脑膜动脉在一起。由于所使用的计算机辅助设计（CAD）软件的限制，只有3因素可能被编辑的血管形成图案，其中包括支化的管之间的角度，通道直径，并且空间的设计。

通过对中脑膜动脉分枝形态的分析，得出了支架中血管通道设计的若干规律和假设。包括:(1)通道的分流角度应在45度左右;(2)通道直径为1mm，受机械约束，易于制造;(3)管间距设置为1mm。据报道，人体毛细血管之间的间距为200μm，毛细直径约50μm.生理通道间距为200的支架制备μm would result in compromised mechanical strength, hence a tube spacing of 1 mm was used instead. The Pro/ENGINEER software (Parametric technology corporation, Needham, MA) was used to create a CAD model of the scaffold, together inclusive of vascular channels. Figure2显示合成的CAD模型，用于制造血管通道与预测的血流模式。

2.2。聚合物支架的制备

Poly-e-caprolactone (PCL) of molecular weight (Mn) 80,000 (Sigma-Aldrich) was used, together with hydroxyapatite (HA), in a 9 : 1 ratio. The PCL-HA scaffolds were fabricated using fused deposition modeling (FDM), a rapid prototyping process, as previously described [8]。在这项研究中，支架测量mm是用0、60和120度的灯丝铺层模式制作的，孔隙率为70%。数字3(一个)显示预制脚手架的顶视图，红色标记表示血管通道的分支(图)3 (b))。数字图3（c）shows the side view of the scaffold, with channel diameter of 1 mm.

2.3。细胞分离和支架的文化，制备

采用标准方法收集猪骨髓间充质干细胞[9]。使用的细胞在传代2，并保持在完全DMEM +谷氨酰胺I (Gibco，美国)[10%]％青霉素/链霉素。培养传代，每周一次和媒体每三天更换。

前细胞接种，支架用磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，用70％乙醇消毒。随后，支架用一个MSC-纤维蛋白胶悬浮液接种。在的密度的MSC细胞最初悬浮在纤维蛋白原（TISSEEL，巴克斯特Biosciences公司，德国），然后均匀地接种到PCL支架。加入凝血酶以聚合该混合物，并创建一个纤维蛋白胶模拟细胞周围的细胞外基质。

2.4。动物外科及组织学分析

A 2 cm incision was made in the right groin of adult male immunodeficient CBH-ruul/+ nude rats, following which the inferior epigastric artery and vein were dissected out and ligated en masse (Figure图4（a）)。然后将这样制作的血管蒂插入实验支架(之前植入了间充质干细胞)血管通道网络的近端开口，用4-0 Prolene (Ethicon, Sommerville, NJ)固定(图)图4（b）)。然后将支架放置在皮下腹股沟口袋，和卷绕在层封闭。控制支架是相同的，以在尺寸，材料，和沉积图案实验支架，并在同一密度接种过的MSC。然而，这些被放置在对侧腹股沟没有腹壁下椎弓根的连接或植入。动物 （）中3周后处死，标本为外植用苏木精和曙红（H＆E）染色的组织学分析。

为了调查这一假设的预制支架结构可以通过显微外科技术3周后转移为游离皮瓣在活的有机体内，部分移出标本()作为基于上腹壁下血管的复合骨支架腹股沟皮瓣的一部分整体抬高。将上腹壁下动脉用10- 0prolene (Ethicon, Sommerville, NJ)端侧技术缝合至颈总动脉(图)图5（a）），而腹壁下静脉吻合端 - 侧到颈内静脉。翼片是插入到大鼠的头皮（图图5（b）)。

动物的饲养和喂养是按照标准的动物护理协议进行的。该研究得到了新加坡国立大学动物福利委员会的批准，并得到了国立卫生研究院(NIH)的许可。指导实验动物的护理和使用。

3.结果

H＆E染色实验支架的3周后植入显示该支架的微观树枝状图案下面的血管通道的血管形成（图6(一)），由结缔组织包围。此外，有一个在结缔组织的血管生成的证据，通过形成多个毛细管（图6 (b))。血管生成贯穿整个结构，渗透到结缔组织。相比之下，在对照支架中，只观察到肉芽组织，没有新生血管的迹象(图)6 (c))。

