文化和使用间充质基质细胞在I和II期临床试验

文摘

存在于许多组织,间充质干细胞(msc) /多功能基质细胞可以分化成不同的细胞类型中胚层起源。他们可能已经扩展到多能性,可能性nonmesodermic分化成组织和细胞的来源。通过释放细胞因子、生长因子和生物活性分子,msc在组织修复和炎症起到重要的旁分泌作用。此外,msc non-HLA限制免疫抑制相关免疫抑制特性的能力。所有这些特性导致越来越可能的应用程序范围的msc、从组织和器官修复治疗免疫疾病,应在I和II期临床试验进行测试。使用最广泛的msc从骨髓或脂肪组织培养。临床试验实施、BM msc和ADSCs应按照良好生产规范生产。安全仍是主要问题,必须确保在文化和验证相关的控制。我们描述了一些msc在临床试验中的应用。

1。介绍

从1960年代末到1970年代初,苏联科学家,亚历山大•Friedenstein发现人口的贴壁细胞在骨髓(BM),可以分化为成骨细胞、软骨细胞、造血基质支持细胞(1]。细胞有纤维母细胞形状、播种密度较低时,一些可能形成克隆殖民地,建议前体细胞的存在,克隆形成unit-fibroblasts。因为细胞能够分化成不同的中胚层的血统,他们命名为间充质干细胞(msc) [2]。具备干细胞状态,尤其是msc的长期自我更新潜能尚未肯定,所以首选项是多功能间充质基质细胞3),这两个术语缩写msc。一般来说,msc指原生干细胞在活的有机体内在BM和派生培养细胞。

培养的msc的混合细胞从成熟的基质细胞祖细胞。除了他们的分化潜能,msc具有免疫抑制效应在体外和在活的有机体内通过作用于所有免疫效应器(4]。然而,msc的角色在组织修复并不局限于其分化潜能或免疫抑制效果。事实上,msc具有一致的营养效应由他们生产的各种生长因子和细胞因子(5]。

msc迅速导致调查的这些生物属性使用的细胞疗法在1990年代。卡普兰的团队是第一个通过静脉注射自体,培养的msc在病人安全评价试验(6];5010⁶msc可以安全地注入人类。后,注入msc被用于临床试验治疗疾病,如成骨不全症(7),异染性脑白质营养不良(8),急性心肌梗塞9],移植物抗宿主病(GVHD) [10]。msc还植入治疗骨缺损(11,12]。50多个临床试验相关msc已报告http://www.clinicaltrials.gov。

MSC具有类似属性的人群中发现几乎所有组织在哺乳动物和人类13,14]。其中,脂肪组织是最有前途的MSC-like来源细胞适合临床试验。事实上,因为脂肪基质细胞的描述(ADSCs)祖克和同事,2001年,生成大量的数据表明脂肪组织是最富有的间叶细胞祖细胞来源(ADSCs丰富脂肪组织至少100倍msc在BM)。ADSCs和msc(有很多相同的特征15)但也差异蛋白和功能(16)(表1)。例如,ADSCs有更大的血管生成可能比msc (17]。ADSCs被用于临床试验只要5年之后他们的描述18,19)和10多个临床试验报告http://www.clinicaltrials.gov。从其他来源的临床使用msc,尤其是胎儿,更先进。

在本文中,我们报告当前使用msc和ADSCs的经验。首先我们讨论文化需求和安全问题,然后描述几个正在进行的临床试验。

2。文化需求:从基础研究到临床应用

2.1。培养基

概念和原始数据的证明在体外和在活的有机体内细胞疗法一般领域的收购与细胞来源于文化协议建立了用于研究不一定按照良好生产规范(GMP)规则。因此,在人类注入细胞之前,第一步是替代研究试剂产品适合人类使用。在这一步中,两个主要的问题是准确地适应文化协议以适当的试剂和证明的人类细胞文化展览的所有属性中描述的概念。

