病毒和肿瘤特异性T细胞的优化制造

抽象的

虽然体外扩增T细胞目前广泛应用于临床前和临床试验，其制造的复杂性仍然是更广泛应用的主要障碍。在这篇综述中，我们讨论了目前的治疗方案体外描述我们在使用气体渗透静态培养瓶(G-Rex)进行生产优化的经验。这种创新的设备使生产过程发生了革命性的变化，使我们能够提高细胞产量，同时降低细胞操作的频率在体外文化时间。目前正在良好的制造业实践（GMP）设施，用于我们的机构临床细胞生产以及美国和全球的许多其他设施。

1.引入-T细胞转移

细胞疗法是生物技术的新但快速扩展的领域，涉及施用进行治疗效果的自体或同种异体细胞在活的有机体内。同种异体造血干细胞移植（HSCT）设定中的第一种采用T细胞转移方案基于供体外周血含有能够在HSCT受体中介导抗肿瘤和/或抗病毒活性的T细胞的前提。根据供体淋巴细胞输注（DLIS）已被广泛地用于提供抗肿瘤和抗病毒免疫。然而，与病毒和/或肿瘤特异性T细胞相比，相对高频率的聚集细胞导致移植物与宿主疾病（GVHD）的显着发生率，从而限制了这种方法的适用性。富含富含抗原特异性T细胞的富含抗原特异性T细胞，其对特定抗原的反应性可能会增加治疗性效力，同时降低了不希望的“脱靶”的效果或GVHD，并且该领域在过去的二十年中已经生长。本文侧重于生产在体外扩增的抗原特异性T细胞，讨论了T细胞产生的常规和当前技术，并概述了细胞生产技术的最新进展，这可能最终从精品施加朝向“护理标准”的精品施加。

输液体外扩大CTL

输注在体外扩增供体来源的病毒定向细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)靶向一种病毒(EBV)，两种病毒(EBV和腺病毒(Adv))，或三种病毒(EBV, Adv，巨细胞病毒(CMV))已被证明是安全、有效和保护的在活的有机体内［1- - - - - -4］．肿瘤抗原导向T细胞的过继转移也诱导了晚期淋巴瘤、黑色素瘤和鼻咽癌患者的客观肿瘤应答和完全缓解[5- - - - - -10.］．分子生物学技术的最新进展增加了人们对这种治疗方式的热情，因为(1)允许使用广泛的基因修饰T细胞，通过转移T细胞受体(TCRs)或嵌合抗原受体(CARs)赋予新的抗原特异性[11.- - - - - -14.]，（2）改善疗效细胞的归巢和增殖性质[15.，16.，(3)控制不需要的T细胞增殖或在活的有机体内活动 [12.，17.- - - - - -20.］．

尽管在体外扩增抗原特异性ctl已经产生了有希望的临床结果，有几个因素限制了这种方法的扩展超出研究领域。一个主要的实际限制是目前使用传统制造协议生产大量细胞的复杂性。然而，最近的一些进步简化了生产过程。

3.体外扩增抗原特异性T细胞

的体外抗原特异性T细胞的产生通常是通过重复体外刺激与专业或人工抗原呈递细胞（APC）的体外刺激来完成，该细胞（APC）在促进T细胞增殖的细胞因子存在下表达感兴趣的蛋白质或培养物，例如白细胞介素 -（IL-）2 [1，21，22］．这一过程导致T细胞针对刺激抗原/肽的扩增和富集，具有不期望特异性的细胞(如异体反应性T细胞)的频率相应降低(图)1）.一旦产生了足够的细胞(过继移植所需的)，在输注前将对其进行效力、纯度、特性和无菌性测试。

