SCI 干细胞国际 1687 - 9678 SAGE-Hindawi访问研究 434392年 10.4061 / 2011/434392 434392年 评论文章 优化制造病毒和肿瘤特异性的T细胞 Lapteva 纳塔莉亚 维拉 胡安·F。 阶段 安娜丽塔 1 细胞和基因治疗中心 贝勒大学医学院 休斯顿 TX77030 美国 bcm.edu 2011年 23 8 2011年 2011年 26 04 2011年 20. 06 2011年 2011年 版权©2011 Natalia Lapteva和胡安·f·维拉。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

虽然 体外扩大T细胞目前广泛应用于临床前和临床试验、制造的复杂性仍然是一个广泛应用的主要障碍。在本文我们将讨论当前的协议 体外扩张的病毒和肿瘤特异性T细胞和描述我们的经验在生产优化使用透气型静态培养瓶(G-Rex)。这种创新的设备已经彻底改变了生产过程通过允许我们增加细胞产量,同时减少细胞操作的频率 在体外文化的时间。现在被用于良好生产规范(GMP)为临床细胞生产设施在我们机构以及许多其他在美国和全世界。

 1。Introduction-T细胞转移

细胞疗法是一种新的但迅速扩大在生物技术领域涉及政府的自体或同种异体细胞进行治疗效果 在活的有机体内,第一个T细胞过继转移协议同种异体造血干细胞移植(HSCT)设置是基于这样一个前提:供者外周血中T细胞能够调节抗肿瘤和/或HSCT受者的抗病毒活性。因此,供体淋巴细胞注入(DLIs)被广泛用于提供抗肿瘤和抗病毒免疫。然而,alloreactive细胞与病毒的相对较高的频率,和/或肿瘤特异性T细胞导致移植物抗宿主病(GvHD)的发生率,从而限制了该方法的适用性。注入丰富抗原T细胞的反应性与一个特定的抗原可能增加治疗效果而减少不受欢迎的“偏离”效应或移植物抗宿主病,和这一领域的增长在过去的二十年里。本文关注的生产 在体外扩大抗原T细胞,讨论了T细胞一代,传统和当前技术,并概述了最近的电池生产技术的进步,最终可能移动这个治疗方法从精品应用程序向“标准”。

 2。注入体外<斜体>,< /斜体>扩展CTL

的注入 在体外扩大donor-derived virus-directed细胞毒性T淋巴细胞(ctl)瞄准一个(eb病毒(EBV)),两个(巴尔病毒和腺病毒(副词)),或三个病毒(EBV,副词,巨细胞病毒(CMV))已被证明是安全的,有效的,和保护 在活的有机体内( 1- - - - - - 4]。肿瘤的过继转移antigen-directed T细胞也诱导肿瘤客观反应和晚期患者的完全缓解淋巴瘤、黑色素瘤、鼻咽癌( 5- - - - - - 10]。近年来分子生物学技术的进步增加了对这种治疗方法(1)允许基因改造的T细胞广泛的基因转移带来新的抗原特异性的T细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(汽车) 11- - - - - - 14),(2)提高自导和增殖的效应细胞的性质 15, 16),和(3)控制不必要的T细胞增殖或 在活的有机体内活动( 12, 17- - - - - - 20.]。

尽管管理 在体外扩大抗原特异ctl产生了有前途的临床结果,有几个因素限制了这种方法的扩展超出了研究领域。主要实际约束是当前复杂性与大量的细胞使用传统的生产制造协议。然而,一些最近的进步流线型的生产过程。

 3所示。< /斜体> <斜体>体外抗原T细胞的扩张

的 体外代的抗原T细胞通常是通过重复体外刺激与专业或人工抗原呈递细胞(apc),表达的蛋白质或肽的兴趣和文化存在细胞因子促进T细胞增殖,如白介素- 2 (IL) ( 1, 21, 22]。这个过程导致的放大和浓缩针对刺激T细胞抗原/肽与相应的减少细胞的频率与alloreactive等不受欢迎的特异性T细胞(图 1)。一旦足够的细胞生成(过继转移所需),然后测试效力,纯洁,输液前身份、不育。

