脐带血造血干/祖细胞：当前挑战植入，感染，离体扩张

抽象

脐带血自20世纪80年代末起就成为骨髓造血移植的替代品。大量临床研究证实了脐带血的有效性。此外，脐带血中可能存在的不成熟细胞给HLA不匹配的受者提供了更多的选择，也允许使用非亲属供者的脐带血。然而，即使在脐血移植后，与造血系统恶性肿瘤相关的发病率和死亡率仍然相对较高。感染和复发是造血疾病患者脐血移植术后死亡的主要原因。最近，为了改善这些主要问题，已经采取了新的战略。建立更好的协议简单分离原始细胞和离体扩张也将是非常重要的。在这个简短的回顾中，我们讨论了与脐血移植的技术改进最近的几个有希望的结果。

1.脐带血（UCB），其为希望的来源的造血细胞用于移植

骨髓(BM)多年来一直用于治疗白血病等造血系统疾病。事实上，第一次BM灌注是在1957年进行的[1]。虽然大量患者的多项临床研究极大地提高了我们对BM移植的认识(如:[2-4)，这种方法仍然面临三个主要障碍。要找到理想的供体，如同卵的人类白细胞抗原(HLA-)兄弟姐妹，往往很困难。尽管这种类型的移植死亡率很高，但与hla匹配密切、不相关的供体是另一种选择。(2)受体发生移植物抗宿主病(GVHD)的频率很高，有的高达80-90% [3]。从无关供者骨髓移植是一种选择。然而，这是危险的，并且死亡率（估计为30-50％[4]）比在HLA匹配的情况下看到的更高。对于造血系统恶性肿瘤的治疗，自体不可用。（3）BM的分离需要侵入性操作，以及从感染病死率可高达50％。

BM不是造血细胞移植的唯一来源。自80年代后期，研究人员调查了使用脐带血（UCB）移植来替代BM移植的可行性。使用UCB第一造血重建报道于1989年[五]。HLA完全相同的供体来源UCB移植成功再造的患者患有范可尼贫血[五]。后续研究表明，UCB或胎盘血(以下简称“UCB”，因为其起源与UCB相似)是BM的有用替代品[6-8]。最初，UCB主要适用于儿童。然而，在2001年，一个大的多中心试验表明，UCB仍然是有效的成人造血重建[9]。虽然与UCB造血重建似乎是在成年患者由于年龄相关的并发症[更加困难8，10]和所需的细胞剂量，此试验显示从无关供体或HLA不匹配的供体仍然重构造血系统，其UCB。这一发现增加使用UCB作为血细胞用于移植源的普及。这篇综述将与造血干细胞（HSC）/造血祖细胞（HPC）的讨论开始。这将在随后的移植如何可通过在细胞培养物/生物工程的进展来改善的讨论。大规模培养系统和植入进一步的改进将是临床应用UCB移植尤为重要。

2.HSCs/HPCs的发现和富集

1978年，Meulen小组发现人类UCB中存在干细胞[11]。其他组别随后亦有类似报告[12，13]。Meulen的的组报道的SC的数量在8明显减少至10日龄的婴儿[11]，由另一个组此后不久证实这一发现[14]。这表明，造血干细胞的一个显着减少在UCB老化时发生。因此，UCB细胞应被处理并尽可能早地存储。

bmb或UCB的多能细胞在琼脂中生长时可以产生多种不同的造血细胞集落。1980年，Kirshner和Goldberg首次比较了三种不同来源的干细胞/祖细胞(BM、外周血和UCB)产生的细胞[12并注意到UCB细胞产生的不同细胞。BM来源的菌落和UCB来源的菌落之间存在两个显著差异:(1)UCB产生的嗜酸性粒细胞比例更低(约减少2-3倍)，(2)巨噬细胞和粒细胞更多[12]。BM和UCB中干细胞/祖细胞的鉴定和比较仍在继续，可能会出现全新的趋势。然而，这项早期研究明确指出了BM和UCB的主要区别。