例如，可以扩展EBV特定的CTL体外在大多数血清阳性个体的外周血中，eb病毒特异性T细胞前体通常以高达1%的频率存在。传统上，通过1 × 10共培养制备富集的T细胞系⁶每厘米外周血单核细胞（PBMC）²gamma-irradiated (40 Gy)自体EBV-transformed lymphoblastoid细胞系(EBV-LCLs)在40:1比例(PBMC:拼箱)在总量/(组织培养处理24-well板)2毫升CTL增长媒体(RPMI 1640补充45%点击介质(欧文科学,加州圣安娜),2毫米GlutaMAX-I,和10%的边后卫)。第9 ~ 12天收获，计数，在新鲜培养基中重悬，以5 × 10重种⁶每厘米²4 d后用重组IL-2 (50 U/mL)灌胃。这最初的13- - - - - -在没有外源细胞因子的情况下，16天的培养期使存在于PBMCs中的少量ebv特异性T细胞具有增殖/生存优势，这些T细胞在EBV-LCL刺激下以自分泌的方式产生和使用IL-2。然而，在稍后的时间点，当培养物仅针对EBV时，可用细胞因子的水平变得有限，因此必须补充培养物，以确保CTL增殖得到充分支持[23］．随后每7天进行一次4:1 CTL:EBV-LCL比例的刺激，每周两次添加IL-2 (50 U/mL)。这体外持续进行ebv特异性T细胞的繁殖，直到产生足够的细胞用于低温保存和质量控制分析，包括HLA分型以确认身份、纯度和安全性测试。所有产品在输液放行前必须符合规定的放行标准。还可以对特定产品进行额外的分析，如评估转基因表达。例如，嵌合抗原受体- (CAR-)修饰ebv - ctl的释放标准之一是，至少15%的细胞必须表达转基因。尽管不同的组使用不同的CTL生成协议，即使是生成“相同”的产品，其组成部分/核心要求(抗原、APC和细胞因子)基本上是相同的。

4.传统在体外抗原特异性T细胞的培养

大量的制造方案已被描述在体外T细胞的扩张。少量悬浮细胞(<5 × 10)⁷）可以使用常规的多孔组织培养处理的板或烧瓶相对容易地繁殖。然而，当所需的电池数量超过单板或烧瓶的最大容量（例如，> 5×10⁷)这个平台操作起来既费时又麻烦。

细胞传播在体外受营养和氧气需求的限制(O₂)和代谢废物如乳酸和二氧化碳(CO₂）.传统培养皿中的细胞培养物限于使用每个表面区域单元的特定介质体积，即，每厘米应添加最多1mL培养基²由于这是允许气体扩散的。然而，这种浅媒体体积限制了介质的可用营养素和缓冲能力。另外，随着细胞数增加，o₂营养需求也在不断增加，因此必须定期给培养物喂食和重新播种。这些频繁的培养基变化和细胞操作是耗时和昂贵的，降低了细胞生产的再现性，并增加了污染的风险。

5.T细胞扩张的替代血管

克服与使用传统培养器进行放大有关的限制的一种方法是使用细胞生物反应器，该反应器提供机械摇动或搅拌以使介质充满气体。这种生物反应器的使用增加了细胞的膨胀，导致细胞密度比使用传统塑料器皿更高。

大量的生物反应器(中空纤维生物反应器、搅拌槽生物反应器和WAVE生物反应器)已经被探索用于扩增悬浮细胞，如活化的T细胞、基因修饰的T细胞或抗原特异性CTL [23- - - - - -27］．在这些生物反应器中，氧气是通过机械摇动或搅拌或泵气通过培养物提供的，而介质可以通过灌注交换。搅拌生物反应器允许极好的气体交换，并且可以相对容易地扩大规模。然而，与搅拌速率相关的剪切应力会对细胞活力产生不利影响，因此尚未被广泛采用[28］．相反，中空纤维生物反应器允许不断灌注培养物，从而在没有剪切应力的情况下稀释代谢物。然而，这种设备的可访问性使得有效地恢复扩展的细胞变得困难[24］．静态培养袋限制了达到的细胞密度（每个输入介质体积）。因此，大细胞数的产生需要使用大型媒体体积，得到获得最终产品所需的操纵频率的结果[29］．尽管WAVE生物反应器已经被有效地适应于原代T细胞的扩张，导致大量细胞的产生(10^15.)，培养袋不能放置在标准的培养箱中，必须在昂贵的定制设备中加热和摇晃[30.，31］．此外，通过常规测量氧气和乳酸的定期测量保持最佳细胞生长，并且需要蠕动泵将介质移入并输出袋中，所以需要掺入特殊过滤器以防止电池被泵损坏。此外，使用对照流量计通过培养物推进气体，这确保了培养渗透压。