不存在完善的规则适应文化协议,但适应必须进步(一次改变一个参数),仔细验证的治疗细胞在每一步的属性。因为动物实验必须谨慎使用(指欧洲共同体的3 r声明:减少替换改进),在体外验证测试必须优先和发达国家为了限制动物实验。例如,血管生成属性可以被估计的剂量的血管生成因子的培养基和/或发布的测量在体外vessel-like结构形成。无论测试,他们必须与预期密切相关在活的有机体内细胞的影响。细胞的适应阶段,产品都必须经过测试在活的有机体内如果可能的话,在小动物模型和大型动物模型。我们讨论后动物模型的实用性和有效性。

特别要注意人类传染性疾病传播的风险由组件的培养基。考虑到这种风险还必须包括的新变异克雅氏病病。此外,通过使用一个包含从一个动物源蛋白培养基,msc可能保留在细胞质中大量的异基因的蛋白质。标准制剂能代表7 - 30毫克的胎牛血清(FCS)蛋白质每100人10⁶msc (20.]。这种程度的蛋白质可能引起免疫反应在活的有机体内可以解释一些失败的MSC细胞疗法(7,20.]。这些数据导致努力减少或消除使用培养基中的异种的组件为临床MSC准备。替换FCS与人类自体或AB血清被提出,但都比FCS似乎更有效。然而,补充中与人类AB血清和纤维母细胞生长因子2可以克服这个赤字(21]。另外,FCS可以取代人类等离子体富含血小板生长因子中,如血小板源生长因子,血管内皮生长因子和血管内皮生长因子。这些细胞因子强烈促有丝分裂的msc,自1980年代以来已使用(22,23]。它们可以通过激活血小板的凝血酶或只是冻结/解冻循环的等离子体破坏血小板释放生长因子(24,25]。根据我们的经验,这对MSC FCS的替代品是有效和ADSC扩张在体外:它减少了至少30%的细胞倍增时间和细胞保持其形态和功能。

需要培养的msc在定义中细胞生产过程之间的同质性是很重要的。在1990年代,至少有两个团队描述配方允许培养的msc组合培养基(26,27]。从那时起,一些公司已经开发出类似的定义媒体MSC文化,不幸的是不包含分子诱导MSC附着力。因此,文化过程需要治疗蛋白质吸附附件(纤连蛋白、胶原蛋白)表面上的文化。此外,配方通常不披露,防止其在临床试验中使用。此外,这些配方不包括生长因子,必须添加到媒体,担心他们没有生产的GMP。下面描述了msc的文化。

2.2。文化设备:封闭系统,第一次的方法

msc的生产,表面附着与接触抑制需要实质性的文化。一旦临床试验需要超过10⁸msc、表面的区域文化超过2000厘米²是必要的,它对应于至少7 300 - cm²培养瓶;这些都是耗费时间来处理,意味着不可忽视的污染的风险。当大量的细胞是必需的,例如,治疗移植物抗宿主病([3 - 8]10⁸每个病人msc),瓶的解决方案将变得难以管理,因为所需的面积超过6000厘米²。一些文化的容器,达到这一表面积与一些单位是不可能的。可能的解决方案是CellStacks(美国康宁公司)和CellFactory (Nunc、丹麦)系统,从一个单位表面积的635厘米²并提供的可能性,2、5、10和每集装箱40阶段。这些设备也可以通过管道连接来执行各种操作(如文化启蒙、介质交换,细胞收获)在一个简单的和受保护的方法。在这种情况下,所有的液体都必须包含在一个表单,确保简单处理(无菌袋与合适的连接)。我们已经与一家制药公司(MacoPharma、法国)来开发一个简单的连接系统的基础培养基是无菌袋(数据准备1,2,3)。这个系统,用于2 -或5级容器,确保简单和快速操作。Ten-stage容器和相关的液袋是如此巨大,他们是繁琐的一个技术人员来管理。所有这些系统需要连接步骤不能严格同化成一个真正的封闭系统:它们必须处理在一个非常干净的环境下(B类区)类流罩。文化的一个生物反应器,自动化的所有步骤,并允许对一个真正的封闭系统可以克服这些限制。这样的机器必须多才多艺,可以消除不必要的不依从细胞,以及媒介交换和细胞的清除。

