SCI 干细胞国际 1687-9678 0000-0002 圣人-辛达维获得研究 547247 10.4061 /五十四万七千二百四十七分之二千〇一十一 547247 研究文章 血管引导:诱导新生血管形成的微结构支架模式 穆勒 丹尼尔 1 詹 哈维 2、3 贝德 奥古斯丁 4 怀特曼 马修 5 的Schantz Jan-Thorsten 1、3 里 Zongjin 1 整形科 重建和Handsurgery KLINIKUM rechts伊萨尔河畔 慕尼黑工业大学，慕尼黑80333 德国 tum.de 2 整形外科 凯斯西储大学，美国俄亥俄州克里夫兰市44106 美国 case.edu 3. 整形外科和生物工程部 新加坡国立大学 新加坡 119077 nus.edu.sg 4 Zentrum酒店献给Stammzellbiologie UND Biotechnologie Universität大学莱比锡 德国 uni-leipzig.de 5 半岛医学院 埃克塞特大学 埃克塞特EX4 4QJ 联合王国 exeter.ac.uk 2011 27 09 2010 2011 04 08 2010 18 08 2010 2011 ©2011丹尼尔·穆勒等人。 这是知识共享署名许可，允许在任何媒体不受限制地使用，分发和复制下发布的开放式访问文章，提供原工作正确引用。

当前组织工程技术由血管形成和细胞支架构建体的灌注不足的限制。通过聚合物支架内仿生血管通道的微结构图案化可能诱导新血管形成，从而允许大工程化的构造制造。在患者的前 - 顶缺损内的血管通道的网络，从脑膜中动脉前支始发，使用计算机辅助设计（CAD）技术，并随后并入到聚己内酯被建模（PCL）支架使用熔融沉积制造成型（FDM）。骨髓来源的间充质干细胞（MSC）接种到支架和植入到大鼠模型中，与在血管网络的近端插入程度动静脉丛。3周后，将支架升高作为预制复合组织的聚合物片和使用显微外科技术传送。植的支架的组织学检查显示沿着图案化的信道，具有丰富的毛细管和整个实验支架结缔组织形成的血管向内生长，同时控制支架仅表现出肉芽组织。作为转移游离皮瓣预制的所有结构存活下来，并可行的。我们称这个概念“ 血管指导，通过脚手架中定制的通道引导新生血管形成。我们的技术有可能制造出比目前技术更大的组织工程结构，以及基于CT扫描数据和CAD技术的患者特定血管网络的定制结构。

 1.介绍

在临床移植组织工程技术的一个主要限制仍然是不充分的血管化，因此，细胞支架结构的灌注。在很多研究中使用聚合物支架在骨组织工程中,组织形成一直局限于区域立即下面的表面构造由于媒体灌注不良的细胞在支架的深处,导致受损的营养和生长因子,以及缺氧由于氧化不良。

早期对聚l -乙醇酸(PLGA)泡沫的研究发现，骨组织的穿透深度限制在190-220 μ从组织工程构建物的表面米[ 1]。利用生物反应器[后续策略 2]和材料的修改结合到羟基磷灰石的聚合物支架[ 3.]，穿透深度分别为3.7 mm和1.4 mm。随着新型仿生支架结构的使用，如模拟小梁骨[ 4，组织深度达到10毫米。最近，我们小组和其他人报道了熔融沉积建模(FDM)的使用，这是一种快速原型技术，用于设计具有完全互连的几何对称聚己内酯(PCL)支架，使骨组织形成贯穿整个细胞支架构造[ 5- - - - - - 7]。

虽然这些技术可能使组织形成贯穿于小聚合物支架的整个范围，但它们不足以确保大的组织工程结构的充分灌注，而这是绝大多数临床应用所需要的。这些例子包括颅骨骨瓣用于颅骨成形术，或工程长骨段替代肢体节段缺损。

我们以下的聚合物支架内的开放通道设计可能允许自然感应新血管形成，从而形成支架允许将其全部优良灌注假定微结构图案化通过创造仿生血管通道。其结果是，大型复杂工程细胞的支架的构建体可潜在地创建的，表示向临床应用的骨组织工程技术前进了一大步。对于我们的临床模型，我们选择了颅骨骨瓣模型。

 2.材料和方法 2.1。概念化和血管腔的设计

额顶叶骨瓣在一个显著颅骨缺损标准骨瓣结果升高（图 1(一))。骨瓣内部可见由中脑膜动脉形成的沟槽(图) 1 (b)），其在arborize分支图案灌注颅盖，具有前部和后部脑膜动脉在一起。由于所使用的计算机辅助设计（CAD）软件的限制，只有3因素可能被编辑的血管形成图案，其中包括支化的管之间的角度，通道直径，并且空间的设计。