虽然抗原非特异性T细胞培养物在这些各种生物反应器中成功生长，但抗原特异性T细胞对细胞对细胞接触具有严格的要求，并且已经证明难以始终适应移动培养物。因此，包括我们自己的许多团体发现，在使用2厘米实现的结果时难以改善²标准组织培养培养的井进行治疗的24孔板，这是突出概念研究所需的少量细胞的理想选择，但限制了超出学术级别超出了抗原特异性T细胞的疗法的翻译（数字2）.表格1展示了用于临床生产T细胞产品的每种培养容器的相对优缺点。

6.动态生物过程优化

大多数制造过程的问题是误解，即通过简单地使用线性比例模型可以通过大规模生产产品。在大多数情况下，考虑到生产协议是大多数情况，专业，高度复杂和复杂的情况，这根本不可行。克服这种扩展问题的一种方法是传统细胞疗法中的瓶颈，是在制造过程中纳入生物过程优化。这将最终铺平进入GMP的轻松过渡，并且几乎可以保证制造成功，从而积极影响临床研究的结果。这种生物过程优化（如图所示）3.）不应被认为是“验证阶段”，而是临床阶段和制造优化之间的动态相互作用，其寻求简化产品产生，同时确保细胞产品保持在小规模制造中实现的生物学特性。

7.我们的经历

在过去的4年里，我们在贝勒医学院的细胞和基因治疗中心(CAGT)进行了生产优化的一个例子，并得到了生产援助的支持细胞疗法（PACT）环绕着我们的搜索，以更简单，更快的策略，以扩大抗原特异性T细胞进行收养。传统上，我们的团体和其他人在2厘米中培养了病毒和肿瘤导向的T细胞²组织培养孔处理24孔板。这些T细胞通常繁殖8周或更长时间，以达到临床应用所需的细胞数量。然而，限制介质比(1 mL/cm)²)会限制营养物质的供应，而这些营养物质会被增殖的T细胞迅速消耗掉。随之产生的酸性pH值和废物迅速积聚阻碍了细胞的生长和生存。因此，细胞繁殖的唯一选择是频繁的补种和介质交换，这增加了操作的频率，同时也增加了污染的风险。因此，我们寻求优化我们的抗原特异性T细胞培养过程，这使我们评估了一种新型的细胞培养设备(气体渗透培养器(G-Rex))，由威尔逊狼制造、在哪个o₂和有限公司₂在烧瓶底部穿过硅胶膜。由于气体交换从下面发生，这允许上述培养基的深度增加，这提供了细胞所需的更多营养物，而废物稀释，因此不会产生不利影响细胞生长（图4）.

通过G-REX提供的这些最佳培养条件导致改善的细胞活力和增加的最终细胞系数而不增加细胞倍增的数量，并降低喂料频率和所需的操作数[32］．例如，对于使用G-REX的EBV-CTL扩展，我们共同培养1×10⁶每厘米PBMCS²使用G-Rex10(表面积10厘米²-总数1 × 10⁷以40:1的比例照射EBV-LCLs，最后体积为40 mL的CTL培养基。第9-12天，第二次刺激是去除20 mL培养基(从顶部抽吸)，并添加20 mL新鲜CTL培养基，其中含有辐照的ebv - lcl，以合适的细胞密度重悬，以4:1的比例刺激T细胞。第二次刺激后4天，直接向培养中加入50 U/mL的IL-2。一旦细胞膨胀到>5 × 10的密度⁶每厘米²细胞转移到G-Rex100(表面积100厘米)²)，用辐照EBV-LCL(4:1)在500ml培养基的最终体积中刺激。这些培养条件允许我们减少培养操作的频率，同时增加细胞输出(3 - 20倍)和缩短培养时间[32] （数字5）.我们证明，这种新的培养系统支持几乎任何类型的悬浮细胞的扩展，是gmp兼容的，并减少了技术人员干预的数量约4倍[32］．

