增强糖尿病伤口愈合脂肪组织间充质干细胞过度基质细胞衍生因子1的局部给药：生物分布和植入分析生物光学成像

抽象

慢性溃疡，导致疼痛和不适的糖尿病患者是一个重大的健康问题。常规疗法并不能保证足够的创面修复。在糖尿病中，受损的愈合部分是由于差内皮祖细胞动员和归巢，用在伤口部位趋化因子基质细胞衍生因子-1（SDF-1）水平的改变。脂肪组织相关的基质细胞（AT-SCS）可以提供祖细胞分泌促血管生成因子和分化成内皮样细胞的访问的源。我们证明AT-SCS的是局部给药转基因离体过表达SDF-1，促进伤口愈合到糖尿病小鼠。特别是，通过在活的有机体内生物荧光成像分析，我们监测了荧光素酶表达细胞移植后的生物分布和存活情况。总之，本研究表明了at - scs在创伤愈合中的治疗潜力，通过细胞分化、增强创伤部位的细胞招募以及与局部生长因子产生相关的旁分泌效应。

1.简介

皮肤溃疡由于微/大血管疾病和周围神经病表示在糖尿病的常见并发症。患有慢性伤口的痛苦对生活质量下降，需要经常住院，阅历的增加，发病率和死亡率，造成巨大的社会和经济成本[<一个href="#B1">1]。目前的治疗，其中包括在伤口部位处的压力释放，积极的外科清创术，感染的控制，和动脉重建，在有效性是有限的，经常不足以保证足够的愈合[<一个href="#B2">2]。事实上，患者显著数量并不对常规疗法响应，症状复发频繁。短蛋白半衰期和低效递送至靶细胞阻碍一些非常规的治疗方法，包括的重组生长因子局部施用于促进组织再生[<一个href="#B3">3.]。

由于增加了疾病的发病率，有必要开发改进的疗法治疗糖尿病溃疡减轻患者的不适感，降低社会负担。最近，干细胞应用已被建议作为一种可能的新的治疗选项，以促进慢性伤口愈合[<一个href="#B4">4]。具体地，间充质干从胎儿肝脏分离的细胞[<一个href="#B5">5和骨髓[<一个href="#B6">6,<一个href="#B7">7]可通过分化和血管生成促进促进伤口修复。间充质细胞分享从骨髓也分离的那些类似的特征可以从脂肪组织衍生[<一个href="#B8">8]。脂肪组织来源的基质细胞（AT-SCS），也被称为基质血管级分细胞（AT-SVFs）中，从脂肪组织通过胶原酶消化和差异离心收集[<一个href="#B9">9]。由于吸脂只涉及局部麻醉，细胞可以从患者具有可重复的，nondebilitating操作而获得，并在组织再生的部位自体移植。该过程可以在一个大范围进行，按照GMP规定重复的方式，从而可以在临床前研究和实验的临床试验[使用AT-SCS<一个href="#B10">10]。

脂肪组织来源的多潜能前体细胞能够分化为中胚层和非中胚层来源的几种细胞类型，包括脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、肌细胞、肝细胞、胰腺内分泌细胞、神经元和内皮细胞(参阅[<一个href="#B9">9])。

AT-SCS分泌血管生成分子，包括HGF，VEGF，PlGF的，IGF，KGF和[<一个href="#B11">11,<一个href="#B12">12]。此外，转录谱表明促血管生成基因的表达[<一个href="#B13">13]。AT-SCS的移植已被证明能促进治疗性血管生成在后肢缺血的小鼠[<一个href="#B14">14- - - - - -<一个href="#B16">16]。这可能是由于整合AT-SCS进入血管在活的有机体内(<一个href="#B17">17]，并通过旁分泌效应介导的新血管形成的贡献[<一个href="#B18">18]。此外，AT-SCS能促进人体皮肤成纤维细胞增殖<一个href="#B12">12]和伤口在小鼠模型中的愈合[<一个href="#B19">19,<一个href="#B20">20.通过细胞间直接接触和旁分泌效应。此外，已经描述了AT-SCs及其分泌因子在氧化损伤中的保护作用[<一个href="#B21">21]。改进的伤口愈合的脂肪组织提取物的混合物在猪实验模型来测定<一个href="#B6">6]，同时AT-SCS提取物并不影响小鼠的伤口愈合[<一个href="#B19">19]。