以下预制复合组织-腹股沟聚合物皮瓣转移到颈部，观察到护翼是可行的，通过良好的灌注和毛细血管充盈，以及dopplerable动脉和静脉信号临床观察。

4。讨论

体积超过几立方毫米的组织不能靠营养物质的扩散生存，而是需要毛细血管的生长来提供必需的营养物质和氧气[10]。相应地，当细胞超过150-200 μ当它来自血管时，就会遭受缺氧和其他营养物质的限制，因为这是它仅能通过扩散存活的最大距离[11]。因此，为了使组织工程在临床中得到广泛应用，建立毛细血管微血管网络和支持大血管循环是支持大型复杂组织和整个器官灌注的必要条件。

上翼片预制早期研究主要集中在诱导形成的本征的血管供应的组织中通过的块上演微血管传递中，为了提高存活率[12,13]。然而，关于二期移植术后静脉功能不全的报道以及这些手术的技术复杂性限制了预制游离皮瓣的广泛应用[14]。随后的努力已经更多地集中在实现血管形成在体外模型。这些包括使用动静脉束，就像在这项研究中使用的;或形成动静脉袢，以形成血管网，以预先制作皮瓣[15,16]。

在许多研究中，一个血管腔室被用来研究的组织形成诱导。在体内塑料腔室壳体聚（DL-乳酸 - 共 - 乙醇酸）（PLGA）的支架，血管化的组织的形成[的不同的实验上下文17,18]或脂肪组织[19是由植入动静脉环引起的。也有报道称，器官模式，如仿照肝器官结构制造实质室，用作肝脏辅助装置[20.]。在这项研究中，计算模型用于研究流动行为在人微血管中，接着其的概念装置被制造的。最近，采用三维计算机断层摄影（CT）扫描和CAD技术已被用于使用预制背阔肌作为游离组织移植血管化载体煤气颌骨重建一个osseocutaneous襟翼[21]。

经由通过微结构的支架图案化定制的血管通道的制造进一步延伸了使用静脉束，通过使用计算分析和容器通道的CAD制造在一起，如在本研究中完成的，允许仿生支架的高度精确的制造潜在允许的大复合骨的聚合物或osteocutaneous聚合物襟翼预制。这些可以通过显微外科技术与在重建手术应用游离皮瓣转移。

虽然这项研究的结果还处于初步阶段，但我们表明，通过支架制造技术诱导新生血管是可以实现的。因此，这种技术，我们称之为血管指导，通过支架中定制的通道引导新生血管形成，可能会制造出比当前技术更大的组织工程结构。我们的技术还允许定制支架与患者特定的血管网络，允许基于CT扫描数据定制构建(图)7)。

在以往的研究中，我们定义的概念“细胞指导” [22,23]，通过不断将细胞因子传递到植入支架的不同区域，从而创建仿生环境，从而实现细胞的位点特异性归巢在活的有机体内组织工程。“血管的指导”和“细胞指导”将下降的理念下“生物的指导”我们将其定义如在这里“为通过引导，并且为了在体内组织再生来实现编排细胞介质和因素窜特定生物事件的治疗方法。”“生物的指导代表了对组织工程和器官再生的当前思维的转变，但也可能代表了组织工程技术向临床转化的重要一步。

总之,我们在本原理实验,归纳新血管形成通过微观结构支架模式提供了一个新的潜在工程技术大cell-scaffold结构组织和器官再生,除了提供的能力促进整形外科手术通过自由组织转移。

缩写

PLGA：	聚-L-乙醇酸
PCL：	Poly-L-caprolactone
CAD：	计算机辅助设计
哈:	羟磷灰石
FDA：	熔融沉积造型
PBS：	磷酸盐缓冲溶液
硕士:	间充质干细胞
CT：	CT检查。

资助研究

这篇文章不需要任何资金来源。

财务信息披露

作者声明在研究过程中，他们没有任何经济利益或商业协会。

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