干细胞国际gydF4y2Ba
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干细胞国际gydF4y2Ba/gydF4y2Ba2011gydF4y2Ba/gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba

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体积gydF4y2Ba 2011gydF4y2Ba |gydF4y2Ba文章的IDgydF4y2Ba 429187gydF4y2Ba |gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 页面gydF4y2Ba |gydF4y2Ba https://doi.org/10.4061/2011/429187gydF4y2Ba

葡萄糖、血清和三维细胞培养在骨髓间充质干细胞代谢中的作用gydF4y2Ba

拜伦DeorosangydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba 埃里克·a·NaumangydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba

1gydF4y2Ba美国普渡大学韦尔登生物医学工程学院，普渡购物中心585号，西拉法叶，邮编47907-2088gydF4y2Ba

2gydF4y2Ba美国普渡大学机械工程学院，普渡购物中心585号，西拉斐特，邮编47907-2088gydF4y2Ba

3.gydF4y2Ba普渡大学基础医学系，585普渡商场，西拉斐特，47907-2088，美国gydF4y2Ba

学术编辑器:gydF4y2Ba肯尼斯·r·BohelergydF4y2Ba
收到了gydF4y2Ba 2010年12月03gydF4y2Ba
接受gydF4y2Ba 2011年2月7日gydF4y2Ba
发表gydF4y2Ba 05年4月2011年gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

间充质干细胞（MSCs）已成为组织工程各个方面的重要补充。而大多数gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba研究主要集中在细胞在二维培养中的行为，而对细胞在三维培养中的行为，尤其是代谢状态的了解相对较少。为了评估二维培养过程中间充质干细胞的代谢，我们使用12种不同的培养基组成，不同浓度的葡萄糖和胎牛血清(FBS)培养小鼠骨髓间充质干细胞1周。结果表明，葡萄糖浓度是维持细胞生长和活力的重要因素。为了评估三维培养过程中的代谢状态，采用两种不同的培养基组成和两种不同浓度的胶原凝胶基质培养MSCs 1周。培养基的组成只随葡萄糖浓度而变化。结果表明，葡萄糖和细胞外基质是影响细胞代谢反应的重要因素。然而，在低密度胶原中培养的细胞表现出相当大的细胞死亡，可能是由于胶原水凝胶的物理收缩，而在高密度胶原中没有观察到这种收缩。这些发现将有助于……的发展gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba细胞培养模型正确地模拟gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba生理过程。gydF4y2Ba

1.介绍gydF4y2Ba

组织工程综合应用工程学和生物学原理来研究、设计、开发和修复生物结构。这是一个迭代的、客观驱动的过程，刺激了人造皮肤的生产[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba使平滑肌组织的发展取得了进展[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba、人造血管[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，心脏组织类似物[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]、肾小管[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba、肠段[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，膀胱代用品[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba18gydF4y2Ba和骨组织支架[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］.这些组织工程疗法的长期成功需要它们与宿主组织的生物相容性和植入组织内功能分化细胞的发育。干细胞对这些应用非常重要，因为它们能够分化成不同类型的细胞。gydF4y2Ba

与胚胎干细胞相比，骨髓间充质干细胞(MSCs)获得争议较少，且更容易控制[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］.但是，为了分化成特定的细胞类型，所有的干细胞都必须受到各种环境因素的影响。迄今为止，控制干细胞分化最常用的方法是利用MSCs的自然能力来实现生理相关的因子蛋白和分子线索。这一过程导致了肝脏修复的进展[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，胰岛细胞再生[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，骨增强术[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba37gydF4y2Ba和脊髓再生[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba

虽然这些进展对该领域具有重要意义，但目前的研究缺乏关于MSCs的三维培养、它们的代谢状态，以及这两方面的考虑如何影响它们的最终分化。与二维培养相比，考虑细胞在三维培养中如何作出反应是很重要的，因为已经证明，细胞外基质相互作用导致许多不同的细胞反应，与分化、增殖、生长、运动和基因表达有关[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］.此外，由于有氧代谢和厌氧代谢是细胞获取能量的主要方式，而且有氧产生的能量比厌氧产生的能量多得多，有理由认为，细胞所经历的普遍代谢状态将对干细胞的最终分化产生重大影响。有证据表明，代谢状态可以影响蛋白质激活和蛋白质构象[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]在细胞分化过程中，两者都是至关重要的。这也可能影响生长因子和其他刺激物在体内诱导预期结果的能力。gydF4y2Ba