该制造优化已被验证，转移到2009年的GMP工厂，现在用于所有CTL生产过程。从那时起，我们允许其他中心，包括NCI，交叉引用我们的IND，以便在美国及以外的其他GMP设施中使用这种细胞培养技术，而该平台目前用于生产许多细胞的生产包括活性T细胞，抗原特异性CTL，NK细胞，调节性T细胞和饲养细胞，包括EBV-LCLS和AK562 [32］．重要的是，G-Rex中的细胞培养也可以是线性的，这允许协议从小规模到大规模的简单过渡。我们最近使用了新的G-Rex600和G-Rex1000(表面积分别为600和1000厘米)进行了演示²，resp。），它可以产生高达6×10⁹1×10^10.分别在单个设备中的细胞。

8.第三方ctl

这些制造改进允许我们考虑在第三方环境中使用有特定的CTLS，最近我们开发了一个促进这一努力的细胞库。给予这种“现货物”产品提高了两个潜在的疑虑：（i）通过施用部分HLA失配的CTL产品和（II）有限的诱导GVHD的风险在活的有机体内由于受体对非共享HLA抗原的同种反应性。尽管如此，一些小型研究已经证明了该方法在HSCT或实体器官移植后产生的EBV淋巴瘤患者中的可行性。Haque及其同事使用第三方ebv特异性ctl治疗实体器官移植或SCT后的PTLD，在5周和6个月时分别显示了令人鼓舞的应答率为64%和52% [33］．本研究通过低分辨率分型筛选ctl，并对其进行高水平杀伤供体ebv - lcl和低水平杀伤PHA原细胞的筛选。HLA匹配水平从2/6到5/6不等，在6个月时匹配越紧密，结果越好，具有统计学意义。重要的是，在给予CTL后，没有患者出现GVHD。在另一份报告中，两名EBV淋巴瘤的脐带接受者接受了与之紧密匹配的EBV特异性T细胞，导致其病变完全消除[34］．

目前，我们正在评估使用“现成”Trivirus CTL的安全性和效力，用于治疗HSCT患者的CMV，腺病毒或E​​BV感染，随着活性感染，不响应常规治疗。初步结果> 35个受试者，大多数人接受替代供体移植，正在令人鼓舞，毒性最小，达到齐全或部分反应。如果这一趋势继续，我们将产生一个更大的CTL银行，以尽可能多的种族群体涵盖，并进入II期临床试验，我们可以向CTL的持久性和功能提出更具体的问题在活的有机体内．这种研究取决于产生大量CTL的能力，这些CTL保持其特异性和功能活动，并且不会过度“耗尽”在体外传递，这只能在最近在G-rex Cultureware中获得优化的文化协议的出现，有效支持CTL扩张。

9.未来的前景

生产优化产生于对生产细胞产品所涉及的不同过程的持续和批判性的反思。G-Rex培养设备只是在CAGT进行生产优化的一个例子。我们最近还简化了病毒特异性CTL的产生过程，用临床级质粒和重叠肽库替换病毒载体和活病毒(以前用作抗原来源)[35］．我们还发现某些增强和刺激细胞因子的组合支持病毒和肿瘤反应性ctl的有效激活和扩展，导致新的gmp兼容协议，使高质量细胞产品的快速生成成为可能。虽然制造优化是一个研究阶段，需要时间、金钱和精力，但这是一项投资，是细胞产品制造成功的先决条件。最终，细胞产品的最终“价值”取决于在活的有机体内治疗效果;然而，它是促进或抑制这些产品的演变，从精品课程到主流。

缩写

adv：	腺病毒
APC:	抗原呈递细胞
汽车:	嵌合抗原受体
巨细胞病毒:	巨细胞病毒
CTL：	细胞毒性T淋巴细胞
DLI：	供体淋巴细胞输注
EBV:	巴尔病毒
的边后卫:	胎牛血清
GVHD：	移植物抗宿主病
HSCT:	造血干细胞移植
IL：	白介素
拼箱:	Lymphoblastoid细胞系
协议:	生产援助细胞疗法
PBMC:	外周血单个核细胞
识别:	T细胞受体。

致谢

作者感谢Darrell P. Page的摄影工作和PACT NHLBI的资助。J. F. Vera博士是Wilson Wolf Manufacturing的科学顾问。

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