SCI 干细胞国际 1687 - 9678 SAGE-Hindawi访问研究 130970年 10.4061 / 2011/130970 130970年 研究文章 转录因子Lbx1表达式在小鼠胚胎干细胞表型 Schmitteckert 斯蒂芬妮 1 齐格勒 科妮莉亚 1 小型赛车 藤本植物 1、2 Rolletschek 亚历山德拉 1 卡尼亚 加芙 1 生物研究所接口1 卡尔斯鲁厄理工学院(工具包)校园北 Hermann-von-Helmholtz-Platz 1 76344年Eggenstein-Leopoldshafen 德国 kit.edu 2 动物研究所生态和寄生虫学 卡尔斯鲁厄理工学院(工具包)校园南部 76131年Kornblumenstraße 13日,卡尔斯鲁厄 德国 kit.edu 2011年 15 09年 2011年 2011年 15 04 2011年 10 07年 2011年 2011年 版权©2011 Stefanie Schmitteckert et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

转录因子Lbx1已知在迁移中发挥作用的肌肉在肢芽以及神经祖细胞测定过程。此外,Lbx1参与心脏神经crest-related cardiogenesis假设。这里,我们利用小鼠胚胎干细胞(ES)细胞有能力发展为所有三个主要的生殖细胞层。在 在体外细胞分化,胚胎干细胞概括早期胚胎的发育过程和基因表达模式。文本分析发现的一个重要upregulation Lbx1在祖细胞阶段。免疫荧光染色证实Lbx1在骨骼肌细胞祖细胞的表达和gaba ergic神经元。核实Lbx1在心肌细胞的存在,三重免疫细胞化学ES细胞衍生的心肌细胞,在不同的发展阶段进行了量化分析。Colabeling Lbx1和心脏肌钙蛋白T特定标记, α辅肌动蛋白、GATA4 Nkx2.5建议心肌早期发育的潜在作用。

 1。介绍

Lbx1的一员吗 飘虫——同源框基因家族编码homeodomain转录因子。这款鼠标的 果蝇m .瓢虫首次发现了基因Jagla et al。 1]。在脊椎动物中,Lbx1被描述的表达在中枢神经系统和肌肉前体细胞移植。在小鼠早期胚胎发育,存在与否Lbx1区分两个主要神经背侧脊髓中生成的类( 2]。具体来说,Lbx1是判定一个躯体感觉所必需的,而不是在继电器viscerosensory命运神经元在后脑 3]。在老鼠的神经发生后期,表达Lbx1定义了一个基底gaba ergic负责背角神经元分化( 4]。

此外,发现Lbx1扮演着一个很重要的角色,在开发过程中脊柱轴下方的肌肉前体细胞的迁移。它是由Brohmann et al。 5]Lbx1控制基因的表达至关重要的识别或解释的线索,引导迁徙肌肉前体细胞和维持他们的迁徙的潜力。渡边等。 6)发现Lbx1激活但不是静止卫星细胞的成年老鼠。他们建议Lbx1中扮演重要角色的分化和维护卫星细胞成熟肌纤维。

除了其相关性在神经元 7和肌细胞 8)发展 果蝇瓢虫基因表达也被报道cardioblasts的特定子集,所需的多元化心脏前体细胞( 9]。直到今天,只有几个数据的参与在鼠标cardiogenesis Lbx1。失活的 Lbx1老鼠主要导致心脏循环和细胞增殖增加缺陷导致心肌增生( 10]。显然有惊人的管状形态和功能差异 果蝇心和哺乳动物的四腔心。然而,心脏原基的规范 果蝇和脊椎动物胚胎是守恒的核心的控制下心脏转录因子编码,例如,Nkx2.5 /洋铁匠,叫/裙撑,Mef2,手家庭成员( 11]。

