转录因子Lbx1在小鼠胚胎干细胞衍生表型中的表达

摘要

已知转录因子Lbx1在肢芽肌祖细胞的迁移和神经元的确定过程中发挥作用。此外，假设Lbx1参与心脏神经峰值相关的心脏发生。在这里，我们使用小鼠胚胎干细胞(ES)，它有能力发展成所有三个初级生殖层的细胞。在在体外分化，ES细胞再现细胞发育过程和早期胚胎发生的基因表达模式。转录本分析显示显著上调Lbx1在祖细胞阶段。免疫荧光染色证实Lbx1的骨骼肌细胞祖细胞和GABA能神经元中的表达。为了验证Lbx1在心脏细胞中存在，ES细胞衍生的心肌细胞的三重免疫细胞化学和定量化分析在不同发育阶段中进行。Lbx1和心脏特异性标志肌钙蛋白T Colabeling，α辅肌动蛋白，GATA4和Nkx2.5的建议在早期心肌发展的潜在作用。

1.介绍

Lbx1是?的成员瓢虫类似同源框基因家族，编码同源域转录因子。这个老鼠版本果蝇m .瓢虫基因最早由Jagla等人发现的。[1]。在脊椎动物中，Lbx1的表达已在CNS和迁移肌前体细胞进行说明。在早期小鼠胚胎发育，Lbx1的存在或不存在区分在背侧脊髓中产生两个主要的神经元类[2]。具体来说，Lbx1对于确定后脑中继神经元的体感觉而不是内脏感觉的命运至关重要[3]。在小鼠神经发生后期，Lbx1的表达定义了背角神经元的基底gaba能分化状态[4]。

此外，研究发现Lbx1在发育过程中对hypaxial肌肉前体细胞的迁移起重要作用。它是由Brohmann等人提出的[五Lbx1控制着基因的表达，而这些基因对于识别或解释引导肌肉前体迁移并保持其迁移潜力的线索至关重要。渡边等人[6在成年小鼠激活而非静止的卫星细胞中检测到Lbx1。他们认为Lbx1在成熟肌纤维卫星细胞的分化和维持中发挥重要作用。

除了与神经元的相关性[7和肌肉细胞[8]发展果蝇瓢虫基因也被报道在一个特定的心肌细胞子集中表达，这是心脏前体细胞多样化所必需的[9]。直到今天，关于Lbx1参与小鼠心脏发生的数据很少。失活的Lbx1主要导致小鼠心脏环化缺陷和细胞增殖增加，导致心肌增生[10]。显然，管状细胞之间存在着显著的形态和功能差异果蝇心脏和四腔哺乳动物心脏。然而，在这两个心脏原基的规范果蝇而脊椎动物胚胎则受保守核心心脏转录因子编码的控制，如Nkx2.5/Tinman、GATA/Pannier、Mef2、Hand family members等[11]。

鼠胚胎干细胞的特点是能够分化为几乎任何生物细胞类型，包括神经元、骨骼和心肌细胞[12]。在体外小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞，再现了在小鼠胚胎中以时间控制方式观察到的心脏基因的程序化表达[13]。在胚胎干细胞分化过程中，心脏特异性基因的上调或下调依赖于细胞外信号和细胞-细胞相互作用，从而为在细胞水平上研究早期胚胎发育提供了一个优秀的模型系统。

因此，本研究的目的是在ES细胞源性神经元和肌细胞祖细胞的转录本和蛋白水平上鉴定Lbx1的表达，以确保Lbx1在我们体内的存在在体外模型系统。具体地说，我们研究了Lbx1是否也表达在ES细胞来源的心肌细胞。通过免疫细胞化学，Lbx1在一小群ES细胞来源的心肌细胞中被清楚地证明。