Weismann小组最早从BM中分离纯化小鼠HSCs [15]。到那时，研究已经表明存在能够再生所有造血谱系的细胞。魏斯曼的小组纯化了一个Thy-1^低林^-本来就⁺造血干细胞的部分。后来，基于123罗丹明染色显示林^-Sca⁺细胞是异质的[16]，这表明初始标准可能不足以净化最原始的造血干细胞。因为造血干细胞或原始的HPC只构成总UCB的非常小的一部分，识别用于原始造血干细胞/高性能计算机离体扩张是非常重要的。早在20世纪90年代初，CD34就已经被认为是富集HSCs的一种有用的细胞表面抗原(在[17])。大量的研究已经解决了额外标记的使用，一些研究发现了差异，表明CD34⁺(请参阅本节后面各段的进一步讨论)[18-20.]。然而,CD34⁺CD38^-是用于富集造血干细胞的原始/高性能计算机[广泛接受的标准21]。的c-Kit（干细胞因子受体）22，23]和THY-1 / CD90 [24]也被提议作为原始的高性能计算机的细胞表面标志物，但他们没有得到很好的接受。CD34⁺CD38^-,林^-和大概的Sca⁺可能是从UCB中选择高富集的原始馏分的合理标准。在最近的一项研究中，CD150^-CD48^-林^-被用于富集从小鼠外周血细胞的HSC [25]。新的研究可能使用更好、更更新的标准从UCB细胞中富集HSC/HPC部分;然而，这些选择参数是否有助于识别人类UCB或其他来源的最原始的造血干细胞尚不清楚。Broxmeyer的综述为当前从UCB中分离HSCs/HPCs的标准方案提供了有用的指南[26]。

如前所述，存在争议过CD34的表达是否可靠，可用于造血干细胞的选择。CD34^-和CD34⁺细胞可能具有可互换的表型(在[27])。在CD34的细胞表面表达的差异可以由以下假设：CD34在早期阶段主要表达于细胞内区室进行说明。BM CD34^-据报道细胞生成CD34⁺移植后的细胞。这可以通过的想法，支持CD34^{低/ -}细胞家朝向BM，其中所述细胞表现出获得CD34 [的细胞表面表达20.]。尽管一些论文描述潜在原始CD34^-细胞 [18-20.，这些细胞在细胞内是否表达CD34尚不清楚[28]。上述不确定性可能会排除CD34⁺被用作在制备原始细胞的临床应用的黄金标准的表型。

在目前的HSC/HPC研究中，几种抗体被结合来选择原始细胞。这为实验室水平的研究提供了非常有用的信息。然而，在上面讨论的一些例子中，细胞可能获得或失去表型期间离体文化。因此，在临床环境中，其他方法可能更方便。使用基于化学或酶活性的选择将是一个巨大的优势，如果可用，并将使用抗体，降低生产成本。有趣的是，HPCs已被证明能够高度表达胞质醛脱氢酶(ALDH) [29]。风暴等。成功地合成为一个ALDH荧光染料（BODIPY-）缀合的衬底，其由ALDH [在酶裂解产生的荧光三十]。使用这种新颖的工具，它们能够进行高性能计算机的一个相对简单的，荧光染料基的选择。

探索标记最好的一组隔离窝藏移植最有潜力的细胞是非常重要的。然而，使用多种细胞表面抗原的组合对造血干细胞的选择/高性能计算机将大大减少最终级分的细胞的数目。追求进一步的标记以获得绝对纯HSC / HPC馏分可能不是必要的。简单，CD34阳性选择仍然产生具有足够的扩展能力的细胞[31]。此外，应该指出的是，“原始”细胞和“增殖”细胞不一定具有相同的特性，最重要的目标可能是确保有足够的能力进行扩张和增殖体内移植。

3.移植

3.1。UCB细胞未成熟

由于BM移植比UCB移植有更长的历史，因此UCB移植的基本问题仍然存在。例如，“UCB有什么特别之处，UCB (HSCs/HPCs)有什么优势?”“临床试验基本表明，UCB移植引起的GVHD和移植物衰竭较少[6-9，32，33]。当UCB被用作造血干细胞/造血干细胞的来源时，接受者似乎对hla不匹配不那么敏感。

