人类间充质基质细胞的临床应用骨组织工程

文摘

金本位的自体骨移植修复骨缺损,尽管它有缺点的可用性和发病率的收获。骨组织工程中,成骨细胞和支架结合,被认为是一个潜在的移植骨替代策略。原理为骨组织工程使用间充质基质细胞(msc)已经证明在各种动物模型。此外,7人类临床研究到目前为止。因为研究的实验设计和评价参数,而异构,很难得出确凿证据的性能的一种方法。然而,似乎骨头移植msc并列的这些研究观察到但不足以桥大骨缺陷。在这篇文章中,我们讨论了迄今发表的人类临床研究执行骨组织再生,使用culture-expanded nongenetically修改msc从各种来源,提取点考虑未来的临床研究。

1。介绍

骨骼病变/缺陷造成的,例如,创伤,由于烧蚀骨切除手术,或纠正先天性畸形在临床实践中一个常见问题。在大多数的情况下,身体的自愈能力能够修复缺陷。但每年,大约有100万例骨骼损伤,缺陷大小太大或不是最优条件允许治疗(数字1和2)。在这些情况下,需要外部帮助的形式移植骨程序实现联盟(1]。

最常用的骨移植自体和同种异体骨(来源2]。自体松质骨移植是目前临床场景中最成功的,因为除了综合分析和论述,他们是安全的,便宜,而且易于获得的外科医生。然而,获得自体移植病人受到需要额外的手术,因此引入额外的发病率在施主能级和增加手术费用(3- - - - - -5]。此外,移植材料的数量是有限的和感染等并发症的机会,不稳定,和感觉异常施主能级可以影响多达30%的病人(6- - - - - -8]。另一种方法是同种异体骨移植,可以获得授权组织收集和存储的银行从人类尸体骨骼组织7]。通过这种方法,问题与收获相关的数量和移植材料绕过。为了避免与免疫原性相关问题,供体移植可以通过辐照和冷冻干燥等过程变得死气沉沉。不幸的是,这个处理也消除了蜂窝组件,从而减少贪污的osteoinductivity,从而导致新骨形成的速度较慢,与自体移植(9]。

替代自体或同种异体骨移植,外科医生可以使用的合成或天然生物材料制成的支架,促进迁移,增殖,分化骨细胞。在过去的十年中,大量的出版物的论述和综合分析属性说明支架等合成羟磷灰石(HA) (10- - - - - -12],珊瑚公顷[13- - - - - -15),β磷酸三钙和多孔双相磷酸钙16- - - - - -19),磷酸钙水泥(20.),化学处理钛(21),和玻璃陶瓷(22]。然而,成骨的程度和论述属性提供的osteoprogenitor细胞缺损中,超过的支架。改善osteoinductivity,支架材料可以装载有成骨生长因子如骨形成蛋白(bmp)。生长因子方法的缺点是supraphysiological浓度需要获得所需的论述影响,他们的高成本,更重要的是,潜在的异位骨形成(23,24]。

另外,支架可以装满osteoprogenitor细胞为了生成一个活骨移植物在体外,这种方法称为骨组织工程。各种可能的来源osteoprogenitor细胞被认为是。成骨细胞获得自体骨活检,然后扩大在体外一个明显的第一选择是由于nonimmunogenicity。然而,相对较少的细胞分离后获得活检标本,整个过程的耗时的性质和相关的问题与从患者获得成骨细胞骨疾病促使继续寻找更好的选择(1,25]。间叶细胞间质干细胞(msc),也可以获得来自不同组织来源,如骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘提供另一种osteoprogenitor来源的细胞。在骨髓msc被首次发现Friedenstein和同事在1966年(26),随后被命名为间充质干细胞(msc)凯普兰(27]。他们非常有吸引力的研究人员,因为他们可以广泛地扩展在体外获取数字足以治疗骨缺损(28),他们有免疫抑制作用体内,这可能使他们适用于同种异体移植(29日,30.]。msc隔离来自不同来源的分享许多表型和功能特性。然而,根据组织源和隔离方法,其分化潜力变化(31日]。不同组织来源和隔离方法很难确定产生的细胞是否足够相似,允许直接比较。因此,细胞治疗的国际社会提出一组最小标准标签细胞作为MSC (32]。这些包括:)细胞必须塑料附着在维护标准培养条件;()他们必须表达CD105、CD73 CD90和缺乏表达CD 45, CD34, CD14,或CD11b CD79α或CD 19和HLA-DR表面分子;()他们应该分化成成骨细胞、脂肪细胞和内层在体外。Haynesworth等人是第一个把人类从成人骨髓msc与陶瓷支架成功地生成骨在活的有机体内在异位移植到免疫缺陷小鼠(33]。这提供了原理使用hMSCs在骨组织工程的可行性。从那以后很多感兴趣的生成在组织工程领域,导致在体外和在活的有机体内研究不同的支架/细胞组合。修复的概念验证关键尺寸的骨缺陷用组织工程骨移植替代物提供了大量的动物实验(30.,34- - - - - -44),和一些临床研究进行评估这种方法的安全性和有效性。然而,骨组织工程没有发现常规临床实践。

