成纤维细胞生长因子-2增强人骨髓间充质基质细胞的扩张，而不减弱其免疫抑制潜力

抽象

异基因造血干细胞移植是许多恶性血液病的主要治疗方法。它的潜力依赖于贪污与-与移植物相关的肿瘤效应与宿主疾病。间充质基质细胞(MSCs)具有免疫调节特性，使其成为有吸引力的治疗选择。我们评估了在体外来自5个供体的人骨髓间充质干细胞的免疫抑制活性增加了13代，有或没有FGF-2。FGF-2的补充使第7代和第13代的扩增分别增加了3500倍和24万倍。在不同条件下，传代匹配细胞增殖的培养基在免疫抑制活性上没有差异，但经fgf处理的间充质干细胞的培养基优于群体双配对对照。三种制剂的免疫抑制活性保持不变，但两种制剂的免疫抑制活性随膨胀而降低。FGF-2诱导的增殖并没有导致免疫抑制活性的丧失。然而，由于免疫抑制活性未被持续保存，必须谨慎行事，以确保细胞在广泛扩张后具有足够的活性。

1.介绍

异基因造血干细胞移植是治疗许多恶性血液病的唯一方法。异体造血干细胞移植的部分疗效是基于移植物与-肿瘤(GVT)效应，通过免疫机制清除残留的恶性细胞。不幸的是，GVT与移植物的发育密切相关与-宿主病(GVHD) [1]，它是移植相关死亡率的主要原因之一[2]。不到一半的严重急性GVHD患者对一线类固醇治疗有反应[3.,4]。类固醇耐药的GVHD患者需要二次治疗，这些患者中只有一半有反应，总体生存率较差[2,5]。因此，迫切需要新的治疗方法来预防和治疗GVHD。细胞疗法正在成为治疗甚至预防免疫异常疾病如GVHD的有前途的方法。

间充质基质细胞(Mesenchymal基质细胞，MSCs)是一种非造血多能细胞，能够分化为间充质和非间充质细胞谱系[6- - - - - -8]。的MSC也产生细胞因子，趋化因子和细胞外基质蛋白质，其支持在体外造血干细胞(HSC)的存活、增殖和促进在活的有机体内HSC植入[9]。大量证据表明，间充质干细胞能够抑制t淋巴细胞的活化和增殖在体外(10- - - - - -14]。此外，间充质干细胞似乎具有免疫特权，逃避免疫监测，在再次挑战时仅引起微弱反应[15,16]。这些特性使蜂窝治疗药物的MSCs非常有吸引力[17,18]。

人间充质干细胞(hMSC)制剂具有显著的增殖潜力，尽管这种潜力是可变的和有限的[19]。这种变异可能是由于外源性因素造成的，例如获取骨髓的方法[20.- - - - - -24，使用的血清批次的细节，以及捐献者的年龄等内在因素[21,25]。尽管他们的高增殖潜能，丰富的文化扩张可能会导致分化潜能的损失和衰老的发生[21]。有趣的是，潜在的衰老相关的损失不一般化;例如，间充质干通过广泛的传代培养维持其成骨潜能[20.,21，但失去了分化为脂肪细胞的能力[21]当他们接近衰老。他们分化为软骨细胞的能力在前面段落[丢失26]。

一些已发表的报告表明，成纤维细胞生长因子-2 (FGF-2)对间充质干细胞具有显著的有丝分裂作用，同时增强其三系(骨、软骨、脂肪)分化能力[27- - - - - -32]。软骨发生，可能是骨髓间充质干细胞中最容易丢失的分化潜能在体外在添加fgf -2的培养基中扩增尤其能改善培养效果[30.,31]。

然而，对于hMSCs的免疫调节活性的维持或丧失，以及添加FGF-2可能对该MSC特性的影响，我们知之甚少。这些实验的目的是表征MSCs扩增的免疫抑制活性在体外在不同的时间段内添加和不添加FGF-2，如上所述，已经证明FGF-2对维持其他hMSC功能有益。