(a)对接受右额顶骨切除术的患者进行基于计算机断层扫描的颅骨缺损三维重建。(b)在骨瓣内部可以观察到中脑膜动脉前支的分枝过程，为血管通道的设计提供模型。

通过脑膜中动脉的分枝格局的分析，我们得出一些规则和假设在我们的支架的脉管的设计。这些包括如下：通道的分支应该是45度左右的（1）角;(2) channel diameter was set at 1 mm due to mechanical constraints and ease of fabrication; (3) spacing between tubes was set at 1 mm. Spacing between capillaries in the human body has been reported to be 200  μm，毛细直径约50 μ米支架的制造用生理信道间隔的200  μm会导致机械强度降低，因此用1毫米管间距代替。Pro/ENGINEER软件(parameters technology corporation, Needham, MA)用于创建支架的CAD模型，包括血管通道。数字 2显示合成的CAD模型，用于制造血管通道与预测的血流模式。

设计的CAD模型的血管通道，随血流的预测模式。该模型预测有序血流以对称方式从源容器给远端近侧的通道前进。

 2.2。聚合物支架的制作

Poly-e-caprolactone (PCL) of molecular weight (Mn) 80,000 (Sigma-Aldrich) was used, together with hydroxyapatite (HA), in a 9 : 1 ratio. The PCL-HA scaffolds were fabricated using fused deposition modeling (FDM), a rapid prototyping process, as previously described [ 8]。在这项研究中，支架测量 18 × 18 × 3.  mm were fabricated with a filament laydown pattern of 0, 60, and 120 degrees, and a porosity of 70%. Figure 图3（a）示出了所制造的支架的顶视图，用红色标记表示分支血管通道（图 图3（b）)。数字 图3（c）shows the side view of the scaffold, with channel diameter of 1 mm.

根据颅内脑膜中动脉的走行路线，采用开放式通道设计，以分枝形式植入PCL支架。(一)顶视图。(b)红色斑纹表示血管通道分叉。(c)侧视图。

 2.3。细胞分离和支架的文化，制备

采用标准方法收集猪骨髓间充质干细胞[ 9]。使用细胞在通道2并维持在完全DMEM + GlutaMAX的I（GIBCO，USA）[10％ FBS + 1 %的钢笔/喉炎的症状)。培养基每周传代一次，每3天更换一次。

在细胞播种之前，用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)清洗支架，并用70%乙醇消毒。随后，用MSC-fibrin glue悬液接种支架。的密度 1 × 10 6 细胞最初悬浮在纤维蛋白原（TISSEEL，巴克斯特Biosciences公司，德国），然后均匀地接种到PCL支架。加入凝血酶以聚合该混合物，并创建一个纤维蛋白胶模拟细胞周围的细胞外基质。

 2.4。动物外科及组织学分析

A 2 cm incision was made in the right groin of adult male immunodeficient CBH-ruul/+ nude rats, following which the inferior epigastric artery and vein were dissected out and ligated en masse (Figure 图4（a）)。然后由此产生的血管蒂插入血管通道网络的实验支架的近端开口（其已与MSC预先接种）中并用4-0聚丙烯纺织纤维（爱惜康，沙莫维，NJ）（图固定 图4（b）)。然后支架被放置在腹股沟皮下的口袋里，伤口层层闭合。对照支架与实验支架在尺寸、材料和排列方式上相同，并以相同的密度植入间充质干细胞。然而，这些放置在对侧腹股沟没有结扎或植入上腹壁下蒂。动物( n = 5 ）中3周后处死，标本为外植用苏木精和曙红（H＆E）染色的组织学分析。

大鼠腹股沟血管引导研究模型。孤立和结扎上腹壁下血管。(b)将上腹壁下血管蒂插入近端出口进入血管通道网并缝合固定。

探讨预制支架在3周后经显微外科技术作为游离皮瓣移植的可行性 体内，部分移出标本( n = 3. ）提出了整块基于腹壁下血管的复合osteocutaneous-腹股沟支架瓣的一部分。然后将腹壁下动脉，用10-0的Prolene（爱惜康，沙莫维，NJ）通过端 - 侧技术来将颈总动脉的缝合线（图吻合 图5（a）），而腹壁下静脉吻合端 - 侧到颈内静脉。翼片是插入到大鼠的头皮（图 图5（b）)。

在大鼠腹股沟模型中的体内在3周后移植的支架转移作为复合组织聚合物的无翼片到颈部。（一）端至侧吻合腹壁下动脉到颈总动脉（白色标记）。腹壁下动静脉吻合也是在端 - 端时尚颈内静脉。（二）手术瓣插入之后。

动物的饲养和喂养是按照标准的动物护理协议进行的。该研究得到了新加坡国立大学动物福利委员会的批准，并得到了国立卫生研究院(NIH)的许可。 实验室动物的护理和使用指南。

 3.结果

H＆E染色实验支架的3周后植入显示该支架的微观树枝状图案下面的血管通道的血管形成（图 图6（a）），由结缔组织包围。此外，有一个在结缔组织的血管生成的证据，通过形成多个毛细管（图 图6（b）)。血管生成被看作整个结构，在整个结缔组织渗透。相反，对于该控制支架，仅观察到肉芽组织没有新生血管的证据（图 图6（c）)。

