高危未分化多形性肉瘤的深层功能和分子特征

抽象的

非横纹肌肉瘤软组织肉瘤(STSs)是一种50+的癌症，发生于儿童、青少年和成人的肌肉和软组织。每种亚型的稀缺性往往排除了亚型特异性临床前研究，如果一线治疗不足，许多STS患者的治疗选择有限。当临床选择枯竭时，个性化的治疗分配方法可能有助于直接护理患者。在这里，我们报道了一名患有复发未分化多形性肉瘤(UPS)的成年女性STS患者的结果，她自主探索了广泛的个性化临床实验室改进修正案(CLIAs)水平和研究水平的诊断，包括最先进的基因组、蛋白质组学、体外活细胞化疗敏感性试验、患者来源的异种移植模型和免疫取芯。她的治疗选择也多种多样，包括新辅助化疗、放射治疗和手术。辅助和复发策略包括标签外药物和天然药物、几种免疫疗法和N-of-1方法。确定了治疗方法选项，尤其是在测试期间验证的选项在活的有机体内研究，没有引入到临床治疗过程中，但提供了可信的治疗方案，基于fda批准的临床药物。

1.介绍

非横纹肌肉瘤软组织肉瘤(NRSTSs)是一组从婴儿期到老年期发生的50多个软组织肿瘤。由于每种亚型的罕见和有限的临床前研究模型，从基础科学和临床前研究的角度来看，单个NRSTS亚型仍然缺乏服务。少数已建立的临床试验经常将NRSTS作为一个群体而不是单个疾病的谱系(例如，NCT02180867和NCT02267083).远处转移是NRST的主要死亡原因[1]．化疗的不一致反应使得完全手术切除成为NRSTS治疗的一个重要方面。

一项对成人软组织肉瘤患者的回顾性研究分析了基于改良的国际癌症控制联盟（UICC）肿瘤淋巴结转移（TNM）标准的手术切除后的生存率。这两个标准是R0M（切除边缘清晰，包括卫星结节和增殖轮廓）和R1M（包括卫星结节和增生轮廓在内的浸润边缘切除）。38%的NRSTS患者手术被归类为R1M（不完全切除）。按照R0M/R1M状态进行分割时，R0M/R1M手术后的5年无局部复发生存率（LRFS）为92%/63%( ）［1]5年无病生存率（DFS）为69%/32%( ）［1]5年无转移生存率（MFS）为75%/43%( ）［1].在接受化疗或局部放疗的最初无法切除的肿瘤患者中，局部复发/进展后的5年生存率为9%[2，3.].UPS的统计数据显示了当前临床护理标准的局限性，38%的NRSTS患者预计∼仅以手术结果为基础的5年生存率差异为30%。迫切需要新的治疗方法来解决无法切除的肿瘤、残留的局部疾病和肿瘤的远处转移，以改善NRSTS患者的预后。

的称说未分化的多形性肉瘤（UPS）以前被称为恶性纤维组织细胞瘤（MFH），是一种侵袭性恶性软组织或骨肉瘤，发生于远端和近端[4，5].UPS是第四代^th最常见软组织肉瘤，每年每10万人约3例[6]虽然UPS最常见于60-80岁的患者。但UPS通常以肿瘤肿块的存在为特征，导致肿胀、疼痛、癌症引起的病理性骨折和其他全身特征[4，5]．UPS有很高的复发率和显著的转移负担(远端转移比局部转移更有可能，肺是最常见的转移部位)[4，5]．头颈部UPS肿瘤的5年生存率为48%，躯干和四肢UPS的5年生存率为77% [4，5]．在这里，我们提出了一个成年女性患者UPS的案例，重点探讨了个性化治疗的多种方法。处理和事件的时间表在补充图中提供1．

2.结果

2.1.临床表现

我们的索引案例是一名61岁的女性，具有双侧乳腺癌，基底细胞癌和多种Lipomas的历史。她在成像上呈现出肿胀，疼痛的右后缘，含有14厘米的质量。Tru-Cut®活检显示高档（FNLCC级3级）未分化的肉瘤。在额外的成像中没有发现转移的证据，并且她被评估为III阶段T2BN0M0。

2．2.最初的治疗

患者在当地癌症中心开始新辅助治疗，包括一个周期的阿霉素和异环磷酰胺，然后是2个周期的异环磷酰胺与同期放疗，肿瘤减少约30%。一个广泛的切除手术计划将包括她的股骨的一部分被提出。为了避免骨和坐骨神经的损伤，她选择了额外的6轮高剂量化疗，包括4个周期的阿霉素和异环磷酰胺，然后是两个周期的吉西他滨和多西他赛，这导致大约67%的肿瘤缩小，但毒性增加。在新辅助化疗9个月后，患者在一个专门的癌症中心接受了骨和坐骨神经保留手术。获得了清晰的边缘。病理显示为一个5厘米的多形性梭形细胞肉瘤，大多数有丝分裂率低，除了一个2厘米高级别疾病的包埋区域显示多达58个有丝分裂/hpf。从组织病理学上看，治疗效果明显。推荐使用阿霉素和异环磷酰胺辅助化疗3个周期，但患者仅耐受1个周期。