抗原特异ctl的频率增加 在体外刺激。(一)说明了抗原特异ctl的低频率出现在抗原刺激后外周血和随后的浓缩。(b)的浓缩QAKWRLQTL (HLA-B8-restricted EBV抗原决定基-)在血清反应阳性的供体特异性T细胞所评估的四聚物分析。(c)说明了逆相关性抗原频率和alloreactive外周血T细胞(左)和体外扩大ctl(右)。

例如,EBV-specific ctl可以扩展 体外从EBV-specific T细胞前体通常出现在一个频率高达1%的大多数的外周血血清反应阳性的个体。传统上,丰富T细胞系由coculturing 1×106外周血单核细胞(PBMCs)厘米2gamma-irradiated (40 Gy)自体EBV-transformed lymphoblastoid细胞系(EBV-LCLs)在40:1比例(PBMC:拼箱)在总量/(组织培养处理24-well板)2毫升CTL增长媒体(RPMI 1640补充45%点击介质(欧文科学,加州圣安娜),2毫米GlutaMAX-I,和10%的边后卫)。天9到12 ctl是收获,统计,resuspended的新媒体,在5×10补种6每厘米2总量的2毫升的CTL媒体,然后再辅以重组(50 U /毫升)4 - 2天后。这最初的13 - - - - - -为期16天的文化时期没有外源性细胞因子给增殖/小种群的生存优势EBV-specific T细胞存在于PBMCs,生产和使用以自分泌的方式- 2在与EBV-LCL刺激。然而,在后来的时间点,当文化专门EBV特定可用的细胞因子的水平成为限制,因此文化必须补充确保充分支持(细胞毒性t淋巴细胞增殖 23]。后续执行刺激每7天使用4:1 CTL: EBV-LCL比每周有两次(50 U /毫升)- 2。这 体外传播EBV-specific T细胞一直持续到足够的细胞生成等低温贮藏和质量控制分析HLA打字来确认身份,纯洁,和安全测试。所有产品必须符合指定的发布标准发布之前注入。额外的分析在特定的产品,如评估转基因表达的也会被执行。例如,发布chimeric-antigen-receptor标准之一——(汽车)修改EBV-CTLs是至少15%的细胞必须表达转基因。尽管有不同的细胞毒性t淋巴细胞生成不同群体所使用的协议,甚至一代的“相同”的产品,零部件/核心需求(APC,抗原和细胞因子)本质上是相同的。

 4所示。传统的体外<斜体> < /斜体>抗原T细胞的文化

各种各样的生产协议描述了 在体外T细胞的扩张。少量悬浮细胞(< 5×107)可以相对轻松地使用传统的多井传播组织培养处理板或烧瓶。然而,当所需的细胞数量超过一个板或瓶的最大容量(例如,> 5×107)这个平台变得费时和繁琐的操作。

细胞繁殖 在体外受限于要求营养和氧气(O2)和乳酸等代谢废物的积累和二氧化碳(有限公司2)。细胞培养在传统cultureware仅限于特定媒体的使用体积/表面积单位,也就是说,最多1毫升媒体应该添加/厘米2因为这是宽容的气体扩散。然而,这种浅媒体音量限制两个可用的营养和媒体的缓冲能力。此外,随着细胞数量增加,O2和营养需求逐步增加,因此文化必须定期美联储和补种。这些频繁的媒介的变化和细胞操作费时又费钱,减少细胞生产的再现性,增加了污染的风险。

 5。替代T细胞扩张的血管

克服局限性的一种方法与使用传统cultureware扩大是利用细胞生物反应器,为机械摇动或搅拌散布媒体提供天然气。这种生物反应器的使用增加细胞扩张,导致更高的细胞密度,达到使用传统plasticware之外。