一个临床上有趣的事实是，UCB骨髓祖细胞具有相对的化学抗逆性[34]。这是非常重要的，因为血液细胞移植经常结合强化化疗来重建宿主的免疫系统。使用抗化疗UCB细胞进行更密集的化疗，可以避免造血系统恶性肿瘤治疗后出现的疾病复发。

如果UCB细胞比BM细胞更有潜力植入接受者体内，那么其潜在机制是什么?T细胞的免疫潜能被认为是移植造血干细胞长期移植成功的关键决定因素之一。Harris等人的一项研究首次系统测量了大量样本，研究显示，虽然IL-2刺激仍可诱导NK细胞介导的靶细胞裂解，但UCB细胞与外周血细胞相比无反应[35]。另据报道T细胞受体表达的稍低的水平。研究人员发现，脐血所含CD3^-外周血中不存在的细胞[35]。此外，虽然外周血和UCB的B细胞比例相当，但UCB中约有50%的B细胞为CD5⁺，未成熟的B细胞的标记物[35]。这一发现使作者认为UCB淋巴细胞在功能上是不成熟的。UCB细胞比BM或外周血细胞更不容易引起GVHD。有趣的是，UCB对NK细胞耐药肿瘤细胞的细胞毒性也较低。这一发现需要仔细研究，因为造血细胞中抗肿瘤活性的降低会增加造血恶性肿瘤复发的风险。也就是说，UCB淋巴细胞的功能不成熟可能是一把“双刃剑”。UCB移植在受体中明显产生更好的反应，如降低GVHD;然而，长期使用UCB的临床效果可能并不比其他血源的效果好。

虽然t细胞缺失似乎对UCB移植没有必要[36]，的接受UCB移植仍然遇到的问题，例如GVHD和存活率相对较差，这可能是由于造血干细胞的比例更高或造血细胞的不成熟在UCB [患者亚群8，10]。小剂量的移植细胞也被认为与移植物排斥有关。祖细胞含量对移植的成功可能特别重要[37]。可能的解决方案将在章节中讨论4。

3.2。UCB移植和再生潜力的动物研究

UCB，BM和外周血细胞的比较表明，UCB细胞从后两种起源嫁接比细胞更好，当移植到非肥胖/重症联合免疫缺陷（NOD / SCID）小鼠。体外和体内Kim等人进行的研究。透露，UCB来源的CD34⁺细胞不仅比bm来源的CD34具有更好的集落形成能力⁺细胞，但也显示出显著更好地植入在NOD / SCID小鼠38]。本研究一个非常有趣的发现是，总UCB细胞移植小鼠的嵌合体水平要优于部分纯化的UCB细胞(CD34)⁺细胞级分）[38]。这一发现意味着CD34^-部分可能包含一些支持移植细胞移植的细胞。如果这一发现适用于人类，那么基于细胞表面CD34的细胞富集对于移植来说可能不是必要的。有趣的是，UCB被认为含有大量的多能性和CD34⁺CD38^-细胞比BM。霍夫曼的研究小组开发出一种体内竞争试验分析UCB细胞的BM再生潜力。他们建立了植入人类胎儿骨的小鼠[39]。照射后，hla不匹配的UCB或成体BM细胞分别或联合注射。UCB和成年bmcd34⁺细胞显示相似的多谱系造血当UCB或BM细胞的相等数目的单独注射。然而，UCB outcompeted BM细胞在再植BM当两个被同时注入[39]。这一结果表明UCB造血干/高性能计算机具有优越的嫁接能力和重新填充。因此，在动物模型系统研究支持这一想法，UCB是造血细胞比BM的优良来源。