这里,我们现在执行的所有出版的人类临床研究概述目前使用构造生成骨播种与文化扩张,自体,nongenetically修改msc获得各种人类细胞来源,提出可能的建议未来的临床研究设计,并描述未来的研究方向。骨膜细胞没有被包含在本文因为没有研究已经确定了MSC骨膜细胞的性质在临床研究中使用。有先前的报道表明,骨膜细胞实现最小标准被贴上获得理学硕士学位(45- - - - - -48]。然而,有不同的隔离和扩张协议用于这些研究和临床应用的研究中采用细胞(49- - - - - -52]。研究使用骨髓的单核分数或脂肪组织也被排除在外。尽管msc存在于单核分数,其他种群的细胞也形成一个大的一部分分数。

2。在人类临床研究使用自体msc各为骨组织工程细胞来源

组织工程产品的市场发布之前,一个试验性新药申请(NDA)可能必须提交认证监管机构如美国食品和药物管理局(FDA)或欧洲药品局(EMEA)。这后,临床试验必须登记作为第一阶段,第二阶段、第三阶段试验。在阶段1中,获得的证据是对一个特定的安全的方法在一个选定的组患者。一般来说,这些都是小型试验的患者招募不到30。在阶段2中,更多的病人可能的应用包括评估有效性。3期临床试验涉及的多中心临床试验中对300 - 3000年的病人和最终评估有关的治疗相比,目前的黄金标准。完成所有阶段的临床试验后,监管机构审查结果,在做出最终决策之前发布的组织工程产品在市场上。搜索clinicaltrials.gov使用搜索条件,“间充质基质细胞”、“自体msc,”和“骨组织工程”,提供2相关的研究。(1)“治疗股骨头骨坏死的植入自体骨髓细胞,一个试点研究。“这是一个第一阶段的研究,开始于1999年1月和2008年9月竣工。但是,没有出版物描述在文献研究结果目前可用。(2)“自体移植间充质干细胞治疗胫骨远端骨折”。这是一个持续的,阶段1 / 2期研究。这项研究开始于2009年4月,预期主要完成日期是2011年4月。还没有从这个研究结果发表在《文学

设计临床试验不同的随机对照试验(RCT),复制单个主题实验中,队列研究,结果系统的案例研究,病例报告。一般来说,更严格的临床试验的设计,更大的可信度,可以附加到结论来自一项研究的结果。基于方法论的严格适用,相关的层次结构的顶部通常被认为是随机的选择包含在各种治疗的患者组确保否定选择偏见而包容的控制帮助排除混杂因素的影响,可能会影响治疗效果。然而,由于实际参与进行相关的伦理问题,大部分的试验进行人类文学中描述病人和骨组织工程的队列研究或案例报告结果。群组研究提供信息的比例患者积极回应一个给定的治疗技术,病例报告描述使用一个特定的组织工程移植物的效果在一个病人。观察到的结果在后者可以因此特质的具体病人的评价和系统的复制实验获得确凿证据之前是必要的。缺乏控制的队列研究是一个重大的缺点这样的研究设计。然而,这些初步的尝试也有科学研究发展的一个重要的角色,因为他们生成的安全信息,可以提供一些线索和潜在的治疗选择的治疗效果,可能刺激人员执行更复杂的,耗时和昂贵的相关的未来。在本文中,我们列出所有人类临床研究,包括案例报告已经发表在文学,用自体,文化扩张,nongenetically修改,人力msc骨组织工程的目的。这些研究已经获得食品和药物管理局等机构或EMEA的批准。 The ethical approval for conducting these studies has been provided by their respective local university/hospital ethics committees.