总之，这些研究支持使用AT-SCS管理，以促进伤口愈合方法的发展。然而，我们很少知道如何移植细胞的行为在活的有机体内，以及他们的后植入，持久性，分化和生物分布的能力在活的有机体内行政。在活的有机体内通过阐明移植细胞及其子代的细胞生物学和生理学，动物模型研究有可能证明干细胞治疗的临床潜力。目前研究给药后干细胞命运的方法主要依赖于对动物标本的组织化学评价。这种方法耗时、费力、昂贵，需要对来自大量实验动物的多个样本进行切片分析。以便更好地了解干细胞的活动在活的有机体内中，需要快速，经济实惠，以及非侵入性成像技术。

为了在糖尿病伤口愈合受损的鼠模型来评估AT-SCS的植入，我们使用生物发光成像来追踪移植细胞。此外，我们感兴趣的是确定SDF-1的过表达伴随是否可以进一步促进伤口愈合，细胞植入。事实上，在糖尿病病情，受损的愈合是至少部分归因于SDF-1下调[<一个href="#B22">22]，其在循环内皮祖细胞（EPC）的伤口部位影响迁移和归巢[<一个href="#B23">23]。在另一方面，在重组SDF-1 [病灶部位外源性给予<一个href="#B24">24]或慢病毒载体的表达SDF-1 [<一个href="#B25">25]逆转受损的EPC归巢糖尿病伤口愈合的鼠模型。相反，在糖尿病动物SDF-1抑制导致伤口修复的进一步损害[<一个href="#B26">26]。此外，SDF-1的过表达增加了CXCR4表达间充质干细胞的存活和生长都体外(<一个href="#B27">27),在活的有机体内(<一个href="#B28">28,<一个href="#B29">29]。

在这里，我们表明，AT-SCS的局部给药促进糖尿病小鼠的伤口愈合，通过BLI确定生物分布和施用的细胞移植的动能。

2.材料和方法

2.1。实验动物

在研究中使用的小鼠是6至8周龄野生型瑞士CD1雄性转基因小鼠表达GFP普遍存在[<一个href="#B30">30.]，或GFP和萤火虫荧光素酶[<一个href="#B31">31]从保持我们的机构动物设施的殖民地。根据健康的意大利国家研究院的指导方针进行所有的实验程序，由机构动物护理和使用委员会批准。

Induction of diabetes was obtained by intraperitoneal injection of 50 mg/kg streptozotocin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) in 0.05 M Na citrate, pH 4.5, for 5 consecutive days. Two weeks after the last streptozotocin injection, animals were fasted for 2 hours and blood glucose level measured using an Ascensia Confirm glucometer (Bayern HealthCare, Basel, Switzerland). Mice with glycaemia above 200 mg/dl were selected for further studies. Three weeks later, diabetic animals were used for wound-healing experiments.

2.2。细胞隔离

如先前所述，从6周龄小鼠获得的AT-SCS [<一个href="#B32">32]。简单地说，腹股沟皮下脂肪垫在37℃震荡水浴中消化45分钟，PBS中含2% BSA和2 mg/ml胶原酶a(罗氏诊断公司，曼海姆，德国)。在组织分解后，细胞通过a40过滤μm cell strainer (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) and collected by centrifugation at low speed (500 g) to remove floating mature adipocytes. Cells were then washed in PBS, counted, and used for wound healing experiments. With this procedure, we isolated approximately 0.8–1.2 × 10⁶细胞从每个6周龄小鼠。

获取脂肪来源的贴壁基质(ADAS) [<一个href="#B13">13]，有时也称为脂肪问题衍生的间充质细胞（AT-MSC的）<一个href="#B33">33]，将细胞在组织培养皿DMEM 20％FCS接种。隔夜培养后，所得的贴壁细胞群。