因此，这一系列实验的整体动机是调查响应于在这两个二维和三维培养条件在葡萄糖和胎牛血清（FBS）的浓度变化在培养的MSC的代谢状态。gydF4y2Ba

2.材料和方法gydF4y2Ba

２.１.的二维细胞培养gydF4y2Ba

小鼠骨髓间充质干细胞（ATCC编号CRL-12424）用于这些实验（ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。骨髓间充质干细胞在由无谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（90-113-PB，Mediatech，Herndon，VA）和补充有10%FBS（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen）、1%青霉素链霉素（10%）组成的维持培养基中培养 mg/mL，美国密苏里州圣路易斯市西格玛·奥尔德里奇）和0.1%两性霉素B（250 gydF4y2Ba g/mL，密苏里州圣路易斯市西格玛·奥尔德里奇）。该培养基中的葡萄糖浓度为25.0 通过添加D-葡萄糖（4912，美国新泽西州菲利普斯堡Mallinckrodt）。骨髓间充质干细胞以1.5×10的密度接种在6孔板或24孔板（美国加利福尼亚州圣何塞BD Biosciences）中gydF4y2Ba4gydF4y2Ba/厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．6孔板用于测定代谢测定的样品，24孔板用于获得整个实验中不同天数的细胞数量。在这个密度下，细胞在播种时几乎是融合在一起的，以便在实验过程中尽量减少细胞增殖。细胞播种后，在6孔板和24孔板的孔中分别填充2.4 mL和0.5 mL维持培养基，使两种板型的培养基高度相同。播种后，细胞附着并稳定12小时。这个十二小时周期的直接结论相当于“第0天”。这项研究总共持续了六天。本部分研究使用了12个实验介质组，对应于12种葡萄糖浓度(0.5 mM, 1.0 mM, 5.0 mM, 25.0 mM)和血清浓度(2%，5%，或10%)的组合。除丙酮酸组(见下文)外，每组12个样品。随后，在第4天和第6天获得1.0 mL培养基样品，用于葡萄糖、乳酸和丙酮酸的分析。 Cell number was measured on days 0, 2, 4, and 6. Medium was refreshed in wells that were not analyzed on that particular experimental day.

２.２.三维细胞培养gydF4y2Ba

圆形胶原凝胶，面积为2.0 厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba高度0.5 mm作为三维支架进行MSCs培养。从猪肌腱中提取胶原蛋白，置于0.5 M醋酸中(Mallinckrodt Baker, phillips, NJ)。用2.0 M氢氧化钠(NaOH)中和酸溶性胶原蛋白(Mallinkrodt Baker, phillips, NJ)。在24孔板中制备5.0 mg/mL高密度凝胶和2.5 mg/mL低密度凝胶。每一种凝胶都是用100gydF4y2Ba L胶原溶液，每个含有250000个MSC。这部分研究中使用了四个实验组，对应于两种葡萄糖浓度（0.5 毫米和25.0毫米 mM）和最终胶原蛋白浓度（2.5 mg/mL和5.0 mg/mL）组合。每组12个样本。每例患者的血清浓度为5%。对于每个介质组合，体积为0.5 24孔板中的每一孔使用mL。随后，在第4天和第6天收集培养基，以确定葡萄糖和乳酸的特性。在第0、2、4和6天测量细胞数量。gydF4y2Ba

2．3.细胞群gydF4y2Ba

24孔板用于测定二维和三维培养的细胞数量。简单地说，在DMEM中加入Hoechst染料(Invitrogen, Carlsbad, california, USA)，最终浓度为5.0gydF4y2Ba 克/毫升。一个100gydF4y2Ba 将L体积的Hoechst溶液添加到24孔板的每孔中。随后，将极板置于37°C, 5% CO中gydF4y2Ba2gydF4y2Ba保温15分钟。在激发波长为355 nm的荧光计(热电子，芬兰)中读取每个极板，在460 nm处测量辐射。背景测量采用无细胞空孔进行二维培养或无细胞凝胶进行三维培养。荧光计读数，结合实验确定的校准曲线，用于计算每个孔内的细胞种群。gydF4y2Ba

２.４.细胞生存能力gydF4y2Ba

用于评估细胞群中相同的24孔板用于定性观察细胞活力使用荧光成像。简单地说，这两种钙黄绿素-AM和溴化乙锭（Fluka公司，圣路易斯，MO）加入到DMEM为2.5的终浓度  M. Calcein-AM在494 nm激发下发出517 nm光表示活细胞，溴化乙锭在528 nm激发下发出617 nm光表示死细胞。一个100gydF4y2Ba 将L体积的溶液加到24孔板的每孔中。随后，将极板置于37°C, 5% CO中gydF4y2Ba2gydF4y2Ba保温15分钟。使用IX71荧光显微镜(Olympus, Center Valley, Pa, USA)上的10倍和40倍放大镜观察井，使用QColor 5相机(Olympus, Center Valley, Pa)和QCapture Pro 5.0.1.26软件(QImaging, Surrey, BC, Canada)拍摄TIFF图像。TIFF图像使用Irfanview版本4.25软件转换为位图图像(Irfan Skiljan, 2009)，然后使用Artweaver版本0.3.9.9软件合并(Boris Eyrich, 2005)。gydF4y2Ba