2.材料和方法

所有的细胞都是从凯斯西储大学综合癌症中心的造血干细胞核心设施中分离出来的，在获得机构审查委员会批准的协议条件下获得了知情同意。从采集的外周血中分离出外周血单核细胞(PBMCs)，置于肝素化采血管(BD, Franklin Lakes, NJ)中。从髂后上嵴获得的骨髓抽吸物中分离出人MCSs，使用预肝素化20ml注射器(BD)。这些研究中使用的PBMCs和hMSCs是从不同的、不相关的供体中分离出来的。

2.1。人PBMC的分离

在这些研究中使用了10种人PBMC制剂。血液被仔细地分层在Ficoll (GE Healthcare, Pisctatway, NJ)上，试管在800×g的情况下不刹车离心30分钟。离心后，用无菌塑料吸管吸出单核细胞层，转移到新鲜的50 mL锥形管(BD)中。PBMCs用磷酸盐缓冲盐水(PBS, Invitrogen公司，Carlsbad, CA)洗涤两次，计数，然后在完整的由RPMI 1640 (Invitrogen公司)组成的含10%热失活胎牛血清(FBS, Invitrogen公司)的Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基中复苏。

2.2。人骨髓间充质干细胞的分离

本研究使用了五种hMSC制剂。建立人骨髓间充质干细胞培养的程序遵循先前发表的方法[33,34]。简单地说，用含低葡萄糖的杜尔贝科改良Eagle 's培养基(DMEM-LG, Invitrogen公司)和10%胎牛血清(胎牛血清)的对照培养基(Hyclone, Logan, UT)清洗骨髓抽吸物[34]。血清批选择是在购买新一批血清之前进行的一项标准程序;所有实验均使用单批血清进行。然后按Percoll (Sigma Chemical Co.， St. Louis, MO)密度梯度离心分离单核细胞。用对照培养基清洗单核细胞，并以密度 cells/cm²在对照培养基中建立原代培养。细胞培养在37℃、95%空气、5% CO的湿化气氛中进行₂。

2.3。成立学习小组

在第一个培养基变化时(第4天)，以及之后的每一个培养基变化中，一部分板接受对照培养基，其余板接受同样的培养基，补充10 ng/mL的FGF-2 (Peprotech, Rocky Hill, NJ)。剂量的选择是根据以前的研究[31]。培养基每周喂两次。

2.4。扩大hMSCs

hMSCs必须在细胞融合前进行继代培养，以保持其指数速度生长，并防止自发分化或丧失分化潜能[6,35]。通常，当培养物达到80 - 90%融合时传代。原代培养通常在14±3天继代培养。随后，细胞大约每7±2天传代一次。分配到不同研究组(对照组或fgf处理组)的板同时进行继代培养，由于之前报道的细胞增殖和细胞大小的差异，治疗组的融合程度不同[31]。在所有的情况下，控制文化比在传代培养的时间他们的FGF-处理同事少汇合。将细胞通过胰蛋白酶消化进行传代培养，计数并重新接种在4.5×10^3.细胞每厘米²。

2.5。低温贮藏的hMSCs

传代细胞200×g离心5分钟;丢弃上清液，在由90%胎牛血清(Invitrogen)和10% DMSO (Sigma Chemical Co.)组成的密度为10的冷冻培养基中重悬细胞⁶细胞/毫升。细胞被放入低温贮藏瓶中(Thermo Fisher Scientific，罗切斯特，NY)，瓶放入冷冻容器中(Thermo Fisher Scientific)，容器放置在−80℃过夜。然后，小瓶被转移到液氮冰箱的气相。

2.6。低温保存hMSCs的回收

瓶含有大约冷冻保存的细胞在37℃水浴中迅速解冻，并转移到15 mL的锥形试管中，根据情况，其中包含5 mL对照或添加fgf的培养基。200×g离心5分钟。离心后弃上清，在对照或添加fgf的培养基中重悬细胞，以4.5×10的浓度接种^3.细胞每厘米²。