大量的生物反应器(中空纤维生物反应器、搅拌釜生物反应器和波生物反应器)探讨了悬浮细胞的扩张等激活T细胞,转基因T细胞,或抗原特异CTL [ 23- - - - - - 27]。在这些生物反应器氧是由机械摇动或搅拌或通过文化注入气体,而由灌注可以交换的媒介。搅拌生物反应器使优秀的气体交换,可以扩大相对容易。然而,剪切应力与搅拌速度相关的细胞生存能力造成不利影响,因此它没有被广泛适应( 28]。相比之下,中空纤维生物反应器允许文化的不断灌注,从而稀释代谢物没有剪切应力。然而,这个设备的可访问性,很难有效地恢复扩大细胞( 24]。静态文化袋限制了细胞密度(每输入媒体音量)。因此,大细胞数量的一代需要大量媒体的使用与操作要求的频率合成增加获得最终产品( 29日]。尽管波生物反应器已经有效地用于原发性T细胞的扩张,导致生成大量的细胞(1015包),文化不能适应在一个标准的孵化器,必须加热和在一个昂贵的,定制的设备( 30., 31日]。此外,优化细胞生长是由常规测量氧气和乳酸和蠕动泵需要移动介质的包,需要的特殊过滤器以防止细胞受损的泵。此外,气体通过文化推动使用控制流量计确保文化渗透性。

虽然抗原特异性的T细胞培养了一些成功在这些各种各样的生物反应器,细胞间接触抗原T细胞有严格的要求和已被证明难以适应移动文化。因此许多团体,包括我们自己,都发现很难改进成果使用2厘米2井的标准组织culture-treated 24-well盘子,适合少量细胞的扩张所需的临床前和概念验证研究但限制抗原特异的翻译T-cell-based疗法超出了学术水平(图 2)。表 1显示了相对的优势和劣势与每个文化的关联船已被用于生产T细胞产品的临床应用。

适用性和属性不同文化的T细胞扩张的血管。

细胞培养器皿 气体交换 体积的媒体 细胞浓度 缺点 优势
多井板/烧瓶(静态文化) 有限的 有限的:低比表面积的媒介 低 高污染的风险 适合小规模生产细胞
广泛的处理时间
频繁的干预措施
不是可伸缩
透气型袋(静态文化) 好 有限的:低比表面积的媒介 媒介 低输出每包需要持续维护文化 不育的封闭系统
有限的微观细胞检查
不是线性可扩展性从研发到生产
G-Rex(透气型静态文化) 优秀的 无限制:高介质比表面积 高 有限的微观细胞检查 优秀的啊2交换
线性可扩展性从研发到大规模生产
显著降低文化操纵
与封闭系统兼容
波浪作用的生物反应器 有限公司 2 / O 2 曝气和pH值控制器(动态文化) 好 无限制:高介质能力在每个袋子里 高 复杂的,昂贵的,需要特殊设备。 优秀的啊2交换收益率大细胞数量
不适合coculture CTL生产阶段
文化需要不断的维护。有限的微观细胞检查 封闭的系统
不是线性可扩展性从研发到大规模生产

增加成本和过程的复杂性与大规模电池需求。说明了多井盘子或烧瓶非常适合少量抗原特异ctl的扩张(< 5×107)。然而,这个系统变得无效的大量细胞的扩张。细胞生物反应器相比非常适合生产大细胞数量,但这个平台很难适应,需要专门的设备。

 6。动态生物过程优化

大多数生产过程的问题是产品的误解可以大规模生产,只需使用一个线性扩大模型。在大多数情况下这是不可行,因为生产协议,在大多数情况下,专业、高度复杂的,复杂的。克服这种扩大问题的一种方法,这是一个瓶颈在常规细胞疗法,是将生物过程优化的制造过程。最终将为一个简单的过渡到GMP,几乎可以保证制造业的成功,从而积极影响临床研究的结果。这种生物工艺优化(如图 3)不应被视为一个“验证阶段”,而是一个动态的相互作用的临床前阶段和生产优化,旨在简化产品的一代,同时确保细胞产品维护生物属性实现小规模生产。