如先前所述皮肤成纤维细胞从相同动物获得的[<一个href="#B34">34]。简单地说，用PBS清洗皮肤样本，然后用酶消化去除皮下组织和表皮。用PBS洗涤后，将皮肤样本切成小块，在37℃水浴中用0.3%胰蛋白酶的PBS处理30分钟。然后加入冰冷的完全培养基(DMEM 10% FCS)，样品在涡流中剧烈混合。禁赛通过了40分μm细胞滤网，150×g, 4℃离心10 min收集细胞。细胞在PBS中清洗并计数，或作为血管生成塞试验的对照(见下文)，或放在组织培养皿(0.4×10)上⁵细胞/厘米²）在完全培养基。

2.3。病毒载体的构建

如先前所描述的重组第一代E1-E3-缺失对SDF-1和GFP表达的腺病毒（AD）载体使用的Ad-易系统获得[<一个href="#B35">35]。扩增后用CsCl纯化腺病毒载体₂梯度超速离心法[<一个href="#B36">36并在含有3%蔗糖、10mm Tris、pH 7.8、150 mM NaCl和10mm MgCl的溶液中透析₂。病毒滴度通过在293个细胞中的病毒原种连续稀释估计并表示为每毫升（PFU / ml）的噬斑形成单位。病毒原种为不存在有复制能力的腺病毒的测试对A549细胞。

2.4。体外病灶修复试验

该分析按照Bilic等人的描述进行[<一个href="#B37">37一式三份。第二代脂肪组织间充质细胞在完全培养基(DMEM 20% FCS)中培养融合。在37℃条件下，通过腺病毒介导的基因转染细胞1小时，感染次数为10。用PBS洗涤细胞，然后用含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的无血清培养基培养。在基因移植后的第一天，用2mm细胞刮刀损伤细胞单层，但不损伤培养皿表面。在第0天和第1天和第2天用数码相机记录病变区域。使用图像分析系统(IAS, Delta Sistemi，罗马，意大利)追踪病灶边缘并计算像素区域进行分析。体外病变修复以0时刻计算值的百分比表示。

2.5。体内血管生成凝胶塞实验

该测定法是基于基质胶塞的植入物[<一个href="#B38">38]。新鲜分离的at - scs用PBS重悬，与Cultrex生长因子降低的基膜提取物(Trevigen Inc.， Gaithersburgh, MD)混合，维持在4℃(液态)。大约是400μ含有7×10升Cultrex的⁵将细胞皮下注射到瑞士CD1小鼠体内，每组5只小鼠，每组靠近腹部中线。注射前将溶液和注射器放在冰上，以防止针头凝结。一周后，小鼠被处死并摘除凝胶塞。样品用4%甲醛固定，石蜡包埋，切片和组织学分析。切片用马尾松三色染色法处理，测定毛细管密度。

2.6。在伤口部位细胞管理

Hyperglycaemic animals were sedated by intraperitoneal administration of Avertin (200 mg/kg, Sigma-Aldrich) and shaved on the dorsum, and a full-thickness wound was performed on the dorsal midline using a 3.5 mm-diameter biopsy punch (Stiefel, Offenbach am Main, Germany). Right after wound induction, freshly isolated AT-SCs were then administered site in a single dose (7.5 × 10⁵细胞/小鼠溶于40 μl用生理盐水)局部置于病灶处。对照组动物接受等量的生理盐水。受伤的动物被单独饲养。

2.7。伤口分析

在受伤后的不同时间点（0，3，5，7，10，和14天），病变闭合，使用数字照相机记录。图像进行处理，并通过跟踪伤口边缘，并使用图像分析系统（IAS）计算像素区域进行分析。上皮再形成记录为初始伤口面积的百分数和上皮再形成的百分比= [1 - （面积上在第0天分析/区域的天）]的计算值×100 [<一个href="#B39">39]。在其中全层伤口被认为被完全关闭的天取为完全愈合的日子。此外，经测量为评估再上皮苏木精和曙红的图像染色的从最大的横截面而获得的每个伤口的载玻片数字获取，则（在两个上皮边缘之间的距离）的间隙的上皮。