2.7。表征hMSCs

hMSC表型通过正向和侧向散射和单克隆抗体(MAb)染色(CD45)证实^-,CD73⁺CD105,⁺)。简单地说，大约500,000个hMSCs被洗涤并重悬在含5% EDTA的1%胎牛血清的HBSS中。hMSCs与异硫氰酸荧光素(FITC)共轭抗cd45单克隆抗体(BD)、藻红素(PE)共轭抗cd73单克隆抗体(BD)和异藻蓝素(APC)共轭抗cd105单克隆抗体(eBioscience, San Diego, CA)孵育。4℃孵育30分钟后，mab标记的细胞洗涤三次，然后固定在2%多聚甲醛中进行分析。同型对照免疫球蛋白作为阴性对照染色。每个偶联单抗染色条件下至少分析20,000个事件。

评估其成软骨潜能[36- - - - - -38，传代细胞在化学定义的成软骨培养基中重悬。Aliquots含2.5×10⁵ cells were placed in polypropylene multiwell plates, centrifuged at 500 ×g, and placed in the incubator. Medium was changed three times per week. On days 7, 14, and 21 aggregates were harvested and processed for histologic evaluation.

以验证其成骨潜能[20.,39,40]的hMSC分别以5×10孔的密度接种^3. cells/cm²在对照培养基中放置过夜。第二天，用成骨培养基替代培养基。培养基每周更换两次。骨培养进一步补充2毫米β一天10.一式三份培养甘油磷酸盐起始染色钙沉积（冯科萨）41]上天14，21，和28。

的hMSCs的脂肪细胞的潜力也被测试[42]。含有2.5×10传代的细胞的等分试样⁵ cells were placed in polypropylene multiwell plates in adipogenic induction medium in multiwell plates, centrifuged at 500 ×g, and placed in the incubator. Medium was changed three times per week. On day 10, the medium was replaced with adipogenic maintenance medium. Cells were harvested for histologic analysis on days 7, 14, and 21.

2.8。被hMSC条件培养基的产生

将不同传代数的hMSCs以15×10的密度接种到6孔板(BD)中^3. cells/cm²在完全的hMSC介质中。过夜孵育后，取出培养基，加入2 ml含PBMCs(0.5×10)的完全RPMI⁶ cells/mL) or interleukin-1 beta (IL-1β) (5 pg/mL, Peprotech)。对照井只接收到完整的RPMI。另一组对照组不孵育hMSCs，但仍接受PBMCs或IL-1β。孵育24小时后，收集条件培养液到2 ml的微离心管中，12000×g离心10分钟，去除剩余细胞。然后将无细胞上清转移到干净的微离心管中，使用新鲜的或在−80℃冷冻的上清供以后使用。

2.9。细胞膨胀评估

扩张阶段的所有细胞计数都是在胰酶处理的细胞悬浮液上手工进行的，使用纽鲍尔血细胞计数仪进行三倍计数。细胞数量翻倍的计算方法是:用某一传代结束时获得的细胞数量除以播种的细胞数量的以2为底的对数。

对于原代培养物中，形成在原代培养的菌落数，我们使用作为分母假设一个菌落从一个MSC的。

2.10。干扰素γELISPOT测定

酶联免疫吸附点测定(ELISpot)测试hMSCs及其条件培养基的免疫抑制活性[43]。ELISpot分析允许可视化个体反应细胞的分泌产物;在试验中产生的每个点代表一个反应细胞。因此，该检测提供了定性(免疫蛋白类型)和定量(应答细胞数量)信息。ELISpot检测是高度敏感的，因为产物在被上清稀释前，在分泌细胞周围被邻近细胞的受体捕获，或降解。该方法最近越来越受欢迎，尤其是作为细胞毒性t细胞反应的替代方法，这在很大程度上是因为它既可靠又高度敏感[44]。