2．5．葡萄糖测定gydF4y2Ba

使用荧光测定试剂盒(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA)检测培养基样品的葡萄糖浓度。该试剂盒通过激活荧光再间苯二酚来表明葡萄糖的存在，再间苯二酚的吸收最大值在571 nm，发射最大值在585 nm。样品用去离子水稀释，使葡萄糖浓度在试剂盒的最佳检测范围3.0之间gydF4y2Ba M和50.0gydF4y2Ba M.荧光测量使用荧光计，激发在530 nm，发射检测在590 nm。背景测量采用无糖DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA)。使用校准曲线将发射值转换为葡萄糖浓度。然后，将这些浓度乘以稀释因子，得到每个细胞外样本内的葡萄糖浓度。由此产生的浓度从原始生长培养基的实际起始葡萄糖浓度中减去，得到葡萄糖消耗量。gydF4y2Ba

2.6. 乳酸测定gydF4y2Ba

使用分光光度分析试剂盒(荷兰仪器公司)检测培养基样品的乳酸浓度。该试剂盒通过在340 nm处检测还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的吸光度的增加来测定乳酸浓度，表明样品中最初存在的乳酸量。用分光光度计(Thermo Electron, Finland)测量340 nm处的NAD吸光度。细胞外样品用等量的去离子水稀释，使乳酸浓度在试剂盒的最佳检测范围0.22 mM至13.32 mM之间。细胞外样本的背景测量使用普通DMEM。这些本底测量值从它们各自的吸收测量值中减去。背景扣除测量转换为使用校准曲线乳酸浓度。gydF4y2Ba

2.7。丙酮酸测定gydF4y2Ba

使用分光光度分析试剂盒（荷兰Instruchemie）对细胞外和细胞内样本进行丙酮酸浓度测试。该试剂盒通过检测氧化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸吸光度的降低来确定丙酮酸的浓度gydF4y2Ba（gydF4y2BaNAD)，表明样品中丙酮酸最初的含量。用分光光度计(Thermo Electron, Finland)测量340 nm处的NADH吸光度。试剂盒的最佳检测范围为0.011 mM ~ 0.340 mM。gydF4y2Ba

丙酮酸测量，同时使用细胞内外的方式服用。在二维和用于每一条件六个样品三维条件二者下进行细胞外的方法。细胞外的方法包括用于葡萄糖和乳酸测量相同的培养基样品中测量丙酮酸浓度。仅在二维情况下进行的细胞内的方法。简言之，在6孔板的各孔用PBS冲洗两次萃取胞外测量介质样品之后。Next, the cells were removed from the wells using cell scrapers, 0.5 mL of cold perchloric acid was added to each well, and the cell/acid solution was placed in microcentrifuge tubes. Next, the samples were subjected to vortex for thirty seconds, placed in a −20°C freezer for five minutes, and then centrifuged for ten minutes at 1700 ×g (Beckman Coulter, Fullerton, CA). The resulting supernatant was used to assay for pyruvate concentration. The samples did not have to be diluted in either the extracellular or intracellular case. Background measurements for intracellular samples were taken using deionized water samples. Background measurements for extracellular samples were taken using ordinary DMEM. These background measurements were subtracted from their respective absorption measurements. Background-subtracted measurements were converted to lactate concentrations using a calibration curve.

2.8。凝胶传输特性的表征gydF4y2Ba

获得台台蓝(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)在2.5 mg/mL和5.0 mg/mL胶原凝胶中扩散时的粘性阻力系数。使用直径1.0 cm的透明试管容纳2.0 mL的每种凝胶浓度(gydF4y2Ba 对于每个浓度）。然后将试管加盖并置于37℃的培养箱中两小时。After incubation, each received 1.0 mL of 0.13% trypan blue solution. The trypan blue solution was allowed to diffuse through the collagen gels while the tubes were maintained at 37°C. Over the span of 3 days, the tubes were periodically photographed (Canon EOS Rebel Digital EF-S 18-55; Tokyo, Japan) and the images were used to determine the distance that the trypan blue solution advanced through the gels using QCapture Pro software (version 5.0.1.26; QImaging; Surrey, BC, Canada). The process was repeated for a set of trypan blue solutions in pure water. After all of the data was collected, the trypan blue advancement was plotted versus time. A second-order polynomial curve was fit to the data points, and the equation was used to find values for both the velocity and acceleration of the dye through the gels. A force balance on the trypan blue molecules was used to estimate values of the drag coefficient 在哪里gydF4y2BaζgydF4y2Ba是阻力系数，gydF4y2Ba 是台盼蓝分子的漂移速度，gydF4y2Ba 是凝胶的密度，gydF4y2BaVgydF4y2Ba是分子在矩阵中扩散的体积，gydF4y2BaggydF4y2Ba为重力加速度，gydF4y2Ba 台盼蓝粉的密度是多少gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba是实验确定的台盼蓝通过胶原基质的加速度。对于这些实验，(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)如下:gydF4y2BaVgydF4y2Ba是gydF4y2Ba ，gydF4y2Ba 1667公斤/米gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba 是1000 kg/m3.gydF4y2Ba,gydF4y2BaggydF4y2Ba是9.8 m / sgydF4y2Ba2gydF4y2Ba．用同样的数值估算台盼蓝在水中的阻力系数。随后,(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)的相对阻力系数，由台盼蓝在胶原凝胶中的阻力系数归一化为台盼蓝在水中的阻力系数。重要的是要注意台班蓝分子的实验加速度比重力加速度小得多。因此，术语包含gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba在求解相对阻力系数时可以忽略不计。相对扩散系数通过取各自阻力系数的倒数来计算。gydF4y2Ba