2.8。离体和体内光学生物光学成像

离体和在活的有机体内使用Caliper生命科学公司(Caliper生命科学公司，Hopkinton, MA)的IVIS Lumina进行成像分析。对于离体成像，从荧光素酶表达的小鼠腹股沟FAD焊盘分离AT-SCS接种到透明底组织培养皿中并溶解在预热的组织培养基d荧光素（Caliper Life Sciences公司）的溶液中（温育150 μ克/ ml）的分析之前。对于在活的有机体内一个n一个lysis, mice were anesthetized with Avertin and D-luciferin dissolved in PBS (150 mg/kg body weight), was administered i.p. 10 minutes before analysis. Photons emitted from luciferase-expressing AT-SCs transplanted into the animals were collected with final accumulation times of 1 to 5 minutes, depending on the intensity of the bioluminescence emission. The same mice were analyzed at different time points after transplantation with the same procedure, providing longitudinal data of transplanted cells biodistribution and survival.

2.9。组织学分析

活组织切片在4%甲醛中固定48小时，石蜡包埋，连续切片(7)μm)垂直于伤口表面。每8个伤口切片进行苏木精和伊红染色以进行形态学分析。免疫组化对福尔马林固定的石蜡包埋组织进行GFP抗体(Abcam Ltd.， Cambridge, UK)，

2.10。统计分析

结果表示为平均值±SEM。数据分析和对照组和治疗组之间的比较采用统局（的GraphPad，圣地亚哥）来完成。差异显着性使用双尾学生评估-test对于不成对的数据;统计显着性水平设定在。

3。结果与讨论

3.1。体外AT-SCs单层培养中SDF-1过表达促进损伤修复

我们确定AT-SCs在an中具有修复潜力体外病灶修复测定来执行如先前所描述[<一个href="#B37">37]。在含有2毫米间隙的20% FCS中培养的AT-SCs在细胞单层上进行不到3天的实验。在无血清培养基中维持的非转导和模拟转导的AT-SCs不能修复划痕。非转导细胞表现优于模拟转导细胞(Ad-GFP)，可能与病毒暴露有关，但在诱导损伤48小时后差异无统计学意义。另一方面，腺病毒介导的SDF-1基因转移后48小时后，与未转染和模拟转染的AT-SCs相比，SDF-1基因转移后的细胞对病变的修复能力提高(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig1/" target="_blank">1)。

图1

体外损伤修复实验。 体外病变闭合(以第0天面积的%表示)病灶修复试验。Nontransduced AT-SCS（NT）或用表达GFP（的Ad-GFP）的腺病毒载体转导或表达SDF-1和GFP（的Ad-SDF-1）保持在0.1％BSA补充的无血清培养基。对照细胞在完全培养基（DMEM-20％FCS）中生长。数据表示为平均值±SEM，并一式三份进行实验。统计显着性水平设定在。无统计学显著差异的NT和Ad-GFP转导的组之间的评估。在48小时，病灶修复是Ad-SDF-1组中的与两个NT组（比较得到改善）和Ad-GFP（*)。第2天病灶区域有代表性的荧光显微照片(虚线)。原来放大40 x。

AT-SCS已经显示出表达对CXCR4的α-趋化因子受体的特定基质细胞衍生因子-1，其过度表达增加AT-SCS迁移和增殖[<一个href="#B40">40]。因此，这些结果表明，在病毒介导的基因转移后，SDF-1可能作为AT-SCs的自分泌因子，促进细胞增殖和迁移。