4.提高UCB移植结果的途径

4.1。植入

除了增加细胞的剂量，加速造血干细胞的归巢/高性能计算机对造血组织可大大改善植入。虽然底层HSC / HPC归巢的精确分子机制仍不清楚，趋化因子，基质衍生因子-1α(SDF-1α)，已被证明在骨髓移植的HSCs中发挥重要作用[40]。体外实验表明，该因子诱导UCB祖细胞的趋化性以及BM细胞[41]。尽管如此体外趋化活性，临床试验表明，UCB移植后的中性粒细胞恢复慢于BM移植后[32，36]，这可能反映UCB细胞比骨髓细胞向BM移植后的较慢迁移的发现。UCB细胞的功能不成熟可能使这些细胞更难以迅速家到正确的位置（即，BM）。这也许可以解释为何UCB移植需要更长的时间来证明有益的影响。有趣的是，细胞表面二肽基肽，CD26，建议负调节体内归巢和HSC的植入[42]。该蛋白酶可以从几个细胞因子裂解N-末端二肽，包括趋化因子SDF-1（CXCL12）[43]。这种蛋白水解抑制了SDF-1趋化的生物活性[44]。此外，由同一组最近的一项研究表明，CD26的百分比⁺细胞是在未成熟越高，原始细胞（CD34⁺CD38^-)而不是成熟细胞[45]。这些结果表明CD26的抑制可能是改善临床结果有希望的策略。增强HSC / HPC归巢可减少移植所需的细胞剂量。

4.2。感染和复发

感染是移植术后的主要并发症。在一项研究中，所有患者在移植后至少经历了一次感染[46]。UCB移植的一个特征是发生相对于BM移植缓慢中性粒细胞恢复[36]。虽然增加输血细胞的剂量肯定缩短中性粒细胞恢复时间[8，这可能不是一个现实的解决方案，因为UCB细胞的低可用性。遗憾的是，对粒细胞集落刺激因子或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子患者的治疗并不能有效改善中性粒细胞的恢复[32]。目前尚不清楚，缓慢的中性粒细胞恢复是否会增加感染的发病率和死亡率。然而，中性粒细胞或其前体的同时移植可能改善临床结果。事实上，在一项研究中，这种联合移植加速了中性粒细胞的恢复，并减少了细菌和真菌感染[47]。因为血液样本中中性粒细胞的数量有限，离体嗜中性粒细胞的膨胀是必需的。很少有研究解决这个问题。最近，由蒂明斯和同事进行，取得了非常令人鼓舞对于临床应用中性粒细胞混注的结果。作者在音量增大成功地扩大在大规模生物反应器功能的嗜中性粒细胞，以10 L [48]。扩展显示中性粒细胞呼吸爆发活动，产生活性氧，杀死真菌，白色念珠菌。所使用的作者的系统能够处理的培养体积高达500 L [的48]。

最近，一种新的策略已被引入到战斗感染和白血病复发，导致移植受者死亡的主要因素。Michlethwaite和他的同事已经产生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）携带抗病毒和抗白血病活性[49]。将逆转录病毒编码的单链抗cd19片段导入从外周血和UCB制备的T细胞中。由此产生的ctl对b细胞急性淋巴细胞白血病和细胞系显示了特异性和强的细胞溶解活性，显示了其在对抗白血病复发和病毒感染与血液移植的临床潜力。尽管引入逆转录病毒编码的嵌合基因可能会带来一些担忧，但这一策略非常直接，研究结果表明，这种方法有望在未来减少感染和白血病复发相关的患者死亡率。

5.扩张

5.1。培养基添加物用于扩展

有限的HSCs/HPCs数量是血液移植的主要障碍。在可移植细胞数量增加到成人患者所需数量之前，UCB的应用应仅限于儿科患者。从UCB中获取大量原始单元需要有效的方法。因此，开发简单和现实的协议，以工业规模扩大原始细胞在UCB是必要的。