小鼠胚胎干细胞(ES)细胞具有分化成任何细胞类型的能力的有机体,包括神经元,骨骼,和心肌细胞( 12]。 在体外小鼠ES细胞分化成心肌细胞的程序性表达立在心脏基因在小鼠胚胎time-controlled的方式( 13]。在ES细胞分化过程中,心脏基因,或表达下调依赖于细胞外的信号,和交互,从而提供一个优秀的模型系统研究早期胚胎发育在细胞水平。

因此,本研究的目的是鉴定Lbx1在ES细胞衍生的转录和蛋白质水平表达神经细胞和肌肉细胞祖细胞,以确保Lbx1在我们的存在 在体外模型系统。具体来说,我们调查是否Lbx1心脏细胞也表达了ES细胞来源。Lbx1的存在显然是显示在一个小族群ES细胞衍生的心肌细胞,免疫细胞化学。

 2。材料和方法 2.1。细胞培养和分化

胚胎干细胞线R1 ( 14)是培养在杜尔贝科mitotically灭活胚胎成纤维细胞支线层修改鹰的介质(DMEM;英杰公司、德国卡尔斯鲁厄)和补充描述( 15]。两级分化协议包括(i)拟胚体的形成(EBs)和(2)EB镀后粘合衬底(0.1%明胶)multilineage祖细胞的扩张和自发分化形成分化表型。简而言之,ES细胞( n = 600年 细胞/ 20 μL下降)镀在培养皿的盖子( ∅10厘米),培养“悬滴”了2天,在细菌学上的板( ∅6厘米)悬架额外的3天形成EBs(总共5天= 5 d)。分化培养基由Iscove修改杜尔贝科的介质(IMDM)补充20% FCS(所选批次)、谷酰胺、青霉素、链霉素(1:100年股票的解决方案),不必要的氨基酸(1:100年股票的解决方案,所有从英杰公司),和 α-monothioglycerol(最终浓度450 μM;Sigma-Aldrich Taufkirchen,德国)。在第五天,EBs是镀与上面提到的补充剂和培育IMDM进一步两个( = 5 + 2 35天(d) = 5 + 35 d)到gelatin-coated 6厘米文化菜rt - pcr分析和心肌细胞隔离(30 EBs)。30 EBs镀上gelatin-coated 6厘米文化菜包含封面为免疫细胞化学,蛋白质和100 EBs 10厘米文化板块隔离。文化被保持在37°C / 5%的股份有限公司2孵化器。尽管这种区别方法是优先用于获得心肌细胞、骨骼肌细胞祖细胞,神经细胞可以生成的人口不多,。

 2.2。RNA提取和rt - pcr

控制老鼠的心脏和大脑组织在天E12.5, ES细胞,EBs,或分化细胞收集在天 5 + 2 , 5 + 4 , 5 + 7 , 5 + 9 , 5 + 11 , 5 + 14 , 5 + 18 , 5 + 25 , 5 + 30. , 5 + 35 悬浮在裂解缓冲(peqGOLD RNAPure, peqlab,埃朗根,德国)。单步提取总RNA分离的方法根据Chomczynski和萨基 16]。RNA是反向转录使用低聚糖d (T)16引物(应用生物系统公司,达姆施塔特,德国)和放大后使用特定的寡核苷酸引物基因(寡核苷酸序列在括号中给出的顺序向前,reverse-primer随后的退火温度用于PCR,扩增片段的长度在碱基对,和周期的数量):Lbx1 (CAGACCTCGCCTCTCTGC CTCCTCTAGGTCCCGCTTG;60°C;318个基点;32),Gapdh (CAGCCTCGTCCCGTAGAC CGCTCCTGGAAGATGGTG;60°C;253个基点;32)。执行反转录与亲逆转录酶(表达载体)10分钟25°C和90分钟42°C,其次是变性在70°C和冷却10分钟到8°C根据制造商提供的协议。进行半定量的测定mRNA水平,进行PCR分析Taq DNA聚合酶(peqGOLD Taq, peqlab,埃朗根,德国)。测定相对mRNA水平,两个独立的PCR反应,要么使用引物分析了Gapdh基因或特定引物,进行。