2.9。统计数据gydF4y2Ba

StatView 5.0.1版用于对数据进行单因素方差分析（ANOVA）和Tukey-Kramer事后检验，以评估组间显著性水平的统计显著性gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba

3.结果gydF4y2Ba

３．１．细胞群gydF4y2Ba

在二维实验开始时，不同实验组之间的细胞群是均匀的(图)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.人群数据在第2天开始显示出血清浓度和第4天葡萄糖浓度之间的显著差异。然而，在第6天，血清组之间没有发现显著差异。此外，较高的葡萄糖浓度比较低的葡萄糖浓度产生更高的细胞群。三维细胞群数据显示两种胶原蛋白密度或两种葡萄糖浓度之间没有显著差异(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.然而，值得注意的是大多数数据的高标准偏差。gydF4y2Ba

(一)gydF4y2Ba
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图1gydF4y2Ba
gydF4y2Ba ＝gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba gydF4y2Ba ＝gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 二维培养6天内的细胞群(平均±标准差)(gydF4y2Ba每组)。随着时间的推移，更高的葡萄糖和血清浓度似乎会产生更高的细胞群。(a: 5%组对应值之间的显著性;B: 10%组对应值之间的显著性;C: 5%组与10%组对应值的显著性;d:同一血清组5.0 mM和25.0 mM葡萄糖值有显著差异;gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba
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图2gydF4y2Ba
gydF4y2Ba ＝gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba gydF4y2Ba ＝gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 三维培养6天的细胞群(平均±标准差)(gydF4y2Ba每组)。在不同的三维环境中培养细胞没有产生任何特定的细胞群趋势。组间差异无统计学意义gydF4y2Ba的水平。gydF4y2Ba
3.2.细胞活力gydF4y2Ba

二维的，第0天的细胞活力表明，在细胞暴露于任何实验处理之前(图片未显示)，细胞数量和融合度较高。然而，在第2天，在0.5 mM和1.0 mM环境中的细胞存活率较低，而在5.0 mM和25.0 mM环境中的细胞存活率较高(图)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.这种趋势通过天四和六持续。对于三维培养物，有在两者胶原密度和环境葡萄糖浓度之间的细胞存活率明显的差异。At day zero, the cell viability and confluency were higher for cells placed in the 2.5 mg/mL collagen matrix (images not shown). Once applied, the 0.5 mM glucose environment caused the cells to exhibit low viability and confluency for the duration of the experiment regardless of the collagen density (Figure4gydF4y2Ba）.在25.0 mM葡萄糖组中，2.5 mg/mL组细胞活力和融合度稳定下降，而5.0 mg/mL组细胞活力和融合度增加(图)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

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图3gydF4y2Ba
μ.gydF4y2Ba 荧光显微镜图像显示第2天二维培养的骨髓间充质干细胞的活力(从左到右增加葡萄糖浓度;从上到下增加血清浓度)。钙黄素am发出绿光表示活细胞，溴化乙锭发出红光表示死细胞。在0.5 mM和1.0 mM的环境下，细胞存活率低，细胞分布稀疏。5.0 mM和25.0 mM环境导致了高生存能力和高一致性的维持。改变血清浓度对存活率没有明显的影响。这个结果在整个一周的过程中都是一致的(20倍目标;比例尺代表250gydF4y2Ba米)。gydF4y2Ba
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图4gydF4y2Ba
μ.gydF4y2Ba 荧光显微镜图像显示第2天和第6天三维培养的骨髓间充质干细胞的活力(从左到右增加葡萄糖浓度;从上到下增加胶原密度)。钙黄素am发出绿光表示活细胞，溴化乙锭发出红光表示死细胞。第2天，0.5 mM环境的存活率较低，而25.0 mM环境的存活率较高。在第6天，0.5 mM环境和25.0 mM−2.5 mg/mL组的存活率较低，而25.0 mM−5.0 mg/mL组的存活率和一致性较高。(40 x客观;比例尺代表100gydF4y2Ba米)。gydF4y2Ba
３．３．葡萄糖消耗gydF4y2Ba

在二维和三维病例中，25.0%的患者葡萄糖消耗量最高 mM组（未显示数据）.对于二维病例，血清组之间有三个病例存在显著差异，葡萄糖组之间有许多显著差异。三维病例在第六天之前，胶原蛋白组或葡萄糖组之间没有产生显著差异，第五天的细胞消耗量更高 mg/mL胶原基质比细胞中的2.5倍 mg/mL胶原基质。gydF4y2Ba