2.3.探索治疗选择

在第二轮Neoadjuvant疗法中，患者实现了她复发的风险是相当大的，并决定扩大她对软组织肉瘤的知识，并探索其处理机构外的机构的肉瘤研究，试验和专业知识。寻求可能适用于她案件的辅助治疗临床试验，但没有人可以使用。因此，她决定使用资源和专业的管理经验来调查自己的治疗方案和研究资源。

该患者得到了一位经验丰富的医学辩护医生（合著者M.R.）的持续帮助为她提供与其疾病类型相关的信息，并帮助她探索潜在的策略，以克服其相对罕见的癌症的有限信息和研究。患者随后寻求许多非标准治疗选择，以寻求有效和持久的治疗反应。探索非标准治疗方法在治疗方案方面，手术切除的肿瘤组织被送往多个实验室进行分析，希望能提出更精确、毒性更小的辅助治疗建议。

2.4.商业离体药敏试验

加工直播手术切除的肿瘤组织以产生一种原发性细胞培养，然后将其暴露于与肉瘤相关的各种单一剂和组合化疗和/或靶向治疗药物。使用类似的实验室方法，两个独立的商业实验室（合理治疗和Weisenthal实验室）在编程的细胞死亡化学敏感性的基础上测试了药物功效。商业化学敏感性测试鉴定，具有互借性协调（具有相同解释的8个测试剂，补充表1)，几种肿瘤可能敏感的药物，包括伏立诺他汀、α干扰素、达卡巴嗪、奥沙利铂，Serratia marcescens.（科利毒素）、青蒿素、苯丁酸、顺铂和吉西他滨联合用药、长春瑞滨和拉帕替尼联合用药（补充表1）.预测患者此前接受过阿霉素、异环磷酰胺、吉西他滨和泰索帝等药物的耐药性或低敏感性(补充表)1）.基于体外化疗敏感性结果和前几轮大剂量化疗对生活质量的挑战，患者选择不再继续使用化疗敏感性分析预测会产生耐药性的化疗药物。俄勒冈健康与科学大学(OHSU)进行的一项单独的研究级别敏感性分析将在后面的章节中介绍。商业之间的一致性体外分析和研究水平敏感性分析见补充表2．

2．5．免疫疗法

患者还进行了癌症免疫治疗，重点是在美国癌症研究协会年度会议上提出的维持免疫治疗方案[7]随后，一位当地综合医师向患者开出了一种改良的Recchia方案，使用低剂量皮下白细胞介素2（1-120万单位）和口服顺式维甲酸（0.5%） mg/kg），每周三次，每隔一周。患者能够获得并使用基于皮下胸腺刺激物称为胸腺肽α（1.6）的维持性免疫治疗 毫克（每周两次）[8该项目已在美国以外获得批准。她还安排了白细胞摘除和接受个性化树突状细胞疫苗[9]．

2.6.其他健康方法

进行地形测试以确定各种维生素、矿物质、炎症标志物、凝血标志物和免疫标志物的潜在可作用血液水平，从而补充特定维生素（特别是维生素D）、姜黄素、绿茶提取物、ω-3脂肪酸和蘑菇提取物。患者还优化了她的睡眠计划，并参与了各种身心方法，包括积极的物理治疗和训练计划，以从手术中恢复并改善身体健康。

2.7. 异种移植模型的建立

患者肿瘤组织样本（表示为PCB-209）在手术切除肿瘤组织后被送往我们的实验室。从活组织样本中创建原代细胞培养，执行研究级靶向药物敏感性小组，并通过测序合作伙伴进行全基因组和转录组测序。肿瘤组织与Jackson实验室共享（JAX），其中在小鼠（PDX模型TM00381）中建立了患者来源的异种移植物（PDX），以便对潜在的化疗药物和靶向治疗药物进行下游评估。对数标度表达数据显示高度相关性(ρ = PCB-209原发肿瘤和PCB-209 PDX肿瘤之间（图1（a） ）和原发肿瘤组织与PDX肿瘤组织的苏木精和伊红染色分析（图1(b)和1(c)移植前后组织学一致。PCB-209的代表性免疫组化图像显示存在形态蛋白质组分析或发表的UPS生物学中感兴趣的蛋白质[10，11] （数字1（d） -1(h))。