九十六个孔ELISPOT板（Millipore，比尔里卡，MA）用抗人干扰素γ（IFNγ)抗体(Pierce, Rockford, IL);100年μL抗体溶液(4μg/mL in PBS)分别加入板的96孔中，在冰箱中培养过夜。PBS洗涤后，用完整的RPMI在37℃下封闭2小时。然后这些井得到150口μ完全RPMI（对照孔）或150 L的 μL(任意一个10⁶ cells/mL hMSC suspension or hMSC-conditioned medium (experimental wells). Then, 25 μ将完全RPMI的L加到阴性对照孔，25μL植物血凝素(PHA, Sigma化学Co)溶液(40μ将完全RPMI中的g/mL加入实验孔和阳性对照孔中。一个25 -μL PBMC悬浮液(6×10)⁶ cells/mL) was finally added to each well, and the plate was incubated for 24 hours at 37°C. After the incubation, the plate was washed with PBS + 0.05% Tween 20 (Sigma Chemical Co.). Biotinylated anti-IFNγ抗体(皮尔斯)(2μ加入g/mL PBS + 0.05%吐温20 + 1% BSA (Sigma Chemical Co.)， 37℃孵育2小时。用PBS + 0.05%吐温20洗涤后，加入以PBS + 0.05%吐温20 + 1% BSA稀释1:10 00的Streptavidin-Horseradish过氧化物酶(Dako, Glostrup, Denmark)孵育1小时。PBS + 0.05%吐温20洗涤3次后，PBS 4次洗涤IFNγ用3-氨基9-乙基咔唑(3-amino-9-乙基咔唑(Pierce)制备阳性斑点。然后用自来水停止反应，让盘子在黑暗中干燥。用计算机辅助的ELISpot分析仪(Cellular Technology Inc.， Cleveland, OH)对这些板进行分析。抑制率是通过直接比较与相应的阳性对照上述。

2.11。统计分析

增殖率差异及PBMC与IL-1差异有统计学意义β刺激物通过配对确定t测试。通过单因素重复测量、方差分析和配对分析分析培养时间对免疫抑制活性的影响t-通过测试来识别文章之间的差异。对补充FGF的效果进行配对分析t-tests和差异考虑显著P值。

3.结果

3.1。细胞扩增

如在先前的研究中，扩大的hMSC在FGF-2的存在下表现出更高的增殖率低于对照条件[展开31]。群体倍增时间为FGF-2的存在下膨胀的hMSC在任何通道始终比对照条件下扩增的细胞的缩短（如图中生长曲线的斜率所示1。在第13代中，对照组间充质干细胞的数量平均翻倍(26.3±4.7)倍，而fgf处理的细胞数量平均翻倍(44.2±3.9)倍。经过fgf处理的hMSCs在第6通道大约35天内达到28.0±2.6 PDs(对照组细胞的最大扩张)。对照组或fgf处理的细胞同时进行继代培养，导致不同程度的融合，这是细胞增殖和细胞大小差异的结果[31]。在转代培养的任何时候，对照组的培养都没有比处理过fgf的培养基更合流。

3.2。电池特性

从骨髓分离的hMSCs表现出多能hMSCs的典型特征[45]，即，特征形态，表面标志物分布（未示出），和三系分化潜能（图2)。

3.3。被hMSC条件培养基的免疫调节活性的评价

从PBMC刺激的hMSC的条件培养基显示出更高的活性比PBMC刺激的hMSC本身（单尾t以及;)，即通过IFN数量的减少来衡量γ阳性的斑点。pbmc刺激hMSCs及其条件培养基的免疫抑制电位较高(单尾)t以及;)，而未受刺激hMSCs和未受刺激hMSCs本身的条件培养基的差异(图)3.)。在这些结果的支持下，出于后勤原因和使用方便，我们在条件培养基上而不是细胞上对不同传代的研究组hMSCs的免疫抑制活性进行了深入分析。

