十种人PBMC制剂在这些研究中使用。将血液小心地铺在Ficoll（GE医疗集团，Pisctatway，NJ），并在800×g离心无制动30分钟管的顶部上。After centrifugation, a sterile plastic pipette was used to aspirate the mononuclear cell layer and transfer it into a fresh 50 mL conical tube (BD). The PBMCs were then washed twice with phosphate buffered saline (PBS, Invitrogen, Carlsbad, CA), counted, and resuspended in complete Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium composed of RPMI 1640 (Invitrogen) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS, Invitrogen).

五hMSC的准备工作是在本研究中使用。建立人骨髓来源的MSC培养的过程遵循先前公布的方法[ 33, 34]。简言之，骨髓抽吸物用由低葡萄糖的对照培养基中的Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM-LG，Invitrogen）中补充有10％胎牛血清（FBS）从所选择的很多（Hyclone公司，洛根，犹他州）[ 34]。血清很多选择是一个标准程序购买血清新货之前进行;所有实验用血清从单一批次进行。然后，将它们离心上的珀可（Sigma化学公司，St.Louis，MO）密度梯度来分离单核细胞。用对照培养基的单核细胞，并接种在的密度 1.8 × 10 5  cells/cm²在对照培养基中建立原代培养。细胞培养在37℃、95%空气、5% CO的湿化气氛中进行₂。

在第一个培养基变化时(第4天)，以及之后的每一个培养基变化中，一部分板接受对照培养基，其余板接受同样的培养基，补充10 ng/mL的FGF-2 (Peprotech, Rocky Hill, NJ)。剂量的选择是根据以前的研究[ 31]。培养饲喂每周两次。

细胞变得汇合之前，为了保持自己的增长以指数速度和防止自发分化或分化潜能的损失[hMSCs的必须传代培养 6, 35]。通常，当培养物达到80 - 90%融合时传代。原代培养通常在14±3天继代培养。随后，细胞大约每7±2天传代一次。分配到不同研究组(对照组或fgf处理组)的板同时进行继代培养，由于之前报道的细胞增殖和细胞大小的差异，治疗组的融合程度不同[ 31]。在所有的情况下，控制文化比在传代培养的时间他们的FGF-处理同事少汇合。将细胞通过胰蛋白酶消化进行传代培养，计数并重新接种在4.5×10^3.细胞每厘米²。

传代细胞200×g离心5分钟;丢弃上清液，在由90%胎牛血清(Invitrogen)和10% DMSO (Sigma Chemical Co.)组成的密度为10的冷冻培养基中重悬细胞⁶ cells/mL. The cells were aliquoted into cryogenic storage vials (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY), the vials placed in a freezing container (Thermo Fisher Scientific), and the container placed at −80°C overnight. The vials were then transferred to the vapor phase of a liquid nitrogen freezer.

含有约小瓶 1.0 - 1.5 × 10 6 冷冻保存的细胞在37℃水浴中迅速解冻，并转移到15 mL的锥形试管中，根据情况，其中包含5 mL对照或添加fgf的培养基。200×g离心5分钟。离心后弃上清，在对照或添加fgf的培养基中重悬细胞，以4.5×10的浓度接种^3.细胞每厘米²。

所述的hMSC的表型是由前向和侧向散射图案以及单克隆抗体（MAb）染色证实（CD45⁻,CD73⁺CD105,⁺)。Briefly, approximately 500,000 hMSCs were washed and resuspended in HBSS supplemented with 1% FBS containing 5 mM EDTA. hMSCs were then incubated with fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-CD45 MAb (BD), phycoerythrin (PE)-conjugated anti-CD73 MAb (BD), and allophycocyanin (APC)-conjugated anti-CD105 MAb (eBioscience, San Diego, CA). After 30-minute incubation at 4°C, MAb-labeled cells were washed three times and then fixed in 2% paraformaldehyde prior to analysis. Isotype control immunoglobulins were used as negative controls for staining. At least 20,000 events were analyzed per conjugated MAb stain condition.

评估其成软骨潜能[ 36- - - - - - 38]，再悬浮于化学成分确定的软骨形成培养基传代细胞。含有2.5×10等分⁵ cells were placed in polypropylene multiwell plates, centrifuged at 500 ×g, and placed in the incubator. Medium was changed three times per week. On days 7, 14, and 21 aggregates were harvested and processed for histologic evaluation.