2.8. 研究级药敏试验

原代PCB-209组织进行培养，随后用PPTI Version 2.1单剂化学筛选进行筛选。由于原代培养细胞生长缓慢，PCB-209原代培养仅在60种培养基中筛选出19种(补充表)3.）.从已建立的PCB-209 PDX小鼠模型中移植的肿瘤组织进行培养，并用PPTI Version 2.1单剂化学筛选进行筛选(补充表)3.)原代培养与PDX反应数据的比较表明，原代培养对CDK9抑制（alvocidib）敏感；PDX培养对Mao/自噬途径抑制（奎那克林）和GLI1/2抑制（甘氨酸61）敏感；对蛋白酶体抑制（卡非佐米布）和ALK/MET抑制（克唑替尼）敏感在整个研究水平筛选和商业筛选中，中度克唑替尼敏感性是一致的。化学筛选共鉴定出16种化合物对PCB-209 PDX细胞培养具有活性。

2.9。基因组和转录组分析

从PCB-209原发肿瘤组织分离的DNA和RNA被发送到全基因组和整个转录组测序。基因组分析主要是由下一代测序（NGS），由基础医学、CARIS和OHSU的基因组分析共享资源进行。

注意到10个可采取行动的改变，其中包括几个FGF的基因,CCND1和埃姆西扩增基因，ALK获得TP53和CDKN2A/B损失，和突变ATRX（F529FS）。没有FDA批准的药物或特异性临床试验匹配鉴定的基因异常。NGS还确定了12个不明意义的变种。当时，进行基因组分析，并未报道微卫星基因的状态。尽管如此，所有三种测试的微卫星相关基因（MSH2，MSH6和PMS2)完好无损。

由于基因组图谱结果在临床上不可行，患者委托进行了一项文献综述，以检查已发表的已识别基因异常和一般变异基因异常的研究(即。，而不是针对患者的特定突变），以确定可能的非标签药物或具有公开活性的天然产品。大多数变异基因都引用了基于细胞系的实验，用于进一步个性化她的佐剂补充计划。

还送出来自PCB-209主要肿瘤组织和PCB-209 PDX外植体组织的RNA用于转录组测序以确定PDX建立后基因表达的整体基因表达并鉴定全身变化。基因组和转录组数据总结在Circos Plot格式（图2)和表格格式（补充表4）.

2.10。Morphoproteomic免疫组织化学分析

形态蛋白质组学分析（免疫组化小组）鉴定和量化福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的蛋白质表达组织切片以确定患者特异性治疗方案。Morphoproteomic免疫组化分析由休斯敦德克萨斯大学健康科学中心布朗实验室进行。12]，重点研究肿瘤的高级别部分，显示IGF1R和PRKCA为主要的上游信号传感器驱动程序，mTOR为下游效应因子。COX2、SIRT1、STAT3、HIF1A、PPARG、NES、CD133、GLI2和SPARC的高蛋白表达区。推荐的药物包括白蛋白结合的紫杉醇和标签外药物或天然药物，包括二甲双胍、COX2抑制剂、vorinostat和褪黑激素。形态学蛋白质组分析的建议参考了细胞系和动物研究。患者选择放弃化疗和HDAC抑制剂，但开始服用二甲双胍(850 mg/天)，COX2抑制剂和褪黑激素(20 mg/夜)。形态蛋白质组分析结果见补充表5．

2.11.概率目标抑制图建模

概率目标抑制图(PTIM)建模[13- - - - - -18]将患者特异性化学筛选数据与匹配的基因组和转录组测序数据相结合，以设计个性化的药物组合。PTIM模型确定了药物组合，其中单个药物可能不会减缓或阻止肿瘤生长，但组合后会协同和减缓肿瘤生长。PCB-209 PDX化学筛选数据的PTIM建模分析（图3（a）)整合PCB-209基因组和转录组测序数据（图3（b）)的多目标解释体外并用于预测ABT-737 (BCL2抑制剂)与midostaur(多激酶抑制剂)的有效联合用药。PTIM建模独立于形态蛋白质组学分析，仅集成PCB-209 PDX化学敏感性分析数据和基因组和转录组分析数据(补充表)6）.

2.12.患者来源的异种移植治疗选择和验证

用病人肿瘤建立的病人来源的异种移植模型进行手术在活的有机体内测试多种可能的治疗方案。结果在活的有机体内试验以治疗开始后21天的肿瘤体积表示，选择作为实验终点（图1）4）.

2.12.1。全基因组测序

全基因组测序确定了几个不可操作的变体，包括ALK基因。虽然没有明确的联系ALK扩增结果显示，PCB-209对克唑替尼具有中度敏感性体外（补充表格3.）;因此，我们选择alk抑制剂crizotinib在活的有机体内PDX验证显示，与对照组相比，肿瘤生长没有显著的减缓( ，图形4（a））.