第一个临床病例系列展示利用组织工程构建的可行性(TEC),替代自体骨移植治疗长骨缺损,报道了四开et al。53]。2001年,他们描述的初步结果3例(27日,16日和15个月分别参与)遭受不同节段性缺陷(图3)。病人被选中是因为传统手术疗法如Ilizarov技术不包括移植物移植,失败了。Ilizarov的技术依赖于骨再生潜力来填补这一缺口创造人为的通过截骨术受影响的部分,同时保持了骨膜完整,然后分散使用的两半分离固定环固定器(54]。自体是技术上难以执行,因为骨质疏松的程度会给病人留下严重的施主能级发病率。第一个病人是一个41岁的女性,4厘米大的节段性骨缺损的胫骨,第二一个16岁的女性遭受的创伤损失4厘米段右尺骨远端骨干的,而病人3是一个22岁的男性,他们错过了7厘米段正确的肱骨。对所有的病人,大孔100%羟磷灰石(HA)支架定制适合的形状和大小缺陷。这些被装载体外扩大hMSCs隔绝自己的骨髓。所有3例监控片和CT扫描,显示丰富的愈伤组织形成的第二个月参与和良好的集成植入物的高骨形成手术后的第六个月。后续报告6 - 7年手术后报道,植入物显示良好的骨整合,没有进一步的并发症。血管造影评估病人进行3、6.5年手术后还表示形成血管移植区建议至关重要的骨移植部位的存在。然而,没有包括在这项研究中,控制和初始跟踪是只基于辐射评价作者承认不是最优,因为矿物密度高的支架使用很难区分既存的新骨支架(55]。然而,研究表明,执行过程是安全的。

在多年来在最初的试验中,案例研究涉及患者单一组织工程结构在文献中被报道。2007年,Krecic度假等人治疗1股骨粉碎性骨折患者使用TEC和自体松质骨的比2:1 (56]。生成的TEC是播种骨髓msc在多孔calcium-triphosphate颗粒。临床上,研究者声称,病人已经恢复得很好。然而,自体骨的结合与TEC很难得出结论性的推论单独使用TEC骨组织工程的可行性,因为它是不可能确定TEC的个人贡献和自体骨。此外,研究人员仅依靠临床评价和x射线来确定新骨形成。没有计划在控制或活检的病人。同时,实际的缺陷大小没有提到。这个至关重要的大小贪污被发现是至关重要的在决定细胞生存的核心内的贪污。

Hibi等人重建牙槽裂缺陷通过注入文化扩张和osteogenically-induced骨髓MSC与自体富血小板血浆(混合57]。这项研究提供了一个新颖的方法使用自体富血小板血浆作为细胞支架材料。病人术后随访与串行CT扫描显示裂墙后的再生骨延长3个月,6个月后缩小间隙。尚不清楚的是,缺陷是由骨骼组织植入细胞产生的,或是由于osteoconduction形成的边界裂缺陷。

2010年,李等人描述一个成功重建之后,牙科植体放置15厘米的下巴缺陷的节段mandibulectomy由于中央血管瘤在一名14岁的男孩58]。我们执行了三个整形手术。在第一次手术,自体下颌骨切除hemimandibulectomy期间获得作为一个托盘,osteogenic-differentiated自体骨髓干细胞注射纤维蛋白胶。由于缺乏足够的下颌骨生齿的牙科植体安置和恢复,第二次手术涉及垂直牵引成骨与注射自体osteoblastic-differentiated msc。第三个和最后一个手术植入放置7个月后。植入位置切片的时候被植入网站和组织学评价活检显示新成立的可行的板层骨。牙CT图像植入位置确认后4个月持续存在的矿化骨扩张区。