3.2。AT-SCS促进体内血管生成凝胶胶塞分析

我们发现，从脂肪组织中分离的间质部分含有能够分化为内皮样在基质胶塞测定结构[的细胞群<一个href="#B14">14]。为了进行这个实验中，我们分离从转基因小鼠的AT-SCS普遍表达GFP [<一个href="#B30">30.]，然后移植含有GFP阴性的动物中的GFP阳性细胞的插头。那时我们能够检测内皮样从植入GFP阳性AT-SCS衍生结构（图<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig2/" target="_blank">图2（b）），而我们未能检测到在对照小鼠相似的结构（图<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig2/" target="_blank">图2（a）)。在本实验条件下，99%以上的内皮样结构来自于gfp阳性细胞(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig2/" target="_blank">图2（d）)。我们还使用腺病毒模拟载体转染的AT-SCs和表达SDF-1的腺病毒载体转染的AT-SCs进行了实验。我们观察到，即使在血糖正常的情况下，过度表达SDF-1，内皮样结构的数量也略有改善(5%)(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig2/" target="_blank">2（H））;尽管在实验设置中使用以执行分析（，与对照组相比，差异无统计学意义(价值)。

(一)

(b)

(c)

（d）

（e）中

（F）

(g)

(h)

图2

体内血管生成凝胶塞实验。 从广泛表达gfp的小鼠中分离的AT-SCs与Cultrex混合，皮下注射到CD1受体。1周后，用马尾松三色染色法(b)和抗gfp免疫组化法(d)测定凝胶塞的毛细密度。对照组使用含生理盐水(a) - (c)的凝胶塞。植入凝胶塞的马尾松三色染色含有非条件无血清培养基(e)和AT-SCs培养的条件培养基(f);通过Ad-GFP (g)和Ad-SDF-1 (h)基因修饰AT-SCs, SDF-1过表达后内皮样结构的形成略有改善，但与对照组(Ad-GFP)差异无统计学意义(价值)。

从分离AT-SCs的相同动物身上获得相同数量的皮肤成纤维细胞的基质凝胶塞作为对照，但未能组织成内皮样结构(数据未显示)。

此外，我们还使用从整夜培养的AT-SCs中获得的条件培养基进行了基质塞实验，发现AT-SCs产生的可溶性因子可能促进血管生成(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig2/" target="_blank">图2（f）)。这是根据一些研究已证明，AT-SCS分泌血管生成分子的面板[<一个href="#B21">21，它们有可能，至少部分地，对我们和其他人观察到的伤口愈合的治疗效果负责。

总的来说，这些数据集表明，AT-SCS能够促进血管形成在活的有机体内通过参与血管样结构的组织和促血管生成因子的分泌进行基质凝胶分析。

3.3。AT-SCS移植促进伤口愈合的糖尿病动物

对于在活的有机体内的研究中，我们使用链脲霉素诱导CD1糖尿病小鼠接收关于背中线全层伤口。我们观察到，局部给药在7.5×10病灶部位⁵在糖尿病小鼠中的AT-SCS显著增强伤口愈合（图<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig3/" target="_blank">3.)。

(一)

(b)

图3

伤口愈合的糖尿病动物。 n AT-SCS的局部给药的作用在病灶部位。四组受伤糖尿病小鼠的盐溶液（盐水），AT-SCS未经遗传修饰（AT-SCS）或AT-SCS GFP（AT-SCS GFP）的腺病毒介导的基因转移后，和SDF-1（被处理AT-SCS SDF-1）。在创伤后的不同时间点，使用图像分析确定病灶的面积。再上皮被报告为初始伤口面积（A）的百分比。从来自每组的动物代表性图像在伤后（B）创伤（第0天）和在不同时间点之后立即服用。数据表示为平均值±SEM表示由误差条;=每组8-12个伤口。AT-SCs、AT-SCs GFP和AT-SCs SDF-1的值有显著差异(）相比，在用星号表示的时间点盐水组时。此外，在第3和5天，伤口闭合在AT-SCS SDF-1治疗的动物在与AT-SCS GFP组（相比改善)。