为了验证其成骨潜能[ 20., 39, 40]的hMSC分别以5×10孔的密度接种^3. cells/cm²在对照培养基，并使其附着过夜。第二天，培养基与成骨培养基。培养基改变每周两次。Osteogenic cultures are further supplemented with 2 mM β一天10.一式三份培养甘油磷酸盐起始染色钙沉积（冯科萨） 41]上天14，21，和28。

的hMSCs的脂肪细胞的潜力也被测试[ 42]。含有2.5×10传代的细胞的等分试样⁵细胞置于多孔板成脂诱导培养基中的聚丙烯多孔板中，500×g离心，置于培养箱中。培养基每周更换三次。第10天，培养基更换成脂肪维持培养基。在第7、14和21天收集细胞进行组织学分析。

将不同传代数的hMSCs以15×10的密度接种到6孔板(BD)中^3. cells/cm²在完全的hMSC介质中。过夜孵育后，取出培养基，加入2 ml含PBMCs(0.5×10)的完全RPMI⁶ cells/mL) or interleukin-1 beta (IL-1 β) (5 pg/mL, Peprotech)。对照井只接收到完整的RPMI。另一组对照组不孵育hMSCs，但仍接受PBMCs或IL-1 β。经过24小时的培养期间，收集条件培养基，成2毫升微量离心管中，并在12000×g离心10分钟以除去任何残留的细胞。然后将无细胞的上清液转移到干净的微量离心管中，并使用任一新鲜或冷冻在-80℃下用于以后使用。

在扩张阶段的所有细胞计数使用Neubauer血球手工完成的胰酶消化细胞悬液，一式三份。群体倍增计算为在给定的通道通过接种细胞的数量除以结束时获得的细胞数量的基2对数。

对于原代培养物中，形成在原代培养的菌落数，我们使用作为分母假设一个菌落从一个MSC的。

的hMSC和它们的条件培养基的免疫抑制活性在酶联免疫斑点测定（ELISPOT）测试[ 43]。ELISpot分析允许可视化个体反应细胞的分泌产物;在试验中产生的每个点代表一个反应细胞。因此，该检测提供了定性(免疫蛋白类型)和定量(应答细胞数量)信息。ELISpot检测是高度敏感的，因为产物在被上清稀释前，在分泌细胞周围被邻近细胞的受体捕获，或降解。该方法最近越来越受欢迎，尤其是作为细胞毒性t细胞反应的替代方法，这在很大程度上是因为它既可靠又高度敏感[ 44]。

九十六个孔ELISPOT板（Millipore，比尔里卡，MA）用抗人干扰素γ（IFN γ)抗体(Pierce, Rockford, IL);100年 μL抗体溶液(4 μg/mL in PBS)分别加入板的96孔中，在冰箱中培养过夜。PBS洗涤后，用完整的RPMI在37℃下封闭2小时。然后这些井得到150口 μ完全RPMI（对照孔）或150 L的  μL(任意一个10⁶ cells/mL hMSC suspension or hMSC-conditioned medium (experimental wells). Then, 25  μ完全RPMI L的加入到阴性对照孔，和25  μ大号的植物血凝素（PHA，西格玛化学公司）溶液（40  μ将完全RPMI中的g/mL加入实验孔和阳性对照孔中。一个25 - μL PBMC悬浮液(6×10)⁶ cells/mL) was finally added to each well, and the plate was incubated for 24 hours at 37°C. After the incubation, the plate was washed with PBS + 0.05% Tween 20 (Sigma Chemical Co.). Biotinylated anti-IFN γ抗体（皮尔斯公司）（2  μ加入g/mL PBS + 0.05%吐温20 + 1% BSA (Sigma Chemical Co.)， 37℃孵育2小时。用PBS + 0.05%吐温20洗涤后，加入以PBS + 0.05%吐温20 + 1% BSA稀释1:10 00的Streptavidin-Horseradish过氧化物酶(Dako, Glostrup, Denmark)孵育1小时。PBS + 0.05%吐温20洗涤3次后，PBS 4次洗涤IFN γ用3-氨基9-乙基咔唑(3-amino-9-乙基咔唑(Pierce)制备阳性斑点。然后用自来水停止反应，让盘子在黑暗中干燥。用计算机辅助的ELISpot分析仪(Cellular Technology Inc.， Cleveland, OH)对这些板进行分析。抑制率是通过直接比较与相应的阳性对照上述。

在增殖率和外周血单个核细胞和IL-1之间的差异，差异有统计学意义 β刺激物通过配对确定 t测试。通过单因素重复测量、方差分析和配对分析分析培养时间对免疫抑制活性的影响 t-tests识别通道之间的差异。通过配对执行FGF补充效果的分析 t-tests和差异考虑显著 P值 < 。 05 。