通常，使用动物产品如胎牛血清是不可避免的SCs繁殖。由于HSC领域已经建立，无血清培养系统可用于扩大HSCs/HPCs，但仍有改进的空间。通常使用几种细胞因子的组合离体造血干细胞/高性能计算机的文化。虽然实验室间的确切组合而不同，但通常由几个细胞因子例如Flt3的/ FLK2配体的[50，51，干细胞因子(SCF) [52，53，白细胞介素-3 (IL-3) [54-56]，IL-6 [57和血小板生成素[58-60]。在这些细胞因子中，作为一种补充，SCF的历史可能最长。Flt3/Flk2配体可能比SCF更有效[61]。Flt3配体基因敲除小鼠表现出的高性能计算机[早期发展的严重问题62，这表明在培养基中加入Flt3/Flk2配体是必要的。有趣的是，据报道gp130信号(通过IL-6)协同增强SCF的作用[63]。另据报道了Flt3配同样的趋势[64]。因此，gp130信号似乎是支持的。应该注意的是，单独使用IL-6并没有显示有效[54，63，64]。IL-3的效果，可能需要仔细评估，因为IL-3的添加被报道抑制集落形成细胞的数量[65]。它也减少了造血干细胞[的复融活动65]。其它细胞因子，例如IL-7和IL-11，也被建议，以促进造血干细胞/高性能计算机的增殖。IL-7是在促进T细胞膨胀可能更有效[66]。因此，它可能不适合扩大原始HSC/HPC种群。t细胞数量的不平衡增长离体培养可能增加移植物排斥反应的风险。IL-11可能不是必需的，因为在培养10周后，IL-11的缺失并不会导致显著差异[67]。虽然目前一些供应商可以批量提供重组细胞因子，但细胞因子的使用仍然增加了扩张的成本。使用几种细胞因子的结合也使我们很难知道促进HSCs/HPCs扩增的确切分子机制。进一步的证据表明，以饲料层为基础的共培养系统可能也有利于离体文化。例如，猪微血管内皮细胞（PMVECs）已报道是有效的离体UCB细胞的扩增[68]。在几项针对不同类型的饲养层培养体系的研究中，Rosler等人的研究表明，PMVEC共培养体系在CD34扩增方面比无基质培养体系(补充细胞因子)有效5倍和241倍⁺和CD34⁺CD38^-(图2在[39])。然而，共培养系统可能不适合大规模生产细胞。新的培养方法或补充应该提供更多的优势，同时保持简单。下面讨论的两项最新研究可能会在这方面带来重要突破离体扩张的肝星状细胞/手持电脑。

Notch信号已被提出作为一个目标，以促进造血干细胞的有效的扩展。人类同源果蝇缺口最初发现在CD34高表达的基因⁺造血细胞(69]。固定化Notch配体的孵育显著增加(约100倍)CD34的数量⁺NOD/SCID小鼠的细胞和增强再生能力[70]。虽然Notch信号显示出发起淋巴分化和增强自我更新，使用NOD / SCID小鼠中再增殖测定法清楚地表明，Notch配体孵育细胞具有更大的能力，以重构主骨髓。Notch配体处理的细胞注射到小鼠中也能够胸腺植入，其通常是不成功的[的70]。最近，该小组提供了令人鼓舞的数据，包括一项一期试验的初步结果，显示CD34⁺与Notch膨胀UCB祖细胞配体嫁接优于对照细胞[71]。本研究的重要观察之一是Notch配体扩张细胞的移植大大缩短了中性粒细胞的恢复时间[71]，该功能被认为预测成功植入。由于临床试验正在进行中，Notch配体介导离体扩张可能很快改变临床方案。一个潜在的缺陷是，这项研究的成功结果是使用固定化的Delta1融合蛋白获得的。值得注意的是，在一定条件下(如配体密度高时)，delta1介导的Notch激活可诱导细胞凋亡[72]。开发更有效的Delta1配体，降低细胞毒性，将是理想的Notch配体介导的大规模扩增。