PCR反应进行的25 μL反应卷。三分之一的PCR反应是electrophoretically 2%琼脂糖凝胶上分离包含GelRed核酸凝胶染色(Biotium,海沃德,美国)。凝胶被紫外线照射的时候,由TINA2.08e GelRed荧光信号分析软件(Raytest Isotopenmeßgerate, Straubenhardt,德国)。目标基因的数据被绘制为百分比的变化关系表达式的管家Gapdh基因。凝胶十个独立的实验进行了分析。统计评估,数据比较用方差分析(方差分析)。

 2.3。西方墨点法

EBs,细胞在分化阶段 5 + 2 , 5 + 4 , 5 + 7 , 5 + 11 , 5 + 14 , 5 + 18 ,胚胎在天E12.5 E15.5老鼠心脏和大脑,和成人心脏和脑组织被洗了三次PBS和均质在300 - 500年 μL冷中断缓冲区(巴黎装备、应用生物系统公司、达姆施塔特,德国)。样本储存在−80°C到使用。总蛋白质含量测定用BCA spectrophotometrical蛋白质酸工具包(Sigma-Aldrich)和NanoDrop (peqlab)。六十 μg蛋白可溶性Laemmli缓冲区中,加热5分钟在95°C和15% sds - page电泳。蛋白质是electrotransferred PVDF膜和阻塞Tris-buffered盐水含有0.2%渐变和10% nonfatty奶粉1 h。墨迹在10% nonfatty奶粉/ TBS-Tween孵化与兔抗小鼠Lbx1抗体(1:1000年,t·穆勒博士的礼物,柏林,德国)或兔抗小鼠Gapdh抗体(Abcam 1: 2000年,剑桥,英国)在室温下(RT) 1 h。之后,这些墨迹被洗了三次在TBS-Tween 10分钟,然后孵化与山羊抗兔免疫球蛋白g(1: 80000)结合辣根过氧化物酶(Sigma-Aldrich) 10% nonfatty奶粉/ TBS-Tween RT 1 h。洗后,免疫反应性的信号被可视化增强化学发光检测(ECL + Amersham生物技术,弗莱堡,德国)。表观分子量测定与标准相比分子量标记(PageRuler + Prestained蛋白质梯子,Fermentas,圣Leon-Rot,德国)。

 2.4。免疫荧光分析

间接免疫荧光法(如果)分析EB扩展进行了的天 5 + 11 神经细胞表型和 5 + 14 对骨骼肌细胞的祖细胞。量化Lbx1-positive心肌细胞的数量在EB扩展在不同分化阶段,跳动的心脏集群分离所述[ 15在天 5 + 4 , 5 + 7 , 5 + 9 , 5 + 11 ,5 + 15。集群被山肩到gelatin-coated盖滑( ∅10毫米)4井的盘子和允许附加在一夜之间。细胞被冲洗与PBS和固定PBS含有4%多聚甲醛在RT 20分钟。洗后,细胞permeabilized 0.1% Triton在PBS RT 10分钟。准备孵化与1%牛血清在PBS albumine 1 h其次是孵化的主要抗体在RT湿润室1 h。以下抗体应用:兔抗鼠Lbx1(1: 1000年,T·穆勒博士的礼物),鼠标反鼠标sarcomericα-辅肌动蛋白(1:200),鼠标抗小鼠心肌肌钙蛋白T (1: 200;所有从Abcam),鼠标反鼠标 β三世微管蛋白同种型(1:150),豚鼠抗小鼠γ-氨基丁酸(GABA, 1: 500;所有从Chemicon-Millipore Schwalbach、德国),山羊抗小鼠GATA4(1: 100),和山羊抗小鼠Nkx2.5 (1: 100;从圣克鲁斯生物技术、海德堡、德国),分别。洗后与PBS (3 x),细胞被孵化的RT 1 h和fluorescence-labelled要么是抗兔二次抗体,抗豚鼠,抗山羊Cy3(1:700),反鼠标Cy5 (1: 700;从Dianova,汉堡,德国)或反鼠标,反兔子Alexa 488(1: 100)或反鼠标Alexa 350 (1: 100;所有从分子Probes-Invitrogen)。与DAPI对比染色后,封面都冲洗(3 x)与PBS和a . tridest (1 x)。后嵌入Vectashield安装介质(向量Lab.-Biozol、Wertheim-Bettingen、德国),标本与荧光显微镜分析(Axiovert;德国蔡司)。