（A）实验支架在体内显示血管形成（红色，标有*）与周围结缔组织（蓝色区域）证据3周后移出。这些区域一起表示这是在PCL-HA支架内预制血管通道。清除领域占领了周围的PCL-HA支架纤维都标有“X”。（B）多毛细管（红色，标有*）也可见于结缔组织的区域，这表明广泛的新血管形成。（c）在相反，控制支架仅示出肉芽组织而不显著新血管形成的迹象。

将预制的复合组织聚合物腹股沟皮瓣移植到颈部后，经临床观察，灌注良好，毛细血管再充盈，动脉和静脉信号可多普勒。

 4.讨论

与卷超过几立方毫米不能由营养物质扩散生存但一块组织的需要必需的营养物质和氧[供给毛细血管生长 10]。相应的，当一个细胞大于150-200 μ当它来自血管时，就会遭受缺氧和其他营养物质的限制，因为这是它仅能通过扩散存活的最大距离[ 11]。组织工程进展到广泛的临床应用，因此，毛细血管的微血管网络的创建和支持大血管循环是大型复杂的组织和整个器官的支持必不可少灌注。

早期关于皮瓣预制的研究集中于通过分期微血管移植在组织块中诱导形成固有血管供应，以提高生存率[ 12, 13]。然而，关于二期移植术后静脉功能不全的报道以及这些手术的技术复杂性限制了预制游离皮瓣的广泛应用[ 14]。随后的努力更多地集中于实现血管化 体外模型。这些包括使用动静脉束，就像在这项研究中使用的;或形成动静脉袢，以形成血管网，以预先制作皮瓣[ 15, 16]。

在许多研究中，一个血管腔室被用来研究的组织形成诱导。在体内塑料腔室壳体聚（DL-乳酸 - 共 - 乙醇酸）（PLGA）的支架，血管化的组织的形成[的不同的实验上下文 17, 18或脂肪组织[ 19]诱导动静脉环的植入。器官图案化，如在肝器官架构用作肝脏辅助装置建模的实质腔室的制造，也有报道[ 20]。在这项研究中，计算模型被用来研究人类微血管的流动行为，随后一个概念装置被制造。最近，利用三维计算机断层扫描(CT)和CAD技术，利用背阔肌作为带血管的自由组织移植载体，预制用于自体下颌骨重建的骨性皮瓣[ 21]。

经由通过微结构的支架图案化定制的血管通道的制造进一步延伸了使用静脉束，通过使用计算分析和容器通道的CAD制造在一起，如在本研究中完成的，允许仿生支架的高度精确的制造潜在允许的大复合骨的聚合物或osteocutaneous聚合物襟翼预制。这些可以通过显微外科技术与在重建手术应用游离皮瓣转移。

虽然这项研究结果还是初步的，我们通过展示支架制造技术，感应新生血管是可以实现的。因此，这种技术，我们将称之为“ 血管指导，”新血管形成，从而通过在一个支架定制通道引导，可能潜在地允许大得多的组织工程化构建体的制造比目前的技术允许。我们的技术还允许定制支架与患者特异性血管网，允许基于CT扫描数据定制构建体制造的制造（图 7)。

定制支架设计使用计算机辅助设计（CAD）的基础上的三维CT数据的技术的特定于患者的血管网允许建模和定制构建体的制造。这里示出的CAD模型被定制为尺寸和颅骨缺损形状，并且还能够模拟血管网络中的缺陷。

在以往的研究中，我们定义的概念“ 细胞指导” [ 22, 23]，由此仿生环境是通过恒定递送细胞因子到植入支架的不同区域的创建的，以便允许细胞的位点特异性归巢总的目的 体内组织工程。这两种“ 血管指导”和“ 细胞指导"将属于"的概念 生物的指导”我们将其定义为“一种引导特定生物事件的治疗方法，通过指导和协调细胞介质和因子，以实现体内组织再生。””“ 生物指导”表示从目前的想法在组织工程和器官再生的转变，但将可能是朝着组织工程技术临床转化的重要一步。

总之，我们将展示在验证的原则，这个实验是通过显微结构支架图案感应新生血管提供了新的技术，为潜在工程的组织和器官再生的大型细胞支架结构，除了通过自由促进重建手术提供能力组织转移。

 缩略语 PLGA:

Poly-L-glycolic酸

 PCL：

聚L-己内酯

 CAD：

计算机辅助设计

 哈：

羟基磷灰石

 FDA：

熔融沉积成型

 PBS:

磷酸盐

 硕士:

间充质干细胞

 CT：

CT检查。

 资助为研究

本文并不需要资金的任何资源。

 财务公开

作者声明在研究过程中，他们没有任何经济利益或商业协会。

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