2.材料和方法

2.1。细胞培养和分化

R1系ES细胞[14在Dulbecco氏改良的Eagle氏介质中的有丝分裂失活胚胎成纤维细胞饲养层上]中培养;如所描述的（DMEM Invitrogen公司，卡尔斯鲁厄，德国）并补充[15]。分化方案分为两步:(i)形成胚状体(EBs)， (ii)在黏附底物(0.1%明胶)上电镀EB，扩增多系祖细胞和自发分化形成分化表型。简而言之，胚胎干细胞(细胞/ 20μL滴)被镀在培养皿的盖上(∅10cm)，以“悬垂物”培养2天，置于细菌培养板(∅6 cm)，再悬液3天形成EBs(5天= 5天)。分化培养基由Iscove的改良杜尔贝克培养基(IMDM)补充20% FCS(精选批次)、l -谷氨酰胺/青霉素/链霉素(1:100原液)、非必需氨基酸(1:100原液，均来自Invitrogen)和α-单硫代甘油(终浓度450μ米;Sigma-Aldrich公司，Taufkirchen的，德国）。在第5天，在EB的IMDM铺板与补充剂上述和培养另外的2（d)至多35天( d) onto gelatin-coated 6 cm culture dishes for RT-PCR analysis and cardiomyocyte isolation (30 EBs). 30 EBs were plated onto gelatin-coated 6 cm culture dishes containing cover slips for immunocytochemistry, and 100 EBs onto 10 cm culture plates for protein isolation. Cultures were maintained in a 37°C/5% CO₂孵化器。虽然这种方法分化优先用于获得心肌细胞和骨骼肌细胞的祖细胞，可产生的神经元细胞的小群体，太。

2.2。RNA提取和RT-PCR

控制小鼠心脏和脑组织在第E12.5天，ES细胞，EBs，或分化细胞收集在天，，，，，，，，,悬浮于裂解缓冲液(peqGOLD RNAPure, peqlab, Erlangen, Germany)中。按照Chomczynski和Sacchi的方法单步提取总RNA [16]。RNA用寡聚d逆转录（T）₁₆引物（Applied Biosystems公司，达姆施塔特，德国），并使用寡核苷酸引物特异于下列基因（寡核苷酸序列在的顺序正向括号中给出放大，用于PCR，扩增片段的长度反向引物，随后在退火温度in base pairs, and the number of cycles): Lbx1 (CAGACCTCGCCTCTCTGC, CTCCTCTAGGTCCCGCTTG; 60°C; 318 bp; 32), Gapdh (CAGCCTCGTCCCGTAGAC, CGCTCCTGGAAGATGGTG; 60°C; 253 bp; 32). Reverse transcription was performed with MuLV reverse transcriptase (Invitrogen) for 10 min at 25°C and 90 min at 42°C, followed by denaturation for 10 min at 70°C and cooling to 8°C according to the protocol supplied by the manufacturer. For semiquantitative determination of mRNA levels, PCR analyses were carried out with Taq DNA polymerase (peqGOLD Taq-Polymerase, peqlab, Erlangen, Germany). For determination of relative mRNA levels, two separate PCR reactions, either using primers of the analyzed gene or primers specific for Gapdh, were performed.

所述PCR反应在25执行 μL反应卷。每一个PCR反应的三分之一在含有GelRed核酸凝胶染色的2%琼脂糖凝胶上电泳分离(Biotium, Hayward，美国)。凝胶用紫外光照射，用TINA2.08e软件(德国Straubenhardt)分析凝胶中的荧光信号。靶基因的数据被绘制成与管家基因Gapdh表达相关的百分比变化。分析十个独立实验的凝胶。为了进行统计评价，使用方差分析(ANOVA)对数据进行比较。

2.3。西方墨点法

细胞处于分化阶段，，，，,在天E12.5 E15.5和，和成人心脏和脑组织胚胎小鼠心脏和大脑用PBS洗涤三次，并在300-500匀浆 μL冷中断缓冲液(PARIS Kit, Applied Biosystems, Darmstadt, Germany)。样品保存在−80℃直到使用。用BCA蛋白酸试剂盒(Sigma-Aldrich)和NanoDrop (peqlab)分光光度法测定总蛋白含量。六十μ克蛋白在Laemmli缓冲液中溶解，并加热到95℃，持续5分钟，并进行电泳在15％SDS-PAGE。Proteins were electrotransferred to PVDF membrane and blocked in Tris-buffered saline containing 0.2% Tween and 10% nonfatty milk powder for 1 h. Blots were incubated in 10% nonfatty milk powder/TBS-Tween with rabbit anti mouse Lbx1 antibody (1 : 1000, gift from Dr. T. Müller, Berlin, Germany) or rabbit anti mouse Gapdh antibody (1 : 2000, Abcam, Cambridge, UK) at room temperature (RT) for 1 h. Afterwards, the blots were washed three times for 10 min in TBS-Tween and then incubated with goat anti rabbit IgG (1 : 80000) conjugated to horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich) in 10% nonfatty milk powder/TBS-Tween at RT for 1 h. After washing, immunoreactive signals were visualized by enhanced chemiluminescence detection (ECL plus, Amersham Biotech, Freiburg, Germany). Apparent molecular weights were determined by comparison with standard molecular weight markers (PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, Fermentas, St. Leon-Rot, Germany).