定量评估基于大约1000的评估心肌细胞( n = 10 积极实验)染色肌钙蛋白T的分化阶段。Lbx1-immunopositive细胞显示一个强烈的荧光信号coexpressing肌钙蛋白T (Lbx1 +,肌钙蛋白T +)和肌钙蛋白阳性细胞仅T (Lbx1−,肌钙蛋白T +)计算。Lbx1表达细胞不是costained在靠近心脏肌钙蛋白T抗体集群没有统计。最有可能的是,这些细胞没有重新排列sarcomeric装置分离和金属堆焊后正常。

 3所示。结果 3.1。rt - pcr分析Lbx1表达式

胚胎小鼠心脏和大脑组织以及胚胎干细胞和分化后代2 5 + 35 天的培养被rt - pcr分析。心脏和大脑组织E12.5揭示转录水平与大脑组织(图略高的水平 1(一))。转录水平的 Lbx1在未分化的胚胎干细胞较低(8.2%),但表现出明显的瞬态upregulation祖细胞阶段的 5 + 4 d (55.9%) 5 + 14 d (72.3%;图 1 (b))。最大程度的达到天5 + 11 86.7%。在终端分化阶段5 + 30 d, Lbx1明显下调到30.3%。

rt - pcr分析mRNA水平 Lbx1基因在胚胎组织和ES细胞衍生后代。(一)代表的半定量rt - pcr凝胶 Lbx1产品在E12.5大脑和心脏组织。(b)凝胶和代表 Lbx1转录水平差异化的ES细胞分化阶段。数据绘制(%)与管家基因的转录水平 Gapdh意味着( n = 10 实验)。误差棒表示平均数标准误差。的 P 值< 0.0001。

 3.2。检测的Lbx1免疫印迹分析

确认存在Lbx1蛋白质水平,心脏和大脑组织从不同的发展阶段进行了分析。Lbx1适度可检测比较大脑组织(图 2(一个))。Lbx1也可以检测到E12.5 E15.5,和成人的心。在差异化的ES细胞衍生品,Lbx1表示在分化在中等水平的所有阶段(图 2 (b))。

免疫印迹分析Lbx1在小鼠组织和ES细胞衍生的文化。(a)代表凝胶分析胚胎心脏和脑组织E12.5 E15.5以及成人组织内部标准Gapdh相比。(b)代表凝胶Lbx1和Gapdh表示分化的ES细胞分化阶段。

 3.3。采用免疫分析Lbx1在分化ES细胞的后代

采用免疫分析是第一次与骨骼肌祖细胞和神经元细胞进行确认Lbx1参与早期发育过程ES细胞衍生的文化 在体外。与sarcomeric Costaining α辅肌动蛋白显示少量Lbx1-positive骨骼肌细胞祖细胞(图 3(a))。Lbx1免疫反应性也被发现在许多 β三世tubulin-positive神经细胞(图 3(b)和更高的放大图 3(c))。识别神经元亚型,costaining anti-GABA抗体。如数据所示 3(d′)和 3(d′′′), Lbx1 GABA-positive神经元细胞的细胞核中表达。采用免疫分析在未分化的胚胎干细胞Lbx1透露其缺席(没有显示)。

