间充质干细胞(msc)已经成为组织工程的关键除了所有方面。虽然大多数
组织工程的应用集成工程和生物原理研究、设计、开发、和修复生物结构。迭代,objective-driven过程促使生产人造皮肤( 骨骨髓来源间充质干细胞(msc)有争议的获得和容易控制比胚胎干细胞( 虽然这些进步的领域具有重要意义,目前的研究缺少与msc的三维文化,它们的代谢状态,以及这两个因素可能会影响他们的终端分化。是很重要的考虑在三维细胞会如何应对文化相比,二维文化因为它已经表明,细胞外基质的相互作用引起许多不同的细胞反应有关分化、增殖、生长、活性和基因表达( 因此,本系列的整体动力实验旨在探讨msc在文化的代谢状态,以应对变化葡萄糖和胎牛血清(的边后卫)浓度在二维和三维培养条件。
小鼠msc(写明ATCC crl - 12424)被用于这些实验(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。msc在维护培养介质组成的glutamine-free杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM) (90 - 113 pb, Mediatech荷顿,弗吉尼亚州)补充10%的边后卫(美国表达载体,加州卡尔斯巴德),1% penicillin-streptomycin(10毫克/毫升,Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),和0.1%的两性霉素b (250
圆形胶原凝胶面积2.0厘米
24-well板块被用于细胞数量确定两和三维文化。简单地说,赫斯特染料(美国表达载体,加州卡尔斯巴德)加入DMEM最终浓度为5.0
同一24-well盘子用来评估细胞群被用来使用荧光成像技术观察细胞生存能力定性。短暂,calcein-AM和溴化乙锭(丙烯酰胺、圣路易斯、钼)加入DMEM最终浓度为2.5
媒介样本检测葡萄糖浓度使用荧光测定工具包(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。装备表明葡萄糖的存在通过激活荧光resorufin,吸收最大值在571 nm和发射最大值在585海里。样本与去离子水稀释,以便最佳探测范围内的葡萄糖浓度会下降的装备,在3.0之间
媒介样本检测乳酸浓度使用分光光度分析工具包(Instruchemie、荷兰)。装备决定了乳酸的浓度检测吸光度的增加的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)在340 nm,表明乳酸最初出现在样本的数量。340海里的NAD吸光度测定的分光光度计(热电子、芬兰)。细胞外样本稀释与等量的去离子水,乳酸浓度会下降最佳探测范围内的设备,0.22毫米和13.32毫米之间。背景测量细胞外使用普通DMEM采集标本。这些背景测量减去从各自吸收测量。Background-subtracted测量转化为乳酸浓度使用校准曲线。
细胞外和细胞内的样本检测丙酮酸浓度使用分光光度分析工具包(Instruchemie、荷兰)。装备决定了丙酮酸的浓度检测减少氧化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的吸光度 丙酮酸使用测量细胞内和细胞外的方法。细胞外的方法进行两和三维条件下有六个样品给予每个条件。细胞外的方法包括测量丙酮酸浓度在同一介质样品用于葡萄糖和乳酸测量。细胞内的方法只是对二维情况下执行的。短暂,每个6-well板块是冲洗两次后与PBS中样本中提取的细胞外测量。接下来,这些细胞被从井中除去细胞刮刀,0.5毫升的冷高氯酸添加到每个好,和细胞/酸溶液放置在微型离心机管。接下来,样品受到漩涡三十秒钟,放置在一个−20°C冰箱五分钟,然后离心10分钟1700×g(贝克曼库尔特,富勒顿,CA)。得到的上层清液是用来测定丙酮酸浓度。样品没有被稀释在细胞外或细胞内的情况。背景测量细胞内使用去离子水样本采集标本。 Background measurements for extracellular samples were taken using ordinary DMEM. These background measurements were subtracted from their respective absorption measurements. Background-subtracted measurements were converted to lactate concentrations using a calibration curve.