2.3。安全要求:转换的风险

关于安全,msc在文化的转换过程的风险仍然是一个主要问题。第一份报告以来人类msc自发转化脂肪,2005年(28),另一个团队报告相同的事件与人类BM msc (29日]。在第一项研究中,文化转换过程需要很长一段时间,似乎涉及mesenchymal-epithelial过渡(30.]。关于人类的第二项研究BM MSC变换,令人惊讶的是,这个过程似乎短,频率高的转换。第一报告,然而,有关的所有数据转换后来被发现与污染的上皮肿瘤细胞系在实验过程中(31日]。类似的收缩受到出版第二份报告(32]。在同一时间,使用不同的技术控制,核型,和比较基因组杂交,众多团队报道基因稳定msc在文化(33,34]。此外,在法国,我们使用两种不同clinical-grade文化协议,在几个产品与非整倍性特性,在两个不同的临床试验来研究这些特性的重要性。我们使用核型和荧光原位杂交,也更深的看着衰老的分子机制和转换。Clinical-grade培养人类BM msc、有或没有非整倍性,没有任何选择性的优势,没有在文化和变换达到成年细胞的衰老与正常进化(35]。此外,肿瘤没有出现免疫力低下小鼠注射这些msc。最后,我们证明了大英博物馆msc并不容易遗传不稳定和正常的文化过程中不容易改变。这些数据和前面描述的强烈的论文表明,msc可以安全生产。然而,这些研究导致改善专注于更精确的控制,相关的,和敏感targets-investigating表达式和衰老的主要基因的表观遗传状态和转换途径如p53、p21, p16^ink4a、hTERT和原癌基因。

2.4。动物模型

如前所述,动物模型是必要的安全性和有效性。除了造成潜在缺乏功效,可以遇到用化学药物(例如,没有目标,代谢的差异,药物动力学),人类细胞产品引起宿主的免疫反应反应,拒绝这些细胞。因此,必须测试细胞在免疫缺陷动物,这就意味着最常啮齿动物和老鼠。裸体或严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠已经广泛用于此目的,但他们承担剩余的免疫细胞,可能会干扰人体细胞,因此偏见的结果。因此,老鼠支架或其他免疫功能不全的老鼠必须使用,虽然实验的成本和难度增加。免疫力低下小鼠代表一个异常的免疫细胞疗法的上下文对于许多应用程序。此外,鼠标可能不是与他们相关的病理模型减少寿命比人类和他们的大小,导致困难的功能评价。例如,小鼠心率大约是300 / s,但只有80人/ s;因此,心肌内的注射可能会有问题。另一种解决方案是使用大型动物模型和注入动物细胞生产根据人体细胞的条件一样。 Again, this solution is not completely satisfactory because of the real “active compound” (i.e., human cells are not tested, which implies a specific-cell production protocol because animal cells cannot be produced in the same rooms where human cells are produced). Despite these limitations, regulatory agencies require such validations. Thus, the validation experiments must be a compromise agreed upon by these authorities and must be different and specific to the treated condition.

3所示。临床试验与msc和ADSCs

3.1。急性移植物抗宿主病(aGVHD)

由于msc的免疫调节作用在活的有机体内和在体外因为第一个报告,勒布朗et al。36),msc主要用于治疗或预防aGVHD在同种异体造血干细胞(HSC)移植。这种治疗的效率最大的是肝脏和肠道GVHD和儿童10,37]。一些研究表明,cotransplantation msc与肝星状细胞可以降低aGVHD的发生率38]。2007年,法国法国Greffe de Moelle et Therapie Cellulaire (SFGM-TC)开始了第二阶段的随机安慰剂对照试验corticosteroid-resistant aGVHD在接受同种异体造血干细胞移植的病人中有或没有coinjection BM msc。msc是培养根据SFGM-TC开发的过程和验证由法国监管机构(法国)。试验计划招收78名患者。在5和后两个月电池产品,核型分析显示克隆与非整倍性特征与转换(35),导致暂停审判。实验前悬挂,11个患者登记。如此低的患者数量不允许进行分析的功效,但没有登记病人接受培养的msc显示有害影响,甚至收到了msc与非整倍性的人。潜在不良事件,包括肿瘤,从来没有。这些观察是一致的没有副作用(msc的变换,allosensitization不匹配的msc、增加感染的发病率)期间或其他地方报道后立即注入msc (10,38]。