免疫荧光分析Lbx1表达式在ES细胞衍生细胞。(一)Sarcomeric α辅肌动蛋白-(绿色)标记骨骼肌细胞祖细胞部分costained Lbx1(红色) 5 + 14 自发的ES细胞分化。(b) βIII微管蛋白-(绿色)阳性神经细胞部分coexpressed Lbx1(红色) 5 + 11 。(c) Lbx1染色(红色)显然是位于核的区域 βIII微管蛋白-(绿色)阳性神经元。三重免疫荧光染色显示(d′)的coexpression Lbx1(绿色)和GABA(橙色)(d′′) β三世微管蛋白(暗红色)阳性神经元。合并(d′′′)的形象。核是用荧光标记DAPI标记(蓝色)。酒吧 = 20. μm。

 3.4。Lbx1托管在ES细胞衍生心肌细胞

为了发现Lbx1是否也可以在ES细胞衍生发现心肌细胞,包括sarcomeric三重免疫荧光染色 α辅肌动蛋白和早期心脏转录因子在孤立打击集群执行。Lbx1被发现在一个小族群的心肌细胞在coexpression GATA4(图 4(′′′)和Nkx2.5(图 4(b′′′))。

免疫荧光分析Lbx1表达式在ES细胞衍生的心肌细胞。Sarcomeric (b′′) α辅肌动蛋白(蓝色)彩色到达coexpressed Lbx1(绿色)和(a′′)叫4(红色)或(b′′) Nkx2.5(红色)。(′′′b′′′)合并图像。酒吧 = 20. μm。

为了进一步调查Lbx1-expressing心肌细胞的数量,在不同的发展阶段进行量化分析。免疫细胞化学显示,大约10%的肌钙蛋白T-positive心肌细胞染色阳性Lbx1最早的一天 5 + 4 (图 5(一个))。这个数字略变天 5 + 7 (7.8%)和 5 + 9 10.9% (8.2%) 5 + 11 d和9.6% 5 + 15天,但变化不显著。数据 5 (b)- - - - - - 5 (d)显示图像代表孤立跳动的心肌细胞的免疫荧光染色部分coexpressing Lbx1在给定的时间点。

量化的Lbx1-expressing心肌细胞。(a)的百分比Lbx1心肌细胞/肌钙蛋白T双阳性(满酒吧)与肌钙蛋白T-positive心肌细胞(开放酒吧;大约1000个细胞/时间点)表示分化阶段。数据显示为手段( n = 10 实验)。误差棒表示平均数标准误差。(b) - (d)代表的双重疣状肌钙蛋白T(绿色)和Lbx1(红色)在给定的时间点。核是用荧光标记DAPI标记(蓝色)。白色箭头(c)表明一个Lbx1表达细胞接近集群没有costained心脏肌钙蛋白T抗体。酒吧= 10 μm。

因为没有Lbx1-specific纯化或浓缩过程包括在内,大约不到百分之五的ES细胞衍生细胞Lbx1表示。表达式是局限于骨胳肌细胞祖细胞,心脏细胞,神经细胞。

 4所示。讨论

分析Lbx1在ES细胞衍生后代的转录和蛋白水平揭示神经元中的表达以及骨骼肌祖细胞和心肌细胞在一个小族群。据我们所知,这是第一次,coexpression Lbx1和几个心脏标记可以在ES细胞衍生演示心肌细胞。

rt - pcr分析显示信号的表达式在胚胎心脏组织。而谢弗et al。 10)发现Lbx1-LacZ-positive胚胎老鼠心脏细胞,但未能检测Lbx1 mRNA,曹国伟et al。 17发现温和的表达水平 Lbx1基因在猪心。 Lbx1显著调节在祖细胞阶段在一天 5 + 11 ES细胞分化。免疫印迹分析胚胎的心脏组织样本和几个ES细胞分化阶段确认Lbx1蛋白质的存在在我们的模型系统。因为有几个血统的祖细胞包括中胚层和外胚层的血统出席这次的ES细胞分化[ 18)、双使用特定类型细胞抗体进行免疫细胞化学Lbx1信号分配给特定的表型。正如所料,Lbx1免疫反应性可能是发现在骨骼肌细胞前体和gaba ergic神经元,这反映了组织表达模式在老鼠如前所述 4, 19]。