粘性阻力系数均获得锥虫蓝(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)扩散通过2.5毫克/毫升和5.0毫克/毫升胶原凝胶。明确1.0厘米直径试管被用来存放每个凝胶浓度(2.0毫升的
StatView v5.0.1被用来应用一个因素方差分析(方差分析)和Tukey-Kramer事后测试之间的数据来评估统计学意义组的显著性水平
二维实验的细胞群开始时甚至不同的实验组,每组之间(图 细胞群(平均值±标准偏差)的六天在二维文化( 细胞群(平均值±标准偏差)的六天在三维文化(
二维,天零细胞生存能力表明高细胞数量和confluency细胞暴露在任何实验治疗前(图片没有显示)。然而,白天两个0.5毫米和1.0毫米的细胞环境中表现出低生存能力而在5.0毫米和25.0毫米环境表现出高生存能力(图 荧光显微镜图像显示bmsc的可行性在二维文化在第二天(增加葡萄糖浓度从左到右;增加血清浓度从上到下)。Calcein-AM表示活细胞通过发射绿光,而溴化乙锭表明死细胞通过发射红光。0.5毫米和1.0毫米环境导致低可行性和稀疏的细胞分布。5.0毫米和25.0毫米环境导致高生存能力和高confluency的维护。不同血清浓度没有产生显著影响的可行性。这个结果是一致的在本周的课程(20 x客观;比例尺代表250 荧光显微镜图像显示bmsc的可行性后在三维文化第二和第六天(增加葡萄糖浓度从左到右;增加胶原蛋白密度从上到下)。Calcein-AM表示活细胞通过发射绿光,而溴化乙锭表明死细胞通过发射红光。第二天后,0.5毫米环境导致生存能力低,而25.0毫米环境导致高生存能力。通过6天,0.5毫米环境和25.0毫米−2.5毫克/毫升组导致生存能力低,而25.0毫米−5.0毫克/毫升组导致高可行性和confluency。(40 x客观;比例尺代表100
在两和三维情况下,葡萄糖消费最高的25.0毫米组(数据未显示)。对于二维的情况,有3例血清组之间的显著差异和葡萄糖组之间的显著差异。三维情况下胶原蛋白组之间并没有产生显著差异或葡萄糖组到第六天,消费时高5.0毫克/毫升的细胞胶原基质比2.5毫克/毫升细胞胶原蛋白矩阵。
组与高葡萄糖消耗会产生乳酸生产糖酵解的端点。这种行为是乳酸生产数据所示,与乳酸生产增加增加葡萄糖消耗两和三维文化(数据未显示)。在所有的边后卫层次4和6天的0.5毫米和1.0毫米葡萄糖组表现出显著降低乳酸生产比15毫米的小组
丙酮酸是不可能积累,被转化为乳酸或乙酰辅酶A,丙酮酸生产的数量不应该有一个一致的模式在实验葡萄糖组。这个随机行为是显示在细胞内和细胞外,二维文化数据,尤其是统计学意义(图 细胞外的丙酮酸生产后的最后两天二维文化(
Lactate-to-pyruvate比二维文化均呈增长趋势与初始葡萄糖浓度的增加,表明高葡萄糖文化更有厌氧(表 总结三维的代谢率。没有明显的趋势数据。(答:显著不同相应的值在5.0毫克/毫升组;b:明显不同于25.0毫米值在同一个胶原蛋白组;
实验组L / P比值 L / G比
的意思是 圣开发。
的意思是 圣开发。
第四天 0.5毫米/低密度 2.30
5.66 12 1.93 2.29 6
25.0毫米/低密度 11.92
5.41 7 0.92
0.97 12
0.5毫米/高密度 2.15
2.42 12 15.47
11.20 8
25.0毫米/高密度 18.73 4.95 6 1.11 0.88 12
一天6 0.5毫米/低密度 74.75
77.85 3 17.30
47.92 12
25.0毫米/低密度 8.49 9.85 12 2.34 2.44 8
0.5毫米/高密度 2.92 1.15 6 11.04
8.60 8
25.0毫米/高密度 6.32 7.23 12 1.02 1.22 12