3．4．乳酸生产gydF4y2Ba

作为糖酵解的终点，葡萄糖消耗较高的组预计会产生较高的乳酸产量。这一行为在乳酸生产数据中得到了显示，在二维和三维培养中，乳酸生产随着葡萄糖消耗的增加而增加(数据未显示)。在第4天和第6天的所有胎牛血清水平上，0.5 mM和1.0 mM葡萄糖组的乳酸产量显著低于15 mM组gydF4y2Ba 的水平。同样，在三维培养的第4天和第6天，乳酸的产生与葡萄糖的消耗一致。在二维培养中，胎牛血清对乳酸产量没有显著影响。gydF4y2Ba

3.5. 丙酮酸生产gydF4y2Ba

由于丙酮酸不太可能积累，被转化为乳酸或乙酰辅酶A，丙酮酸的产生量在实验葡萄糖组中不会有一致的模式。这种随机行为在细胞内和细胞外二维培养数据中都有体现，特别是在统计学意义上(图)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.然而，在两种二维的病例中，总丙酮酸水平确实随着血清浓度的增加而降低。三维培养中，25.0 mM葡萄糖组的丙酮酸产量始终高于0.5 mM葡萄糖组。gydF4y2Ba

(一)gydF4y2Ba
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(b)gydF4y2Ba
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图5gydF4y2Ba
gydF4y2Ba ＝gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba gydF4y2Ba ＝gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 二维培养最后两天后细胞外丙酮酸的产生(gydF4y2Ba每组)。生产数据没有显示出明确的趋势。(a:与5%组对应值有显著差异;B:与10%组对应值有显著差异;E:同血清组其他值均有显著差异;f:与同一血清组5.0 mM值有显著差异;g:与同血清组25.0 mM值差异显著;h:与同一血清组1.0 mM值有显著差异;gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba
3.6。代谢比率gydF4y2Ba

二维培养的乳酸-丙酮酸比随起始葡萄糖浓度的增加而增加，说明葡萄糖浓度越高，厌氧性越强gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.对于二维培养的乳酸葡萄糖比，2%血清组的值随着起始葡萄糖浓度的增加呈现相似的上升趋势(表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.然而，5%和10%血清组的值没有变化。值得注意的是，在评估统计显著性时，实际样本总体中的差异。许多样品显示几乎没有丙酮酸生产，导致乳酸-丙酮酸比率的计算成为不可能。此外，在0.5和1.0 mM组中，一些样本显示葡萄糖消耗很少或没有，导致乳酸-葡萄糖比值的计算也变得不可能。这就解释了为什么许多实验组缺少预期的12个样本。三维培养的乳酸-丙酮酸和乳酸-葡萄糖比值没有明显的变化趋势(见表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