Costaining Lbx1的心脏转录因子(GATA4 Nkx2.5)和连续表达式分组人口的肌钙蛋白T-positive心肌细胞在心肌细胞分化和功能提出一个潜在的作用。在鼠标cardiogenesis E11.0、单Lbx1-LacZ-positive细胞被发现在左心室的心肌 10]。作者说,这个小Lbx1-LacZ-positive细胞可能来源于神经管人口迁移到尾鳃弓和动脉干E9.0和E9.5之间或反映 新创在心肌Lbx1表达式。我们的数据提供了第一个证据Lbx1表达式的小鼠心肌细胞心脏神经嵴的独立系统。

长期的表达Lbx1同族体瓢虫也发现 果蝇( 20.]。作者进行了肌肉和heart-targeted全基因组转录分析和chromatin-immunoprecipitation——(芯片)片上搜索直接瓢虫的目标。他们得出的结论是,瓢虫对指定的身份心脏前体,收购所需的调节基因特异性属性(如运动性、形状和大小),和所需的基因可能参与调节终端分化和心肌细胞的功能性质 20.]。老鼠体内的类似的方法将有助于发现整个Lbx1在脊椎动物心脏功能开发。

综上所述,我们的研究结果清楚地表明Lbx1的表达在胚胎干细胞心肌细胞,从而提供一个模型系统的识别Lbx1目标基因和信号通路参与早期心力衰竭所致 Lbx1失活。

 承认

作者希望感谢t·穆勒博士向他们提供anti-Lbx1抗体。

 Jagla K。 道 P。 加尼姆 m·G。 Jagla T。 Schuhbaur B。 Dretzen G。 Bellard算法 F。 Bellard算法 M。 鼠标Lbx1和人类Lbx1定义一个新的哺乳动物同源框基因家族与果蝇lady bird基因 机制的发展 1995年 53 3 345年 356年 2 - s2.0 - 0028807783 10.1016 / 0925 - 4773 (95)00450 - 5 穆勒 T。 Brohmann H。 Pierani 一个。 Heppenstall p。 列文 g·R。 Jessell t M。 Birchmeier C。 homeodomain因素Lbx1区分两个主要项目背侧脊髓神经元分化的 神经元 2002年 34 4 551年 562年 2 - s2.0 - 0037118260 10.1016 / s0896 - 6273 (02) 00689 - x 员工 m·A。 风暴 R。 Martinez-de-la-Torre M。 穆勒 T。 Wende H。 路透社 K。 Vasyutina E。 Birchmeier C。 Lbx1作为选择基因决定命运的躯体感觉和viscerosensory继电器神经元在后脑 神经科学杂志》上 2007年 27 18 4902年 4909年 2 - s2.0 - 34247890152 10.1523 / jneurosci.0717 - 07.2007 程 l Samad o . A。 徐 Y。 Mizuguchi R。 罗 P。 Shirasawa 年代。 高尔丁 M。 马 Q。 Lbx1和 Tlx3反对开关在决定gaba ergic与glutamatergic发射机表型 自然神经科学 2005年 8 11 1510年 1515年 2 - s2.0 - 27644445358 10.1038 / nn1569 Brohmann H。 Jagla K。 Birchmeier C。 Lbx1在迁移的肌肉前体细胞 发展 2000年 127年 2 437年 445年 2 - s2.0 - 0033963166 渡边 年代。 近藤 年代。 Hayasaka M。 Hanaoka K。 功能分析的homeodomain-containing转录因子Lbx1小鼠骨骼肌卫星细胞 《细胞科学 2007年 120年 23 4178年 4187年 2 - s2.0 - 38349078460 10.1242 / jcs.011668 de Graeve F。 Jagla T。 Daponte j。 Rickert C。 Dastugue B。 城市 J。 Jagla K。 的 飘虫同源框基因基本规范的族群的神经细胞 发育生物学 2004年 270年 1 122年 134年 2 - s2.0 - 2342456392 10.1016 / j.ydbio.2004.02.014 Maqbool T。 太阳系 C。 Jagla T。 Daczewska M。 Lodha N。 Palliyil 年代。 