漂移速度和加速度表明,台盼蓝分子更快通过2.5毫克/毫升旅行比5.0毫克/毫升凝胶凝胶(表 总结的结果与锥虫蓝通过胶原凝胶扩散。扩散系数的细胞密度是大致相同的。*相对阻力系数和相对扩散系数值的计算是通过正火与水(没有明显区别的扩散系数值2.5毫克/毫升和5.0毫克/毫升组)。
水 2.5毫克/毫升 5.0毫克/毫升
的意思是 范围 的意思是 范围 的意思是 范围
漂移速度(米/秒) 0.04 N /一个
Accel。(米/秒 0.0 N /一个
相对阻力系数。* 1。0
N /一个
相对扩散系数* 1。0
N /一个
本研究的总体目的是调查可能的代谢状态的差异msc在普通二维培养文化与collagen-based三维文化。对细胞的二维实验包括各种介质类型,不同血糖和血清浓度。三维实验受到细胞两种不同葡萄糖浓度和两个胶原蛋白密度。三维文化只接受葡萄糖在葡萄糖浓度变化似乎对细胞生长的影响最关键,生存能力,和代谢状态。适度的5%血清浓度被选中,是因为在2%和10%之间血清组。结果突出msc的代谢状态的相对差异在这些不同的培养条件。总的来说,最重要的两个因素影响细胞群开始葡萄糖浓度和添加一个三维矩阵。 这个结果可以为干细胞治疗有着重要的意义,随着代谢状态在文化的差异可能会影响终端分化的msc。人类脂肪干细胞已经显示出这方面的证据是他们分化为成骨细胞改变通过改变它们的代谢条件( 无氧糖酵解和有氧柠檬酸循环的两个主要手段是细胞获得能量。他们可以区分细胞葡萄糖消耗的命运。在糖酵解,葡萄糖转化为丙酮酸,然后转化为乳酸作为终端产品。然而,在柠檬酸循环,结束时糖酵解产生的丙酮酸进入三羧酸循环的形式乙酰辅酶a。相对代谢说明有氧或anaerobic-of细胞培养可以测量葡萄糖消耗和乳酸生产的后评估;乳酸量越高,越有可能相对厌氧代谢状态。 这些数据说明的能力增长中葡萄糖和血清浓度改变的代谢状态msc。它已经表明,脂肪中提取干细胞从兔子 这些实验的设置有几个优势。主要优势是使用相同的细胞类型为三文化,以避免潜在的显著差异在不同细胞类型之间的新陈代谢。这一事实强调了砂光机和Nauman发现培养大鼠星形胶质细胞产生lactate-to-glucose比率低于两猪板cribrosa细胞和猪巩膜成纤维细胞经过一个星期的文化环境和不同的葡萄糖和氧含量( 这些实验也拥有很多的局限性。台盼蓝扩散实验的目的是调查的可能性代谢物被困在胶原基质,从而避免检测化验。然而,锥虫blue-molecular ~ 960克/ mol被能够渗透的重量大约1.0毫米到2.5毫克/毫升和5.0毫克/毫升胶原凝胶在大约15分钟(数据没有显示)。因此,它是合理的假设,葡萄糖,乳酸,pyruvate-all分子量小于200 g / mol-were胶原蛋白能够遍历矩阵和检测。有两个其他情形表明,凝胶的厚度并没有阻止足够的运输乳酸凝胶。首先是承认calcein-AM-molecular体重~ 995克/ mol-did没有任何麻烦扩散进入凝胶在十五分钟内,以荧光的细胞图像。第二个来自霍纳的营养供给研究的结果和城市( 这一系列实验的结果作为基准特征的msc在文化受到细胞外基质或分化方案,他们将特别有利于组织工程领域。虽然能够很好的证明,细胞外基质产生重大影响多种细胞类型( 时,总是有很大的风险与过渡从体外到体内研究,因为环境在许多方面是不同的,从实际和伦理观点,这将是有利的手段调查一组实验变量在一个人工组织模拟实现相同的变量之前在动物系统;这中间步骤可能会加速研究成果,防止不必要的死亡的动物应该从这种体外组织结果揭示危险的影响,二维情况下并没有透露。因此,这中间步骤有可能降低成本与vitro-to-in体内实验。
这项研究的结果表明,葡萄糖提供的数量和细胞外基质的存在的确影响细胞的代谢状态和生存能力的文化。提供更大的葡萄糖浓度可能是一种细胞向厌氧状态,其他条件都相同。此外,结果表明,三维msc的文化可能发生在一个相对僵硬的矩阵或复合胶原蛋白水凝胶和胶原纤维(
作者要感谢美国国家科学基金会的资助研究生研究奖学金计划。他们还要感谢雪莉Voytik-Harbin博士在韦尔登普渡大学生物医学工程学院的msc的为她捐款用于这些实验。