2.4。免疫荧光分析

间接免疫荧光(IF)分析EB生长在天神经元表型和骨骼肌细胞祖细胞。为了量化在不同分化阶段EB长出Lbx1阳性心肌细胞的量，跳动的心脏簇如所述进行分离[15在天，，，, 5 + 15。群集被复制到涂有胶的盖片上(∅10 mm) in wells of 4-well plates and allowed to attach overnight. Cells were rinsed with PBS and fixed with PBS containing 4% paraformaldehyde at RT for 20 min. After washing, cells were permeabilized with 0.1% Triton in PBS at RT for 10 min. Preparations were incubated with 1% bovine serum albumine in PBS for 1 h followed by incubation with the primary antibodies at RT in a humidified chamber for 1 h. The following antibodies were applied: rabbit anti mouse Lbx1 (1 : 1000, gift from Dr. T. Müller), mouse anti mouse sarcomeric alpha actinin (1 : 200), mouse anti mouse cardiac Troponin T (1 : 200; all from Abcam), mouse anti mouseβIII微管蛋白亚型(1:150)，豚鼠抗小鼠-氨基丁酸(GABA, 1:500;均来自Chemicon-Millipore，施瓦尔巴赫，德国)，山羊抗小鼠GATA4(1:100)，山羊抗小鼠Nkx2.5 (1:100;分别来自德国海德堡的圣克鲁斯生物技术公司)。用PBS冲洗(3x)后，用荧光标记的抗兔、抗豚鼠、抗山羊的二抗在RT条件下孵育1 h³抗小鼠Cy5 (1:700;所有来自迪亚诺娃，汉堡，德国)或抗老鼠，抗兔子Alexa 488，(1:100)或抗老鼠Alexa 350 (1:100;全部来自分子概率研究)。DAPI反染后，用PBS和A. tridest (1x)冲洗盖片(3x)。将标本嵌入Vectashield固定培养基(Vector Lab.-Biozol, Wertheim-Bettingen, Germany)后，用荧光显微镜(Axiovert;德国蔡司)。

基于约1000个心肌细胞的定量估计(实验）在给定的分化阶段阳性染色为肌钙蛋白T。Lbx1-免疫阳性细胞显示肌钙蛋白T强荧光信号共表达（Lbx1 +，肌钙蛋白T +）和阳性细胞肌钙蛋白仅T（Lbx1-，肌钙蛋白T +）进行计数。Lbx1表达不是由在靠近心脏簇肌钙蛋白T抗体共染色的细胞不计算在内。最有可能的，这些细胞没有解离和重复接种后正确地重新排列横纹肌设备。

3.结果

3.1。Lbx1表达的RT-PCR分析

胚胎小鼠心脏和脑组织以及ES细胞和分化的后代2RT-PCR分析培养天数。E12.5中心脏和脑组织的转录水平略高(图)图1（a）)。转录水平的Lbx1低分化胚胎干细胞(8.2%)，但在祖细胞阶段表现出显著的短暂上调 d (55.9%) tod (72.3%;数字图1（b）)。在第5天+11天达到86.7%的最高水平。在分化末期5+30 d，Lbx1被显著下调至30.3％。

3.2。Western Blot检测Lbx1

为了证实Lbx1在蛋白水平上的存在，我们对不同发育阶段的心脏和脑组织进行了分析。Lbx1在比较脑组织中可检测到(图)2(一个))。在E12.5、E15.5和成人心脏中也可以检测到Lbx1。在分化的胚胎干细胞衍生物中，Lbx1在分化的各个阶段均以中等水平表达(图)2 (b))。