3.4。通过IL-1的hMSC的刺激β

与任一的PBMC或IL-1的hMSC的激活后所产生的条件培养基βIFN具有免疫抑制活性γELISpots(图4)。由IL-1刺激hMSCs产生的条件培养基β表现出较高的（单尾配对t以及;）和更一致的免疫抑制活性（CV = 33％）比从培养介质刺激的外周血单个核细胞（CV = 54％）。

通过hMSC的培养与外周血单个核细胞的刺激所产生的条件培养基的更高变异可能反映了从谁分离PBMC的献血者之间的个体差异。

因此，为了简单性和数据一致性，我们将分析重点放在来自IL-1的条件培养基上β虽然PBMC和IL-1都受到-刺激β对所有的培养物进行了刺激测试。

3.5。体外扩增对hMSCs免疫抑制潜能的影响

为了分析培养时间对每个hMSC制剂免疫抑制电位的影响，将每个传代的抑制活性归一化到该制剂的第一个传代，以最小化5种细胞制剂内在抑制程度的变动性。

总的来说，当考虑所有五种细胞制剂时，免疫抑制活性随培养时间的变化而降低(单因素方差分析;)(图图5（a）)。来自第1代和第4代细胞的条件培养基具有相同的活性(单尾对)t以及;），以成对的彼此并优于条件培养基从细胞在传代7,10的活性，和13（单尾t以及;);第7代细胞的条件培养基与第10代和第13代细胞(单尾对)的活性相似t以及;）中，从在10代细胞和条件培养基较细胞从通道13多种免疫（单尾配对t以及;)。

在三个测试的细胞制剂，免疫抑制活性是在通道测试（单因素ANOVA不变;)(图图5（b）），而在两种制剂的活性表现出随时间（单因素ANOVA继续减少;)(图图5（c）)。

3.6。补充FGF-2对hMSCs免疫抑制潜能的影响

在对照条件下生长或添加FGF-2(单尾配对)的细胞制备和传代匹配hMSCs的免疫抑制活性之间未观察到显著差异t以及;)(图图6（a）)。然而，通过匹配组的比较可能不是生物学相关。如上面所指出的，FGF处理的细胞已经在任何给定通道经历群体倍增数比那些其控制对应的更高。当进行两种不同的培养条件之间的比较通过群体倍增的数目，而不是通过通道的数量，在FGF的培养基扩增的细胞相匹配的细胞制剂中的亚群表现出更高的免疫抑制活性比其控制对应物（单尾配对t以及;)(图6 (b))。

4.讨论

由于它们的免疫抑制性质，的MSC正在临床测试来治疗GVHD和其他自身免疫性疾病[18,46- - - - - -49]。但由于骨髓间充质干细胞的出现频率较低[50]的hMSCs治疗GVHD的临床应用需要大量的体外扩大，以达到目前用于病人治疗的细胞剂量。例如，对于体重80公斤的患者，一次hMSC注射的最低剂量(10⁶在临床试验中需要8×10⁷细胞。在这个数据集中，在控制条件下的第四通道结束时，或在添加了fgf的条件下的第一通道结束时，该扩展水平将达到。如果需要多次注射和/或更高剂量，整个治疗过程所需细胞数可高达4×10⁹细胞。在目前的实验中，这种高水平的增殖需要7或8次通道的对照和4次通道的fgf补充条件。

呈现的数据在这里确认膨胀在FGF的培养基的值[31,51- - - - - -53]。具体地，相比于在控制条件下膨胀，FGF-2补充会导致，平均而言，在由通道10通过通道7，在的hMSC 24000倍的增加而获得的hMSC的数量3500倍的增加，和240000倍的增加在通过通道13的hMSCs这些差异可以是在临床应用中，这些细胞的关键的，因为FGF补充剂可以加快生产导致更快速的临床前测试，表征细胞，和临床级的hMSC的可用性，从而显著影响的临床应用MSC治疗。