生物化合物，如生长因子/细胞因子，可能不是唯一的化合物可以用于促进扩张。最近的一项研究表明，一种化合物也可用于这一目的[73]。化学化合物将优于生物化合物，因为生产成本低，质量控制更容易。基于显微镜的高通量筛选已经确定芳烃受体拮抗剂作为潜在的药物候选促进离体扩展养恤金申领中心[73]。目前，这些化合物需要细胞因子鸡尾酒。然而，这一发现的进一步发展可能最终导致化学定义培养基用于临床规模的造血干细胞的生产。表格1显示目前可用的补充剂(包括饲养细胞培养的补充剂)离体造血干细胞/高性能计算机和不久的膨胀总结了优点和缺点。

5.2。大规模培养体系

传统培养瓶和透气血袋[31]是用于造血细胞的扩增的最广泛使用的系统。为BM高性能计算机的第一自动化生物反应器培养系统在1993年[被描述74]。第一种系统使用连续灌注装置，该装置与注射泵相连，允许提供新鲜细胞培养基。这个系统，加上补充，允许粒细胞-巨噬细胞祖细胞增加30倍;然而，它对其他祖细胞的效果较差[74]。优点/缺点和其他因素(如氧气，pH值，剪应力)在Nielsen的综述中得到了很好的总结。75]。近来，被用于旋转壁容器离体UCB细胞的扩增[76]。虽然细胞总数增加了435倍，但CD34的扩增⁺细胞大约是30倍[76]。在CD34由于简单特氟隆细胞培养袋产生的平均膨胀113倍⁺细胞 [31]，进一步的改进应探索更有效的大规模培养。

6.UCB细胞的其他潜在应用

除了用于治疗造血系统恶性肿瘤外，SC移植还被用于改善创伤后的恢复和加速伤口愈合。这些移植是用间充质干细胞(MSCs)进行的。然而，UCB细胞的异质性(内皮祖细胞、间充质干细胞和造血干细胞/造血干细胞的混合系统)可能有助于创伤等情况的全身治疗。据我们所知，没有确凿的证据表明脐带血HSCs/HPCs对伤口愈合有效。然而，有一例报告使用了CD34⁺脐带血细胞表明，脐带血的SC的应用是临床感兴趣的[77]。作者还表明脐带血细胞可以与纤维蛋白凝胶混合，纤维蛋白凝胶是一种在临床环境中广泛应用于伤口细胞的材料。进一步的研究将是必要的，看看脐带血干细胞是否对伤口愈合有效。脐带血中的非间充质细胞(如，HSCs/HPCs) play a major role in improving wound healing is not clear. A small fraction of MSCs present in cord blood may predominantly participate in wound healing. At the very least, UCB likely possesses good potential to repair vascular networks [78]。因为细胞培养系统(例如。，serum-free culture) have been relatively well established to comply with FDA regulations, UCB cells are readily available for potential use in the treatment of traumatic injuries and burn.

7.结束语

虽然UCB细胞的移植和移植后的临床结果很有希望，但仍有几个方面需要改进。首先，感染(主要是细菌)导致的死亡率接近50%，无论是BM移植还是UCB移植，这一点都有待改善。其次，UCB在疾病复发方面可能有稍高的风险。以降低急性移植物抗宿主病的风险。一些新的策略(中性粒细胞共输注[47和基因改造的细胞毒性T细胞[49]）已发展到挑战这些威胁生命的事件（感染和复发）移植后发生的。此外，最近的研究已经证明非常有前途的，令人振奋的数据，可能是适用于在不久的将来临床设置。例如，Notch信号传导的配体[71]和芳基烃受体拮抗剂[73]出现作为可用于建立一个更美好，更简单的新工具离体细胞培养(表1)。这些补充剂可能会改变目前使用的细胞因子或以饲养细胞为基础的培养系统;然而，用这些新工具替代细胞因子鸡尾酒可能需要一段时间。另一方面，大规模的文化系统可能需要进一步完善。生物工程领域的尖端技术的不断融合将有助于开发优良的培养设备。高效的大规模培养有望使UCB成为BM的替代品。和明确的离体扩展协议，UCB很可能“岩石”的血液细胞移植领域。

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