(一)gydF4y2Ba二维乳酸-磷酸盐(L/P)比率。gydF4y2Ba
葡萄糖浓缩的。2%血清gydF4y2Ba 5%血清gydF4y2Ba 10%血清gydF4y2Ba
意思gydF4y2Ba 圣开发。gydF4y2Ba NgydF4y2Ba 意思gydF4y2Ba 圣开发。gydF4y2Ba NgydF4y2Ba 意思gydF4y2Ba 圣开发。gydF4y2Ba NgydF4y2Ba
第四天gydF4y2Ba 0.5毫米gydF4y2Ba 2.41gydF4y2Ba 2.36gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba 2.85gydF4y2Ba 2.92gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba 5.92gydF4y2Ba 3.48gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba
1.0毫米gydF4y2Ba 0.59gydF4y2BabgydF4y2Ba 0.93gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba 4.77gydF4y2BabgydF4y2Ba 4.18gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba 5.61gydF4y2Ba 3.02gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba
5.0毫米gydF4y2Ba 8.79gydF4y2Ba 8.52gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 23.46gydF4y2Ba 17．01gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba 52.48gydF4y2Ba 34.08gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba
25．0 mM 14.98gydF4y2Ba 13.12gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 36.05gydF4y2Ba 34.25gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 50.01gydF4y2Ba 32.62gydF4y2Ba 11gydF4y2Ba
第6天gydF4y2Ba 0.5毫米gydF4y2Ba 0．17gydF4y2Ba 0.34gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba 9.57gydF4y2Ba 17.89gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba 4．15gydF4y2Ba 4.83gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba
1.0毫米gydF4y2Ba 10.06gydF4y2Ba 25.28gydF4y2Ba 11gydF4y2Ba 26.58gydF4y2Ba 11.34gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba 31.76gydF4y2Ba 37.43gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba
5.0毫米gydF4y2Ba 51.37gydF4y2Ba 17.22gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba 134.35gydF4y2Ba 111.21gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba 234.68gydF4y2Ba 549.5gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba
25．0 mM 71.49gydF4y2Ba 59.71gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba 113.18gydF4y2Ba 76.5gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 114.8gydF4y2Ba 152.36gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba
(b)gydF4y2Ba二维乳酸-葡萄糖(L/G)比率。gydF4y2Ba
葡萄糖浓缩的。2%血清gydF4y2Ba 5%血清gydF4y2Ba 10%血清gydF4y2Ba
意思gydF4y2Ba 圣开发。gydF4y2Ba NgydF4y2Ba 意思gydF4y2Ba 圣开发。gydF4y2Ba NgydF4y2Ba 意思gydF4y2Ba 圣开发。gydF4y2Ba NgydF4y2Ba
第四天gydF4y2Ba 0.5毫米gydF4y2Ba 0.72gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba 0.45gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba 1.47gydF4y2Ba 0.09gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba 0.57gydF4y2Ba 0.62gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba
1.0毫米gydF4y2Ba 0.52gydF4y2Ba 0．55gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 1.81gydF4y2BabgydF4y2Ba 1.44gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 2.71gydF4y2Ba 3.65gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba
5.0毫米gydF4y2Ba 1.19gydF4y2Ba 0.89gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 2.2gydF4y2Ba 1.42gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 2.09gydF4y2Ba 1.44gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba
25．0 mM 1.53gydF4y2Ba 1.56gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 1．9gydF4y2Ba 1.49gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 2.85gydF4y2Ba 2.67gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba
第6天gydF4y2Ba 0.5毫米gydF4y2Ba 0.65gydF4y2BafgydF4y2Ba 0.49gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba 1.94gydF4y2Ba 2.52gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba 0.59gydF4y2Ba 0.63gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba
1.0毫米gydF4y2Ba 0.47gydF4y2BafgydF4y2Ba 0.49gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 3.65gydF4y2Ba 2.6gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 13.53gydF4y2Ba 22.57gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba
5.0毫米gydF4y2Ba 2.39gydF4y2Ba 1．75gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 2.99gydF4y2Ba 2.29gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 2.69gydF4y2Ba 2.07gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba
25．0 mM 1.56gydF4y2Ba 1．2gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 1.95gydF4y2Ba 1.45gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 2.32gydF4y2Ba 1.91gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba
表1gydF4y2Ba
二维L/P比率和L/G比率的总结。L/P比值表明，起始葡萄糖浓度较高的组表现出更强的厌氧特性。这一趋势在2%血清组相似，但在5%和10%血清组均不存在。(a:与5.0 mg/mL组对应值差异显著;b:与同一胶原蛋白组25.0 mM值有显著差异;f:与同一血清组5.0 mM值有显著差异;gydF4y2Ba gydF4y2Ba ＝gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba ）.gydF4y2Ba
实验组L/P比值gydF4y2Ba L / G比gydF4y2Ba
意思gydF4y2Ba 圣开发。gydF4y2Ba NgydF4y2Ba 意思gydF4y2Ba 圣开发。gydF4y2Ba NgydF4y2Ba
第四天gydF4y2Ba 0.5 毫米/低密度gydF4y2Ba 2.30gydF4y2BabgydF4y2Ba 5.66gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 1.93gydF4y2Ba 2.29gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba
25.0毫米/低密度gydF4y2Ba 11.92gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba 5.41gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba 0.92gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba 0.97gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba
0.5毫米/高密度gydF4y2Ba 2.15gydF4y2BabgydF4y2Ba 2.42gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 15.47gydF4y2BabgydF4y2Ba 11.20gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba
25.0毫米/高密度gydF4y2Ba 18.73gydF4y2Ba 4.95gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba 1．11gydF4y2Ba 0.88gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba
第6天gydF4y2Ba 0.5 毫米/低密度gydF4y2Ba 74.75gydF4y2Baa、bgydF4y2Ba 77.85gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba 17.30gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba 47.92gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba
25.0毫米/低密度gydF4y2Ba 8.49gydF4y2Ba 9.85gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 2.34gydF4y2Ba 2.44gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba
0.5毫米/高密度gydF4y2Ba 2.92gydF4y2Ba 1.15gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba 11.04gydF4y2BabgydF4y2Ba 8.60gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba
25.0毫米/高密度gydF4y2Ba 6.32gydF4y2Ba 7.23gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba 1．02gydF4y2Ba 1．22gydF4y2Ba 12gydF4y2Ba
表2gydF4y2Ba
三维代谢比率概述。数据中没有明显的趋势。(a:与5.0 mg/mL组对应值差异显著;b:与同一胶原蛋白组25.0 mM值有显著差异;gydF4y2Ba gydF4y2Ba ＝gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba ）.gydF4y2Ba
3.7. 凝胶传输特性gydF4y2Ba