众所周知，hMSC制剂具有显著的增殖潜力[19但是它们的广泛扩张导致分化潜能的丧失，衰老的开始[21，和/或凋亡[54]。虽然文献报道充分支持hMSCs的免疫抑制活性[10,13,14,17,55- - - - - -57，这一活动的命运作为细胞准备扩大还没有深入研究。到目前为止，只有一份报告显示hMSCs的免疫抑制活性在经过6或7次传代后并没有下降在体外(58]。

我们的研究包括Haynesworth及其同事在1992年最初描述的标准膨胀条件[59，并补充已被证明对间充质干细胞的增殖和分化潜能有有益作用的FGF-2 [27- - - - - -29,31,32,60]。我们将细胞制剂进行了13次传代，在这个扩张水平上，大多数hMSC制剂已经进入了衰老阶段[19]。在此过程中，经过13代的对照间充质干细胞数量增加了26.3±4.7倍，而经过fgf处理的细胞数量增加了44.2±3.9倍。值得注意的是,FGF-treated hMSCs达到28.0±2.6人口倍增(获得的最大扩张与控制细胞)相比,大约5周左右通道6到9周需要达到这一水平的扩张在控制条件下,不同可能是至关重要的细胞产品的及时管理。

经fgf处理的hMSCs具有与传代匹配对照和群体双配对对照相比较的免疫抑制活性。因此，虽然补充FGF并没有像报道的那样显著改善hMSCs的成软骨潜能[31，维持免疫抑制活性对于应用于与异常t细胞异反应性相关的疾病是至关重要的。

在技​​术方面，并且相对于测定优化，我们的数据证实了以前的报告表明，至少部分地的hMSC的免疫抑制活性是通过可溶性因子介导的[13,55,61- - - - - -63而hMSCs可能需要微环境的刺激才能发挥这种活性[14,63,64]。我们已经证明，由骨髓间充质干细胞激活的培养基具有免疫抑制作用。这一观察结果允许使用条件培养基来表征hMSCs的活性。为此，可以制备和存储来自不同制备和传代的条件培养基，然后对相同的效应细胞同时进行测试，从而更好地比较结果。

此外，由PBMCs或IL-1激活的条件培养基的免疫抑制活性β用IL-1产生相媲美，但媒体β是否具有较高的活性，重要的是，在免疫抑制活性中，可变性较低，支持IL-1的使用β取代PBMCs激活hMSCs，简化条件培养基的制备，以标准化刺激使用重组细胞因子而不是未鉴定的细胞制剂。

5.结论

总之,控制条件相比,在FGF-supplemented hMSC扩张中可能有利于这些细胞产品的预定收件人通过使收购相当于细胞的数量明显减少了时间或更多的细胞在同一时间没有失去他们的免疫抑制活性。

然而，免疫抑制活性的测量在体外使用干扰素γ2ELISpot分析没有普遍保存在来自个人捐赠的所有细胞制剂。因此，当MSC的显著膨胀被需要或要求必须谨慎。在这些情况下，最终的细胞群的活性应加以核实，也许活性或效能最低应建立作为用于治疗应用的释放标准的一部分。此外，这些初始在体外观察结果必须经过验证在活的有机体内因为微环境肯定会影响这些细胞的活性或表现[65]。

致谢

作者要感谢沃特面包车博士“T霍夫的技术咨询上2ELISpot分析工作和Sylvia Janetzki博士建设性的讨论。杰弗里J.：;以及由美国国立卫生研究院（NIAID K08 A57801 PI这项研究是由发展的俄亥俄部门（;督察路易斯A. Solchaga和杰弗里·奥莱塔J.中心干细胞与再生医学试验计划）资助项目奥莱塔和NIAMS R01 AR05028; PI：让F.量级）。这项工作也得到了案例综合癌症中心的造血干细胞核心设施的支持（NCI; P30 CA43703; PI：斯坦顿L.格尔森）。

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