进一步的研究解决随机使用msc,大群病人正在进行(39]。值得注意的是,用msc治疗aGVHD的免疫抑制效应可能导致复发的频率增加(40]。msc可能是一种有效和安全的治疗和预防aGVHD的方式,但是新的研究应关注患者的风险实现2到4年级aGVHD和内脏器官的患者参与。

3.2。心脏衰竭

心肌梗死后心力衰竭代表不良预后与发病率和死亡率的增加有关。心功能不全的治疗方法近年来发展得很好,但是他们的目的是改善症状,防止病情加重。没有心肌血管再生的可能性,必须考虑其他疗法,如注射msc。希望再生心肌或限制的心室重构的替代机制,电话旁分泌生长因子的释放。小型和大型动物实验已经证明的有效性MSC注射后急性和慢性心肌梗死(41,42]。尽管许多临床试验使用无教养的BM细胞,至少两个临床试验的结果已报告涉及msc。首先,中国队收获BM心肌梗死后8天,培养10天,然后注入细胞内(43]。没有观察到的副作用,心脏壁速度和左心室射血分数(LVEF)值改善治疗组与对照组相比。在第二个随机、双盲、安慰剂对照临床试验的60名患者,39收到冷冻保存同种异体msc静脉注射后1到10天心肌梗死(44),没有不良事件或异位组织形成。接收msc显示显著减少心律失常。LVEF明显改善了在小组前心肌梗死。

因为心肌梗死后心力衰竭的风险很高,我们已经开始第一阶段临床试验评估的可行性和安全性心肌内的注入BM msc在缺血性心脏病患者。我们包括心肌梗死患者心功能不全症状(LVEF和稳定45%)的缺血性起源,没有血管再生的可能性。从这些病人,我们收获15毫升BM, msc被坚持选择塑料和放大在文化在17天。文化是在设备允许执行所有步骤在near-closed系统(见下面的讨论)。msc注入(610⁷梗死msc)在边境地带的位置。试验的主要结果是MSC心肌内的注入在1个月的可行性和安全性。二次结果临床、生物和形态效果在2年随访。我们的目标是验证,第一次,心肌内的注入msc的可行性和安全性改善左心室的收缩功能和降低发病率患者的心功能不全。两个病人已经收到了细胞,并没有表现出不良事件。

3.3。肢体缺血

危重肢体缺血(CLI)是一个与不同等级被铺外周动脉疾病。等级III和IV的特点是慢性缺血性疼痛静止和缺血性皮肤损伤、溃疡或坏疽。这个临床诊断可以证实了脚踝或脚收缩压等血流动力学参数。频率大约是32.5‰之前40年的年龄和71‰以上50年。CLI的年发病率估计范围从500例新病例,每百万在欧盟000每百万在美国,糖尿病是最大的风险因素。约60%的病人应该进行血管再生时技术上可以防止肢体丧失。病人的截肢率约为20%。因为效率低下的治疗当血管是不可能的,额外limb-saving策略,包括细胞疗法,是必需的45]。

一个临床试验的结果涉及自体的CLI BM单核细胞已经出版。总共46名患者接受肌内注射(0.9 - 2.8)10⁹BM单核细胞来自患者在全身麻醉下。结果是令人鼓舞的:70%的患者显示改善氧张力,显著减少痛苦和增加流动性46]。一半的患者报告没有痛苦。第一个积极作用出现就周4,稳定在6个月后治疗。随访显示显著改善腿部疼痛、溃疡大小,和没有痛苦的步行距离保持在治疗后至少2年,尽管踝臂指数和经皮的氧气压力值(没有明显变化47]。

从我们的临床前动物模型得到的数据,我们开始一个阶段我monocentric临床试验评估的可行性和安全性肌内注射自体ADSCs CLI患者的腿没有血管再生的可能性。我们旨在调查预防截肢的可能性很大,减少发病率。患者在局部麻醉下,30克的脂肪组织由抽脂取样。经过消化和离心的样品分离成熟,浮动从基质细胞,脂肪细胞ADSCs选择坚持塑料和放大在文化near-closed系统2周。ADSC注入(10⁸细胞在45分)肌内所有的肌肉腿通过使用网格。