从脂肪组织中分离出的间充质细胞是细胞介导基因治疗的合适靶点，因为它们已被证明容易通过病毒介导的基因转移[<一个href="#B41">41]。然后，我们评估SDF-1，其下调在糖尿病伤口的病理生理学中起关键作用的过表达是否会导致AT-SCS介导治疗的更好的治疗轮廓。事实上，我们通过腺病毒介导的SDF-1基因转移到AT-SCS局部给药之前达到进一步改善。伤口面积和上皮差距在处理的动物显著减少。特别地，伤口闭合的损伤后3天的比例为在对照小鼠和41分别为58％，24，在接收AT-SCS和AT-SCS表达SDF-1的动物。在5天，值分别为45，68和78％之间。全厚伤口在7〜10天完全关闭所有AT-SCS治疗的小鼠，而在控制，完全愈合冲后不迟于14天实现。

通过大体检查和免疫组化分析，我们确定了在组织再生部位的gfp阳性细胞给药后几天(图)<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig4/" target="_blank">4)。使用进行了进一步的研究，以确定生物分布和施用的细胞的持久性在活的有机体内生物发光成像技术(见下文)。

(一)

(b)

(c)

（d）

（e）中

3.4。BLI跟踪移植的AT-SCs

后在活的有机体内给表达荧光素酶的AT-SCs，我们实时监测荧光素酶的表达在活的有机体内在整个动物成像，具有光照片一起，以提供解剖学参考。的信号的强度通过检测在活的有机体内成像可以精确量化，并与荧光素酶表达细胞的存在相关，因此与有效的细胞移植后给药。由于荧光素代谢需要ATP，只有表达荧光素酶的活细胞才能产生信号。对同一动物在不同时间点进行重复分析的能力使我们能够确定at - scs的生物分布和在创口处的移植的动力学。

AT-SCS从腹股沟时尚垫分离出表达荧光素酶的小鼠。数字<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig5/" target="_blank">5示出了源于BLI信号细胞在伤口部位放置在96孔细胞培养板中，并且在同一细胞的局部给药后的权利。的BLI信号的量化没有显示出与表达GFP和SDF-1的腺病毒载体转导的非转导的细胞和AT-SCS之间的任何统计学差异显著（图<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig5/" target="_blank">5）在给药时间。从放置在96孔组织培养和从相同的细胞给药后对小鼠的背部细胞中观察到在BLI信号的差异取决于，至少部分地基于在一个96孔的区域中的约3倍的差异相比活检穿孔的区域。

(一)

(b)

(c)

（d）

图5

表达荧光素酶的at - scs在0时刻的体外和体内成像。 请注意。 将新鲜分离的AT-SCS从荧光素酶表达小鼠进行腺病毒介导的基因转移（（a）中的非转导的;（b）中的Ad-模拟转导;（C）SDF-1转导的细胞）。在AT-SCS置于96孔细胞培养板，并进行BLI成像（每幅图的面板插入）。然后将相同的细胞进行背病变并重复BLI之后给予高血糖小鼠。面板（d）的信号的节目定量。The diameter of a well of a 96-well plate is 6.4 mm; the diameter of the biopsy punch used to induce wounding is 3.5 mm. Data are expressed as mean ± SEM indicated by error bars;为每个组。

为了确定输送细胞的生物分布，一些动物在伤口诱发和局部给药以表达荧光素酶AT-SCS的病变部位后，1，10，15天处死。BLI是以前和受伤区域的鼠标和解剖的牺牲之后进行。如图<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig6/" target="_blank">6，细胞主要位于病变部位，从递送位点的最小传播。此外，在朝向CCD照相机皮肤解剖组织进行BLI产生一个信号，一致地比用翻转片获得的一个下部（图<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig6/" target="_blank">6)。这反映了一个事实，即给予的细胞主要是促成了真皮和皮下组织再生，只在皮肤中的小部分嫁接。我们在皮肤区域和在甚至在第15天相应的皮下区域，当伤口愈合完全（图检测到正信号<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig6/" target="_blank">6（C））。这即使在完全愈合清楚地表明在再生组织移植和给予的细胞的持久性。

图6

在表达荧光素酶AT-SCS的伤口部位局部给药后生物分布。 局部给药后1 (a)、10 (b)和15 (c)天处死的代表性动物的BLI成像()。伤口周围的区域被excided和BLI与皮肤面对CCD照相机（A'，B'和C'）进行的两者以及在相反的方向（A''，B''和c'）。在所有时间点，细胞主要位于病变区域与局部给药的网站最小的蔓延。