与之前的研究一样，在FGF-2存在下扩张的hMSCs比在对照条件下扩张的hMSCs表现出更高的增殖率[ 31]。群体倍增时间为FGF-2的存在下膨胀的hMSC在任何通道始终比对照条件下扩增的细胞的缩短（ P < 。 01 如图中生长曲线的斜率所示 1。在第13代中，对照组间充质干细胞的数量平均翻倍(26.3±4.7)倍，而fgf处理的细胞数量平均翻倍(44.2±3.9)倍。经过fgf处理的hMSCs在第6通道大约35天内达到28.0±2.6 PDs(对照组细胞的最大扩张)。对照组或fgf处理的细胞同时进行继代培养，导致不同程度的融合，这是细胞增殖和细胞大小差异的结果[ 31]。对照培养比在传代培养的任何时候他们的FGF-处理同行从未更加融合。

从骨髓分离的hMSCs表现出多能hMSCs的典型特征[ 45]，即，特征形态，表面标志物分布（未示出），和三系分化潜能（图 2)。

从PBMC刺激的hMSC的条件培养基显示出更高的活性比PBMC刺激的hMSC本身（单尾 t以及; P = 5.52 × 10 - 7 ; n = 5 )，即通过IFN数量的减少来衡量 γ阳性的斑点。pbmc刺激hMSCs及其条件培养基的免疫抑制电位较高(单尾) t以及; P = 1.46 × 10 - 7 ; n = 5 ）比从未经刺激的hMSC和未刺激的hMSC本身条件培养基（图 3.)。在这些结果的支持下，出于后勤原因和使用方便，我们在条件培养基上而不是细胞上对不同传代的研究组hMSCs的免疫抑制活性进行了深入分析。

与任一的PBMC或IL-1的hMSC的激活后所产生的条件培养基 βIFN具有免疫抑制活性 γELISpots(图 4)。由IL-1刺激hMSCs产生的条件培养基 β表现出较高的（单尾配对 t以及; P = 5.23 × 10 - 7 , n = 50 )和更一致的免疫抑制活性(CV = 33%)，而不受PBMCs刺激的培养基(CV = 54%)。

通过hMSC的培养与外周血单个核细胞的刺激所产生的条件培养基的更高变异可能反映了从谁分离PBMC的献血者之间的个体差异。

因此，为了简单和数据的一致性，我们针对我们的分析上的条件培养基来自IL-1 β虽然PBMC和IL-1都受到-刺激 β刺激了所有文化测试。

为了分析的时间在培养上的每个的hMSC制备的免疫抑制电位的影响，每个通道的抑制活性进行标准化到该制剂的第一通道到在5种细胞制剂中固有程度的抑制最小化变异的。

总的来说，当考虑所有五种细胞制剂时，免疫抑制活性随培养时间的变化而降低(单因素方差分析; P = 。 010 , n = 10 )(图 5(一个))。在通道1和通道4从细胞条件培养基具有相当的活性（单尾配对 t以及; P = 。 437 , n = 10 ），以成对的彼此并优于条件培养基从细胞在传代7,10的活性，和13（单尾 t以及; P ≤ 。 044 , n = 10 ）;从在通道7细胞的条件培养基具有相似的活性，以从通道10和13（单尾配对细胞的 t以及; P ≥ 。 146 , n = 10 ）中，从在10代细胞和条件培养基较细胞从通道13多种免疫（单尾配对 t以及; P = 。 007 , n = 10 )。

在三种细胞制剂测试，免疫抑制活性是不变的传代测试(单因素方差分析; P = 。 064 , n = 6 )(图 5 (b)），而在两种制剂的活性表现出随时间（单因素ANOVA继续减少; P = 。 017 , n = 4 )(图 5 (c))。

在对照条件下生长或添加FGF-2(单尾配对)的细胞制备和传代匹配hMSCs的免疫抑制活性之间未观察到显著差异 t以及; P = 。 285 ; n = 25 )(图 图6（a）)。然而，遗传匹配组的比较可能没有生物学上的相关性。如上所述，经fgf处理的细胞在任何特定传代中所经历的翻倍数量都要高于对照组。当两种不同文化之间的对比条件进行匹配每个细胞内的亚种群准备人口倍增的数量而不是文章的数量,免疫抑制活性细胞扩大FGF-supplemented介质表现出高于控制同行(一个反面配对 t以及; P = 。 002 ; n = 11 )(图 6 (b))。