VijayRaghavan K。 Jagla K。 塑造腿部肌肉在果蝇:landybird,守恒的调节器的附属物的肌细胞生成 《公共科学图书馆•综合》 2006年 1 1、文章e122 2 - s2.0 - 36849041027 10.1371 / journal.pone.0000122 Jagla K。 Frasch M。 Jagla T。 Dretzen G。 Bellard算法 F。 Bellardi M。 瓢虫,一个新的组件所需的果蝇的心原性的途径多样化的心脏前体 发展 1997年 124年 18 3471年 3479年 2 - s2.0 - 0030840326 谢弗 K。 纽豪斯 P。 克鲁斯 J。 布劳恩 T。 同源框基因 Lbx1指定一个族群的心脏神经嵴心脏的正常发展的必要条件 循环研究 2003年 92年 1 73年 80年 2 - s2.0 - 0037428172 10.1161/01. res.0000050587.76563.a5 奥尔森 e . N。 基因调控网络的进化和发展 科学 2006年 313年 5795年 1922年 1927年 2 - s2.0 - 33749361499 10.1126 / science.1132292 Wobus a . M。 Boheler k·R。 胚胎干细胞:发育生物学和细胞疗法的前景 生理上的评论 2005年 85年 2 635年 678年 2 - s2.0 - 15544383394 10.1152 / physrev.00054.2003 Boheler k·R。 Czyz J。 Tweedie D。 杨 H.-T。 Anisimov s V。 Wobus a . M。 多能胚胎干细胞的分化为心肌细胞 循环研究 2002年 91年 3 189年 201年 2 - s2.0 - 0037047695 10.1161/01. res.0000027865.61704.32 伊 一个。 罗森特 J。 伊 R。 Abramow-Newerly W。 罗德 j . C。 推导完全细胞而从early-passage小鼠胚胎干细胞 美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国 1993年 90年 18 8424年 8428年 2 - s2.0 - 0027321548 Wobus M。 关 K。 杨 h·T。 Boheler k·R。 Turksen K。 胚胎干细胞作为一种模型对心脏、骨骼肌、血管平滑肌细胞分化 分子生物学方法 2002年 185年 风险中,新泽西,美国 胡玛纳出版社 127年 156年 Chomczynski P。 萨基 N。 单步方法的RNA隔离酸胍盐thiocyanate-phenol-chloroform提取 分析生物化学 1987年 162年 1 156年 159年 2 - s2.0 - 0023277545 曹国伟 Z。 吴 J。 郑 R。 李 f。 熊 Y.-Z。 邓 彭译葶。 分子的描述和表达模式Lbx1猪骨骼肌 分子生物学报告 2011年 38 6 3983年 3991年 2 - s2.0 - 78549269156 10.1007 / s11033 - 010 - 0516 - 1 Rolletschek 一个。 施罗德 i S。 舒尔茨 H。 无角的 O。 许 N。 Wobus a . M。 特征的小鼠胚胎干细胞分化成胰腺血统体外转录分析,定量rt - pcr和免疫细胞化学 国际发育生物学杂志》上 2010年 54 1 41 54 2 - s2.0 - 74249111379 10.1387 / ijdb.082694ar 白金汉 M。 Bajard l 常 T。 Daubas P。 Hadchouel J。 Meilhac 年代。 Montarras D。 Rocancourt D。 Relaix F。 骨骼肌的形成:从体节肢体 解剖学杂志 2003年 202年 1 59 68年 2 - s2.0 - 0037278616 10.1046 / j.1469-7580.2003.00139.x Junion G。 借 l Jagla T。 达桥 j . P。 Tapin R。 Jagla K。 全基因组的细胞命运规范:瓢虫行为在多层次多样化的肌肉和心脏前体细胞 基因和发展 2007年 21 23 3163年 3180年 2 - s2.0 - 36849093461 10.1101 / gad.437307