漂移速度和加速度表明台虫蓝分子在2.5 mg/mL凝胶中的移动速度要比5.0 mg/mL凝胶快gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.这些特征反映在平均阻力系数中，5.0 mg/mL凝胶的阻力系数大于2.5 mg/mL凝胶的阻力系数。gydF4y2Ba
水gydF4y2Ba 2.5毫克/毫升gydF4y2Ba 5.0毫克/毫升gydF4y2Ba
意思gydF4y2Ba 范围gydF4y2Ba 意思gydF4y2Ba 范围gydF4y2Ba 意思gydF4y2Ba 范围gydF4y2Ba
漂移速度(米/秒)gydF4y2Ba ０．０４gydF4y2Ba N/AgydF4y2Ba 2gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba 来gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba 来gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba
加速。（多发性硬化症gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）gydF4y2Ba 0．0gydF4y2Ba N/AgydF4y2Ba −gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 来gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba 来gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba
相对阻力系数。*gydF4y2Ba 1．0gydF4y2Ba N/AgydF4y2Ba 5gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba gydF4y2Ba +gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba gydF4y2Ba +gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 来gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba gydF4y2Ba +gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba gydF4y2Ba +gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba gydF4y2Ba +gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba 来gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba gydF4y2Ba +gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba
相对扩散系数*gydF4y2Ba 1．0gydF4y2Ba N/AgydF4y2Ba 6gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba 来gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 3.gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba 来gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba gydF4y2Ba −gydF4y2Ba 0gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba
表3gydF4y2Ba
台盼蓝在胶原凝胶中的扩散研究结果综述。两种细胞密度的扩散系数大致相同。*相对阻力系数和相对扩散系数与水进行归一化计算(2.5 mg/mL组和5.0 mg/mL组的扩散系数无显著差异)。gydF4y2Ba

4。讨论gydF4y2Ba

本研究的总体目的是研究普通二维培养与基于胶原的三维培养间充质干细胞代谢状态的可能差异。二维实验包括将细胞置于不同类型的葡萄糖和血清浓度的培养基中。三维实验将细胞置于两种不同的葡萄糖浓度和两种胶原密度下。三维培养只受到葡萄糖浓度的变化，因为葡萄糖似乎对细胞生长、活力和代谢状态有最关键的影响。选择5%血清浓度是因为其在2%和10%血清组之间的调节。这些结果突出了在这些不同条件下培养的MSCs代谢状态的相对差异。总的来说，影响细胞群的两个最重要的因素是起始葡萄糖浓度和三维基质的添加。gydF4y2Ba

这一结果可能对干细胞治疗具有重要意义，因为在培养过程中代谢状态的差异可能会影响MSCs的最终分化。人类脂肪来源的干细胞已经证明了这一点，因为它们向成骨细胞的分化通过改变代谢条件而改变[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］.由于分化是干细胞进行的一个复杂过程，可以合理地假设，实现任何特定的最终分化都依赖于大量的能源使用。有氧代谢和无氧细胞代谢都产生所有细胞进行生理过程所依赖的能量。此外，有证据表明，在特定的代谢过程中，细胞表现出对一种代谢状态的偏爱[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］.gydF4y2Ba

厌氧糖酵解和好氧柠檬酸循环是细胞获取能量的两种主要途径。它们可以通过细胞所消耗的葡萄糖的去向来区分。在糖酵解过程中，葡萄糖转化为丙酮酸，丙酮酸再转化为乳酸作为终端产物。而在柠檬酸循环中，糖酵解结束时产生的丙酮酸以乙酰辅酶a的形式进入柠檬酸循环。细胞培养的相对代谢状态，无论是有氧还是厌氧，可以通过测量葡萄糖消耗和乳酸产生来评估;乳酸含量越高，则越有可能处于相对无氧代谢状态。gydF4y2Ba

这些数据阐明了生长培养基葡萄糖和血清浓度改变MSCs代谢状态的能力。已有研究表明，从兔子身上提取的脂肪干细胞[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]和人类[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba当暴露于高葡萄糖环境时，会增加它们的乳酸产量、增殖和生存能力。这一系列实验的结果与那些结果很吻合。二维实验的代谢比率表明，生长培养基中的血清和葡萄糖浓度都有助于确定细胞的代谢状态，较高的血清浓度和较高的葡萄糖浓度导致更多的厌氧培养。乳酸-丙酮酸比表明，葡萄糖比血清更有影响，因为葡萄糖浓度的增加产生代谢比的显著增加，而血清浓度的增加不能复制。在过去的两天里，三维实验的比率并没有显示出明显的趋势。但总体而言，三维培养的乳酸-丙酮酸比比二维培养的低得多，说明三维培养的厌氧程度较低。虽然二维培养的结果是预期的，但添加三维细胞外基质对L/P和L/G比率有意想不到的影响，这表明这些影响必须进行更详细的研究。gydF4y2Ba