主要结果评估的可行性和安全性的观察局部坏死,血栓形成,地方和一般感染或炎症后6月ADSC注射。二次结果伤口愈合、缺乏截肢,氧张力在脚趾或脚踝,和痛苦。试验的目的是验证,第一次的可行性和安全性的肌内注射ADSCs改善血管的腿。三个病人收到ADSC注射,并没有表现出严重不良事件。这个实验需要包含6更多的病人。

4所示。未来的发展方向

4.1。Allogeny

msc是众所周知的对免疫细胞增殖有抑制作用在体外和在活的有机体内(48,49]。这打开了新的视角观察有关使用msc allogenicity的上下文中,用于创建细胞银行和治疗疾病时没有时间净化和扩大细胞。获得的结果与同种异体细胞类似于同自体的细胞。对心脏、心肌内的注射和系统性的同种异体msc被发现保护心肌活力,改善局部和全局心脏功能在啮齿动物和猪50- - - - - -52]。这一发现与减少疤痕的大小和纤维化和增加血管生成(53]。大多数的影响似乎是由于旁分泌活动(44)和调制的促炎、proangiogenic和免疫调节分子的peri-infarcted心肌(54,55]。然而,移植细胞的存在,这些影响似乎是短暂的44,54,55]。msc还测试了同种异体移植物的免疫抑制特性宽容的同种异体心脏移植模型,对比结果,包括增加拒绝根据细胞剂量和治疗(56,57]。这些相反的结论是令人困惑的,和一个明确的答案在这样一个复杂的领域需要进一步的实验。

描述了ADSCs的免疫调节作用在体外和在活的有机体内(58- - - - - -62年]。这些影响也可能是由于分泌等因素转化生长因子β,肝细胞生长因子,prostoglandin E2,我62年),在一些地区,与MSC效果不同。的确,ADSCs抑制免疫球蛋白生产,但也抑制b细胞功能在更大程度上比msc (63年]。所以使用ADSCs不能MSC使用一个简单而直接的翻译,需要专门的实验。

4.2。电池管理

细胞移植最常见的intratissue交付,但注射后经常发现大量细胞死亡。克服这种局限性,替代cell-delivery系统应考虑。一个解决方案可以使细胞更耐陪同的压力注入。例如,我们已经表明,预处理与褪黑激素增加了生存,旁分泌活动,msc当注入intraparenchymally(效率64年]。这种效果是由于更高的抗氧化应激和分泌proangiogenic因素。另一种有前途的方法可能是工程师生物细胞表有效移植msc通过尊重宿主组织结构。这种方法是成功使用的未分化ADSCs心(65年]。移植后,道表逐渐形成一个厚层,包括新成立的船只,未分化的细胞,心肌细胞。心脏壁变薄被推翻的疤痕面积和心脏功能改善。

最后,针对细胞各种损坏的可能性血液交付网站的吸引力,这些细胞似乎适合,因为他们可以分发给任何组织没有克隆或广泛扩散在目的地站点(66年]。这条路线交货心中已被调查,和药理代理人可以调节它的效率67年]。

5。培养基

虽然增加的报告,其中包括临床试验,建立了msc是适合使用细胞疗法,这种疗法方面的应该改进。关于新的治疗靶点,中枢神经系统疾病,自身免疫性疾病,和皮肤的损伤或角膜,I和II期临床试验应该发达。此外,GMP条件,尤其是相关的安全控制和封闭的系统,必须全面实施,I和II期临床试验应该执行GMP-produced msc。如果msc是有效的在这一过程中,可以实现三期试验和细胞产品最终许可。我们自己的经验是一致的这一结论,在接下来的几年里,细胞疗法与msc或ADSCs将验证,可以帮助治疗大量疾病从骨折不愈合,肢体缺血和心脏衰竭,自身免疫性疾病。

确认

这项工作是由纳(计划:Vieillissement Cardiovasculaire正常et Pathologique Ref DCV20070409252), PHRC MESAMI,图卢兹的楚,与欧盟委员会第七届《外交政策》:级联(没有。223236;健康- f5 - 2009 - 223236)。

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