2009年,Mesimaki等人重建上颌骨缺损主要在负责的一个成年病人使用自体脂肪msc(对asc)结合rhBMP-2和βtcp颗粒在微血管重建手术59]。对asc隔离后从腹部皮下脂肪自体血清使用GMP类清洁房间设施,这些细胞被播种βtcp支架。结合细胞之前,支架在基础培养基培养48小时与rhBMP-2补充。这个媒介是丢弃当细胞被添加和新鲜的培养基没有rhBMP-2补充道。细胞支架组合是保存在文化48小时前放置在一个钛笼和随后的植入在病人左腹直肌袋准备abdominus肌肉。肌肉的血管供应是不打扰。8个月后,腹直肌abdominus肌袋打开,钛笼充满了对asc TCP颗粒和宏观上检查。新骨形成在笼子里被临床证实是至关重要的和严格的。活组织检查来自新形成的骨显示组织学正常的成熟的骨骼。随后,腹直肌的血管无法连通abdominus肌肉和肌肉皮瓣组织工程骨一起放置在上颌骨缺损。腹部血管reanastamosed面部血管。 The muscle was left to epithelialize intraorally. The patient was followed up with CT scans. Within two months of the surgery, the muscle flap had almost completely epithelialized, and the shape and normal bone density was achieved in the reconstructed maxilla (Figure4)。四个月后放置的贪污、牙科植入物被放置和他们的主要稳定出色的报道。植入物vt .骨结合,没有任何不良反应报道。这项研究是第一个临床情况异位骨是使用自体对asc微血管重建研究。它演示了使用对asc骨再生的可行性和安全性。然而,对asc的相对贡献rhBMP-2和新骨形成还有待确定。

2007年,一项研究是由Sbayesteh等人对上颌窦后增加涉及6例(60]。在这项研究中,细胞源从髂骨骨髓和载体材料羟基磷灰石/β磷酸三钙(HA / TCP)粒子。3个月后,切片,结果显示41%的平均骨形成。尽管采取了活组织检查,没有骨头的信息分布在脚手架或新形成的骨的来源(供体或受体)。

我们小组报告的另一个临床研究是为了测试使用骨骨组织工程的力量来源于msc播种到羟磷灰石颗粒在6例,牙科植体之前需要重建骨下巴缺陷的位置(图5)[61年]。文化来源于msc被播种的扩大骨羟磷灰石颗粒不同规模从1 - 4毫米³。类似的工作Schimming et al .,支架上的细胞生长7天,以便进一步成骨分化和细胞外基质沉积,然后置于mucoperiosteal皮瓣的缺陷。在这项研究中,两个在体外成骨的能力和在活的有机体内构造的成骨潜能评估使用代表性样本的细胞结构,分别。的在体外潜在的测试进行碱性磷酸酶染色,而在活的有机体内成骨能力的证实了结构植入代表结构,准备以同样方式与实际使用的结构缺陷,在裸小鼠皮下的位置。尽管没有量化的骨形成的这些hMSCs老鼠皮下模型已经完成,我们注意到,所有的结构与细胞植入裸鼠骨形成。四个月后应用程序构造的人类受试者的下巴,在植入的位置之前,活检来自操作网站。骨形成是评估组织学检查在人类患者,其中3,没有观察到的新骨形成。剩下的3 2例骨组织的支架在密切接触的既存的骨骨缺损。这可能是由于迁移的成骨细胞周围的骨组织。只有1例,观察骨形成超过7毫米从先前存在的骨组织。我们认为这是强烈提示新创植入成骨诱导的细胞。上述临床试验的概述介绍了表1。

3所示。临床研究的实验设计

目前临床研究已经表明,它的使用是安全的,hMSCs在骨移植过程。没有报告提到副作用如炎症或过度的组织生长,尽管有这一事实在体外研究表明,msc已广泛培养(4 - 5个月)可以开发基因组不稳定性,可恶性转化的指标(62年- - - - - -64年]。对于大多数临床应用来说,6-8-week扩张阶段提供了足够的细胞数量。这可能解释这一事实没有恶性tec的潜力已经在执行的临床病例观察。然而,为了确保病人的安全,我们建议在未来的临床研究,植入细胞的染色体分析是驴。其次,大多数发表的临床研究有一个后续周期短。我们建议使用更长的跟踪期获取数据TEC的长期安全。