这些实验的设置有几个优点。其主要优点是使用相同的细胞类型进行二维和三维培养，从而避免了不同细胞类型之间潜在的显著代谢差异。Sander和Nauman强调了这一事实，因为他们发现，在不同葡萄糖和氧气水平的环境中培养一周后，大鼠星形胶质细胞产生的乳酸葡萄糖比猪cribrosa细胞和猪巩膜成纤维细胞都要低[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］.此外，在二维实验中，葡萄糖和血清浓度同时变化，从而可以分离出两种培养基成分的影响。葡萄糖分析，分辨率为3.0gydF4y2Ba M的d -葡萄糖，乳酸测定，分辨率为0.22 mM的乳酸，丙酮酸测定，分辨率为0.011 mM，灵敏度高。在未来，这一性质的研究将补充活细胞内NADH的实时成像，以估计细胞内相关代谢活动的位置和强度。gydF4y2Ba

这些实验也有一些局限性。台盼蓝扩散实验的目的是研究代谢产物被困在胶原基质内的可能性，从而避免检测。然而，台台蓝分子质量约960 g/mol，能够在大约15分钟内通过2.5 mg/mL和5.0 mg/mL胶原凝胶渗出约1.0 mm(数据未显示)。因此，可以合理地假设葡萄糖、乳酸和丙酮酸-所有的分子量都小于200 g/mol -都能够穿过胶原基质并被检测。还有另外两种情况表明，凝胶的厚度并没有阻止乳酸从凝胶中充分运输出来。第一个是认识到钙磷脂- am -分子量为995 g/mol，在15分钟内扩散到凝胶中并没有任何困难，以便拍摄细胞的荧光图像。第二个来自霍纳和厄本的营养供应研究结果[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］.在这项研究中，研究人员将细胞核细胞嵌入1%琼脂糖基质中，并监测细胞的生存能力，作为其与扩散室中营养供应距离的函数。Homer和Urban研究表明，被包埋的细胞在营养供给的5.0 mm范围内仍能存活。然而，对于1%琼脂糖凝胶和本研究的胶原凝胶之间的扩散和力学性能的相似性存在不确定性。另一个缺点是，在为期一周的实验过程中，胶原蛋白凝胶的收缩无法避免，大多数凝胶收缩到原来大小的75%左右。这可能特别反映在细胞活力图像上，在实验结束时，2.5 mg/mL样本比5.0 mg/mL样本的细胞死亡更高。更硬的凝胶很可能减弱了收缩的程度，使细胞在一周内更好地通过基质运输营养/废物。gydF4y2Ba

这一系列实验的结果可以作为在细胞外基质或分化方案之前培养的MSCs的基本特征，它们将特别有利于组织工程领域。虽然有充分的证据表明，细胞外基质对几种细胞类型有显著影响[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，细胞外基质对细胞代谢的影响还有待研究。与二维培养相比，三维培养的细胞代谢发生了改变，这可能对细胞外基质的使用产生重大影响，因为细胞代谢影响所有的细胞生理。因此，进一步研究细胞代谢对干细胞最终分化的影响势在必行。此外，同样重要的是进行一项研究，调查细胞代谢与使用的细胞外基质材料类型的差异。在此，我们证明葡萄糖是影响细胞代谢的主导因素，但胎牛血清也调节这一作用，培养条件对表型和表型潜能的长期影响仍需阐明。预计胎牛血清的可得性在分化过程中可能发挥更重要的作用，而胎牛血清的蛋白质含量可能在代谢和分化途径的耦合中发挥作用。gydF4y2Ba

然而，从体外研究过渡到体内研究总是有很大的风险，因为环境在很多方面都是不同的，从实践和伦理的角度来看，在将同样的变量应用于动物系统之前，在人工组织模拟物上研究一组实验变量将是有利的;这一中间步骤可以加速研究发现，并防止动物不必要的死亡，从体外组织的结果显示的危险影响，仅二维情况下无法显示。因此，这一中间步骤可能会降低与体外到体内实验相关的成本。gydF4y2Ba

5.结论gydF4y2Ba

本研究结果表明，葡萄糖的提供量和细胞外基质的存在确实会影响培养细胞的代谢状态和活力。在其他条件相同的情况下，提供更高浓度的葡萄糖可能是将细胞推向无氧状态的一种方法。此外，研究结果表明，间充质干细胞的三维培养可能必须在相对坚硬的基质或胶原水凝胶和胶原纤维的复合材料中进行[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba，需要进一步研究细胞外基质对间充质干细胞代谢的影响。扩散结果表明，两种高密度胶原凝胶的整体运输特性基本相同，因此三维培养中实验组之间结果的差异不能归因于运输特性的差异。代谢状态对表型和表型潜能的影响需要进一步的研究。gydF4y2Ba

致谢gydF4y2Ba

作者感谢美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目的资助。他们还要感谢普渡大学韦尔登生物医学工程学院的Sherry Voytik-Harbin博士捐赠了用于这些实验的间充质干细胞。gydF4y2Ba

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