3.3。Lbx1在分化ES细胞子代中的免疫细胞化学分析

免疫细胞化学分析首先对骨骼肌祖细胞和神经元细胞进行，以确认Lbx1参与ES细胞衍生培养的早期发育过程在体外。与sarcomeric Costainingα-肌动蛋白显示少量lbx1阳性骨骼肌细胞祖细胞(图)3(a))。Lbx1的免疫反应性也被检测到很多βIII小管蛋白阳性神经元细胞(图3(b)和在更高的放大数字3(c))。用抗gaba抗体进行神经元亚型鉴定。如图所示3(d)和3（d'''），在Lbx1 GABA阳性的神经元细胞的细胞核中表达。在未分化的ES细胞Lbx1的免疫细胞化学分析显示它的不存在（未示出）。

3.4。Lbx1在ES细胞来源的心肌细胞中定位

为了发现Lbx1是否也能在ES细胞来源的心肌细胞中被检测到，三重免疫荧光染色包括肌肉瘤α-肌动蛋白和早期心脏转录因子在单独的跳动簇中进行。在与GATA4共表达的心肌细胞小亚群中发现Lbx1(图)4(a " '))和Nkx2.5(图4(b))。

为了进一步研究表达lbx1的心肌细胞的数量，我们在不同的发育阶段进行了定量分析。免疫细胞化学显示，约10%的肌钙蛋白t阳性心肌细胞Lbx1早期染色阳性（数字5(一个))。这一数字在日数上略有变化(7.8%)和(8.2%)至10.9%在第5天+15天，为9.6%，但变化不显著。数据5 (b)-图5（d）免疫荧光染色显示分离的搏动心肌细胞在给定时间点部分共表达Lbx1。

因为没有包含Lbx1特异性的纯化或富集程序，大约不到5%的胚胎干细胞来源细胞表达Lbx1。表达局限于骨骼肌细胞祖细胞，心脏肌细胞和神经元细胞。

4.讨论

在胚胎干细胞衍生子代中，Lbx1的转录和蛋白水平分析显示，Lbx1在神经元、骨骼肌祖细胞和一小群心肌细胞中表达。据我们所知，这是第一次在ES细胞衍生的心肌细胞中显示Lbx1和几个心脏特异性标记物的共表达。

RT-PCR分析表明在胚胎心脏组织的表达信号。而Schafer等。[10]检测胚胎小鼠心脏Lbx1-LacZ的阳性细胞，但未能检测到的mRNA Lbx1，Chao等人。[17的中度表达水平Lbx1猪心脏的基因。Lbx1在一天左右的祖细胞阶段显著上调胚胎干细胞分化。对胚胎心脏组织样本和几个胚胎干细胞分化阶段的Western blot分析证实了Lbx1蛋白在我们的模型系统中的存在。因为在胚胎干细胞分化的过程中，存在来自中胚层和外胚层的祖细胞[18]，使用细胞类型特异性抗体双免疫细胞化学进行分配Lbx1信号到特定的表型。正如预期的那样，Lbx1免疫反应可在骨骼肌细胞前体和GABA能神经元如前所述检测到，这反映了小鼠中的组织表达模式[4，19]。

Lbx1与心脏转录因子(GATA4, Nkx2.5)的连锁反应以及肌钙蛋白t阳性心肌细胞亚群中的持续表达表明，Lbx1可能在心肌分化和功能中发挥作用。E11.0时小鼠心脏发生，左心室心肌中检测到单个lbx1 - lacz阳性细胞[10]。作者认为Lbx1-的LacZ阳性细胞的这种小种群可能会从神经管迁移到尾鳃弓和E9.0和E9.5之间或动脉干起源反映从头Lbx1在心肌中的表达。我们的数据首次证明Lbx1在小鼠心肌细胞中的表达独立于心脏神经嵴系统。

长期表达的Lbx1同源瓢虫也在果蝇[20]。作者进行了肌肉和心脏靶向全基因组转录谱分析和染色质免疫沉淀(ChIP-)芯片上搜索直接Ladybird靶标。他们的结论是，瓢虫有助于指定心脏前体的身份，调节获取细胞类型特定特性(例如运动性、形状和大小)所需的基因，并可能参与调控终端分化所需的基因和心脏细胞的功能特性[20]。在小鼠中采用类似的方法将有助于发现Lbx1在脊椎动物心脏发育中的整个功能。

综上所述，我们的研究结果清晰地展示了Lbx1在胚胎干细胞来源的心肌细胞中的表达，从而为鉴别Lbx1的靶基因和由心力衰竭引起的早期心衰的信号通路提供了模型系统Lbx1失活。

承认

作者要感谢T. Muller博士为他们提供了抗lbx1抗体。

参考

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