施用的细胞，在第0天表示为BLI信号的百分比的植入的动力学报道上的图<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig7/" target="_blank">7，并且它如图观察到伤口愈合的动力学负相关<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig3/" target="_blank">3.。大多数与移植的细胞相关联的信号的被移植后第1天第3天之间丢失。的在第0天所观察到的强度的大约10％的值被保持从第3天到第10天，这表明细胞植入。虽然在较低的水平，BLI信号是在细胞给药后14天也可检测的，在组织再生的位点表明细胞植入。

(一)

(b)

图7

伤口局部给药后表达荧光素酶的at - scs的持续和移植。 糖尿病小鼠的荧光素酶表达小鼠中分离AT-SCS受伤后的治疗。纵向分析在不同时间点处理指示信号的持久性后整个伤口愈合的过程中执行通过BLI。从实验动物的代表图像在不同时间点（)。数据被表示为立即值的单元的局部给药（0天）后的百分比。值表示为平均值±SEM表示通过误差条。

给药后干细胞存活的显着下降是阻碍了细胞治疗方法的临床翻译的主要障碍。事实上，移植细胞的高达99％的可在移植的最初几天死于他们在转移宿主微环境的严酷条件。这主要特征在于氧气或营养底物的供不应求和通过大规模过量的自由基 [<一个href="#B42">42]。有几个策略，以促进供体细胞存活进行了评价[<一个href="#B43">43]。特别地，通过处理预处理间充质干细胞与重组SDF-1导致缺氧条件下增强的存活和增殖体外和在活的有机体内(<一个href="#B44">44]。

在SDF-1α/ CXCR4配体/受体轴调制几个关键生物学功能，包括增加的细胞生长，增殖，迁移，存活，抗凋亡，和转录激活。特别地，已经表明CXCR4的过表达增加了人体脂肪组织衍生的基质细胞的迁移和增殖[<一个href="#B40">40]。如图<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig3/" target="_blank">3.我们发现AT-SCS过量表达SDF-1促进糖尿病动物伤口愈合的那个移植。有趣的是，我们确定BLI信号之间在动物中表达接收相对于对照SDF-1 AT-SCS表达GFP，给药后第1天（图统计学差异显著<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig8/" target="_blank">8)。这表明施用的细胞在损害部位处在于SDF-1的过表达增强了存活/增殖在该时间点，产生有益的效果。尽管如此，无统计学在稍后的时间点（3，5，7，和14天），观察到两组间显著差异，这表明SDF-1的腺病毒介导的过表达未能改善在我们的实验模型长期细胞植入。然而，SDF-1的过表达可促进促愈效果真皮成纤维细胞和角质形成细胞周围病变部位[<一个href="#B12">12,<一个href="#B21">21]，从而导致在图观察到的改善的愈合<一个href="//www.newsama.com/journals/sci/2011/304562/fig3/" target="_blank">3.。

我们的研究结果表明，在病变部位AT-SCS施用改善伤口糖尿病动物几天内伤口愈合的诱导。BLI成像数据表明，施用的细胞的一小部分植入，并参与在病变部位修复的组织。在另一方面，植入的细胞的量可能太低完全解释组织再生的机制。此外，一些证据表明，AT-SC可以发挥其有益效果也可以通过自分泌作用促进自主profileration，并通过对真皮成纤维细胞旁分泌作用，keratonocytes周围病变部位[<一个href="#B21">21]。

4.结论

我们已经证明，AT-SCS的局部给药可改善受损的伤口在糖尿病小鼠愈合。此外，使用BLI，我们能够遵循生物分布和移植，生存和给予的细胞增殖的动力学，这证明了在再生组织相对固定后，即使完全愈合。此外，我们的数据表明，旨在促进SDF-1的过表达可进一步改善糖尿病伤口愈合受损移植AT-SCS的那伴随遗传操作。