动态生物过程优化。这之间的动态交互优化和临床前阶段允许简单的细胞产品过渡到cGMP的。

 7所示。我们的经验

生产优化的一个例子,我们在过去4年进行细胞和基因治疗中心的贝勒医学院(CAGT)生产的援助和支持 细胞疗法(协议)包围着我们的搜索更简单、更快速的策略来扩大抗原T细胞过继转移。传统上我们组和其他人有讲究的病毒——和tumor-directed T细胞在2厘米2井的组织培养处理24-well盘子。这些T细胞通常是8周或更长时间传播实现临床应用所需的细胞数量。然而,限制媒体比率(1毫升/厘米2)与气体扩散限制的供应营养,迅速被T细胞增殖。顺向酸性pH值和废物积聚迅速阻碍细胞生长和生存。因此,细胞传播的唯一选择是频繁的重播和介质交换从而增加所需的操作频率与相应增加污染的风险。因此,我们试图优化抗原T细胞培养过程导致我们评估一种新的细胞培养装置(透气型cultureware (G-Rex)),开发的 威尔逊狼制造、而阿2和有限公司2交换在硅胶膜瓶的底部。因为气体交换发生从下面这允许增加深度中等以上,它提供了更多的营养所需的细胞废物被稀释,从而不影响细胞生长(图 4)。

G-Rex文化设备。(一个)显示有限的气体交换发生在传统cultureware,这限制了媒体的体积,因此可用的营养。相比之下G-Rex提供气体交换从瓶的底部允许将细胞培养卓越的媒体与面积的比例。(b)显示了G-Rex10表面面积10厘米2和体积容量40毫升,G-Rex100表面积为100厘米2的体积容量500毫升,G-Rex1000表面积为1000厘米2的体积容量5000毫升。

这些G-Rex提供的最优培养条件导致改善细胞生存能力和提高最终细胞数量没有增加细胞的数量倍增,和减少喂养频率和所需的操作数( 32]。例如,对于扩大EBV-CTLs使用G-Rex我们培养1×106PBMCs每厘米2使用G-Rex10(10厘米的表面积2总1×107PBMCs) gamma-irradiated (40 Gy) EBV-LCLs 40: 1比例在最后一卷40毫升的CTL的媒介。在9 - 12第二个刺激是由删除20毫升的媒体(从顶部吸气)和添加20毫升的新鲜细胞毒性T淋巴细胞中含有辐照EBV-LCLs resuspended在细胞密度适当刺激T细胞比例4:1。四天之后第二个刺激50 U /毫升- 2是直接添加到文化。一旦细胞已经扩展到一个密度> 5×106每厘米2细胞转移到G-Rex100(面积100厘米2)和受激辐射EBV-LCL(4: 1)在最后一卷500毫升的媒体。这些文化条件允许我们减少文化操纵,同时增加细胞的频率输出(3-20-fold)文化和缩短时间 32)(图 5)。我们证明了这部小说文化系统支持几乎所有类型的悬浮细胞的扩张,是GMP-compliant,减少了技术员干预(约4倍的数量 32]。

优化抗原特异CTL生产减少干预的数量,同时增加细胞的输出。(a)展示了程度的复杂性与抗原特异ctl的生成使用常规24-well盘子和减少数量的干预时需要使用G-Rex复制相同的协议。(b)显示的实现G-Rex设备减少 在体外文化与传统方法相比的时候。

这个生产优化进行验证,转移到我们的GMP设备在2009年和现在使用我们所有的CTL生产流程。从那时起我们允许其他中心,包括NCI,交叉引用我们的印第安纳州,使这种细胞培养技术的使用在其他GMP设备在美国,这个平台是目前用于生产大量细胞产品包括激活T细胞抗原特异ctl, NK细胞,调节性T细胞,馈线细胞包括EBV-LCLs和aK562 [ 32]。重要的是,细胞培养在G-Rex也可以线性扩展,允许一个简单的过渡协议从小型到大型规模。我们最近演示了使用新的G-Rex600和G-Rex1000(表面面积600和1000厘米2、职责),可以产生高达6×1091×1010细胞,分别在一个单一的设备。