临床研究中给出的数据使其可能嫁接hMSCs能够促进骨再生,它提供了概念证明的潜在用途在骨再生组织工程移植物。然而,缺乏“黄金标准”的控制和客观评价骨等措施量化使用组织学很难从中得出强有力的结论。切片的研究被用来评估骨形成的比例似乎表明,移植细胞的贡献是非常有限的,当然不足以桥批评-大小的缺点。因此,为了能够正常的功效给定骨TE策略对其他试验,我们建议使用一个引用成骨潜能的组织工程移植物。鉴于拥有已被许多研究人员用老鼠进行的,我们想建议的组织工程移植物植入病人将并行评估小鼠和骨形成定量评估。

未来的研究应该试图包括tec的比较与自体骨移植的应用程序。这种类型的研究设计可以提供确凿证据,新的治疗方法的疗效而建立的标准治疗方案。在可能的情况下,这两种类型的植入物应该在同一病人植入。可能的情况时可以在不提高执行伦理问题是当一个双边缺陷的病人需要大量的自体骨移植物可能很难获得没有并发症的高危患者和发病率。在这种情况下,可以用于治疗自体缺陷而另一缺陷之一是与TEC同时治疗。

客观评价方法应该被用来确定新骨形成。病人的样本容量应该足够大以允许获得的数据的统计分析。我们还建议选择手术部位或组织工程支架可以量化的骨组织形成不添加不便病人。例如,我们植入组织工程移植物的下巴,我们能够获得一个活检在常规课程的过程。其他可能性包括组织工程移植物MRI, microCT或其他非侵入性成像策略可以应用于量化骨形成。

在所有描述的临床研究,culture-expanded msc结合了脚手架材料生成侦探。扩张hMSCs可以有不利影响其分化潜力(64年,65年]。例如,班菲等人表明,早在第一段后,骨形成潜在的降低了36倍比新鲜骨髓(66年]。未来的研究应该采用的方法生成tec完全绕过msc在塑料的扩张阶段。研究Warnke et al。67年),Wongchuensoontorn et al。68年]Gan et al。69年,阿斯兰等。70年)已经证明的可行性播种单核或丰富的数量获得msc脚手架材料增强成骨细胞的潜力。

4所示。结束语

骨组织工程可能缓解问题与当前使用的标准治疗骨缺损愈合。然而,成功的侦探使用人类生成msc目前有限的。在大多数情况下,人类msc未能产生临床相关的大量骨而令人信服的msc与其他物种产生足够的骨体积(图6)。因此有必要识别捐助者具有良好的成骨的潜力和投资研究工作在改善的骨形成能力获得hMSCs那些来自其他物种的使用广泛使用异位小鼠模型之前着手未来的临床研究。

捐赠者在细胞的识别具有良好的成骨的潜力依然是骨组织工程的一个主要障碍。到目前为止,还没有文献证据之间的正相关hMSC成骨在体外和骨形成在活的有机体内据报道(71年]。我们组孤立hMSCs从62年捐助者和评估在体外基因表达的签名和谱系分化能力在活的有机体内骨形成能力。我们目前正在研究一个基因,我们相信可以作为一个可靠的诊断标志物在活的有机体内成骨能力(未发表的数据)。

这是特别具有吸引力的知识msc缺乏某些表面标记负责主机使用这种同种异体t细胞反应开辟了可能性与证明骨细胞形成潜在的(72年,73年]。除了是一个现成的保证来源成骨细胞病人也没有接受免疫抑制治疗的好处。此外,同种异体细胞与支架相结合将使它可能有一个标准化的现成的骨组织工程产品,然后可以经常应用于临床。

其他领域的临床前研究重点应包括更有效的识别hMSCs小分支,在体外和在活的有机体内研究msc与“废物”组织如脐带,人类胎盘、羊水,胎儿流产,另类播种策略避免unphysiological扩张msc在塑料和遗传操作的msc (74年- - - - - -76年提高成骨基因的表达和启动的msc使用生长因子如bmp (77年- - - - - -79年)或化合物如营(43维生素D]或[80年)提高成骨能力,同时保持可接受的成本和安全性。当阶段设置了临床研究,应试图优化实验设计。迫在眉睫的需要植骨替代品和好的结果与动物msc、骨组织工程用人类msc可能重返诊所一旦他们的生物性能增强。

确认

作者欣然承认术语智能组合项目的支持荷兰经济部和荷兰教育部,文化和科学。

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