 8。第三方ctl

这些制造改进允许我们考虑使用第三方特异性ctl的设置,最近我们开发了一种细胞银行推动这项努力。政府的“现成的”产品提出了两个潜在的问题:(i)诱导移植物抗宿主病的风险管理部分HLA-mismatched CTL产品和(二)有限公司 在活的有机体内持久性,由于收件人alloreactivity针对非公用HLA抗原。不过一些小的研究已经证明了这种方法的可行性在患者EBV淋巴瘤HSCT或实体器官移植后出现。Haque和他的同事使用第三方EBV-specific ctl治疗PTLD实体器官移植后或SCT,显示一个令人鼓舞的响应率为64%和52%在5周和6个月,分别为( 33]。在这项研究中ctl选择由低分辨率输入和筛查高级杀害捐赠EBV-LCLs和低级杀害病人PHA爆炸。HLA匹配的水平范围从2/6到5/6抗原,并有一个显著的趋势紧密匹配在6个月的更好的结果。重要的是,没有病人发达CTL政府后移植物抗宿主病。在另一份报告两个绳与EBV淋巴瘤收件人收到密切匹配EBV-specific T细胞导致完整的决议的病变( 34]。

目前我们正在评估使用“现成的”的安全性和效力trivirus CTL治疗巨细胞病毒,腺病毒,或EBV感染与活跃HSCT后感染的病人,不应对常规治疗。初步结果> 35人,其中多数人收到替代供体移植,是鼓舞人心的,以最小的毒性和> 80%实现完全或部分反应。如果这一趋势继续下去,我们将生成一个大的CTL银行覆盖尽可能多的种族和进步II期临床试验,我们可以问更具体的持久性和细胞毒性t淋巴细胞功能相关的问题 在活的有机体内。这样的研究依赖于生产大量的能力维持其特异性的ctl和功能活动和不被过度“精疲力尽” 在体外使,这已成为可能最近才随着优化文化协议G-Rex cultureware有效支持CTL扩张。

 9。未来前景

生产优化起源于常数和批判性反思不同的过程参与细胞的生成产品。G-Rex文化设备制造优化只是一个例子发生在CAGT。我们最近也简化了过程取代病毒载体和特异性CTL的活病毒(以前用作抗原来源)与临床级质粒和重叠的肽库( 35]。我们还发现,某些组合的增强和刺激细胞因子支持有效激活和扩张的病毒tumor-reactive ctl,导致新GMP-compliant协议,使细胞的快速生成高质量的产品。虽然生产优化是一个研究阶段,需要时间,金钱和精力,这是一个投资和细胞产品的制造成功的一个先决条件。最终,最后“价值”的产品取决于细胞 在活的有机体内治疗效果;然而,它是制造过程,促进或抑制此类产品的进化从精品主流。

 缩写 阿德:

腺病毒

 APC:

抗原呈递细胞

 汽车:

嵌合抗原受体

 巨细胞病毒:

巨细胞病毒

 细胞毒性t淋巴细胞:

细胞毒性T淋巴细胞

 DLI:

供者淋巴细胞注入

 EBV:

巴尔病毒

 的边后卫:

胎牛血清

 移植物抗宿主病:

移植物抗宿主病

 HSCT:

造血干细胞移植

 IL:

白介素

 拼箱:

Lymphoblastoid细胞系

 协议:

生产援助 细胞疗法

 PBMC:

外周血单核细胞

 识别:

T细胞受体。

 确认

作者感谢达雷尔p .页面的摄影作品和协议NHLBI资金。威尔逊博士j·f·维拉是一种科学顾问狼制造。

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