2.12.2。化学筛选

两种临床可用的化合物具有最低的绝对IC₅₀值(panobinostat, pan-HDAC抑制剂，和carfilzomib，蛋白酶体抑制剂)从研究水平的化学敏感性分析中选择在活的有机体内PDX验证。Panobinostat对PCB-209原代培养也有效果(补充表)3.).发现panobinostat和carfilzomib抑制靶点均在原发性和PDX肿瘤组织中表达（图1(我))。卡非佐米对肿瘤生长没有显著的抑制作用( ，图形4（b）)而panobinostat显示肿瘤生长在统计学上显著放缓( ，图形4（c））.

2.12.3。免疫组织化学分析

基于免疫组织化学的分析结果和现有药物协同作用的证据[19]促使选择塞来昔布（COX2抑制剂）和曲美替尼（未通过形态蛋白质组学免疫组化（IHC）分析鉴定的MEK抑制剂）用于在活的有机体内验证。塞来昔布和曲美替尼联合使用是可能的在活的有机体内但无统计学意义( ，图形4（d））.

2.12.4。概率目标抑制剂图建模

PCB-209数据建模的数据建模与中豚素的ABT-737组合的选择在活的有机体内验证。单独地，预计ABT-737和中豚（中豚素都没有表现出疗效在活的有机体内但是结合起来会显示出协同作用和功效。

正如预测的那样，PTIM引导的单一药物并没有显示出肿瘤生长的统计显著放缓( ，图形4（e）).由于试验结束时的重复率较低在活的有机体内实验中，ptim引导组合无法进行统计学分析。然而，ptim引导的联合治疗在肿瘤体积最小时进行了跟踪在活的有机体内（µ= 450毫米^3.图形4（e））.

2.13.复发和结局

第一次手术后15个月，持续了大约18个月，PET/CT成像(体格检查较少)显示她大腿软组织改变，强烈提示局部复发，导致几次额外的手术。三次只发现良性组织变化，但两次发现恶性细胞。值得注意的是，在良性部位和复发部位的组织化学评估显示了相当大的免疫激活(在恶性组织中，每高能场有多达49个CD8+肿瘤浸润淋巴细胞)。最后，在最初诊断大约3.5年后，她的上肢出现了广泛的侵袭性疾病，需要右腿截肢。几周内，在她的骨盆和下腹部发现了迅速增长的疾病。医生尝试了一个短期的适应症外的伊匹单抗和派姆单抗治疗，但患者很快死亡。

概率目标抑制剂图（PTIM）模型如图所示3.捕获了3个试验组：第一个PTIM区块将高选择性HDAC抑制剂帕诺比诺司他（panel C）确定为可行的治疗方案。Block 2将蛋白酶体抑制剂carfilzomib确定为可行的选择。RNA-seq知情模型中的区块3（原始模型中的区块4）确定ABT-737（一种BCL2和BCL2L1抑制剂）和米多司他林（一种AKT2抑制剂）的组合是一种可行的治疗选择。由于PCB-209显示出体外对环唑替尼的反应和ALK扩增的存在。形态蛋白质组学方法将二甲双胍、伏立诺达、褪黑素和塞来昔布与Abraxane联合作为可行的治疗方法，这激发了塞来昔布和曲美替尼（一种未经IHC分析鉴定的MEK抑制剂）的结合由于药物协同作用的现有证据而进行验证[19]值得注意的是，vorinostat是一种pan-HDAC抑制剂，类似于panobinostat，它显示在活的有机体内功效，但有IC₅₀高于临床可达到的浓度。IHC激发的方案是由德克萨斯大学休斯敦医学院罗伯特布朗博士提供的形态蛋白质组数据独立开发的。布朗博士的建议没有得到严格遵守；因此，我们将塞来昔布和曲美替尼的联合称为“IHC激励”。IHC驱动的组合未以任何方式涉及PTIM建模方法。

由于杰克逊实验室的技术考虑导致队列规模较小，ABT-737 + midostaurin队列无法进行完整的统计分析。然而，通过化学筛选和PTIM模型确定的个体药物显示在活的有机体内活动，ABT-737 + midorestaurant趋势协同效应。总的来说，三种治疗方案中有两种可能是相关的，ABT-737加midostauin和panobinostat能够减缓在活的有机体内肿瘤生长。请注意，对于图（E）中的ABT-737和米多司他林组，两种药物单独具有轻微的减缓肿瘤生长的能力，但联合使用似乎可以更大程度地减少肿瘤生长。

3.讨论

虽然精准/个性化的治疗选择方法并没有导致在患者的临床过程中添加靶向治疗药物，但患者特异性临床前模型和数据集的发展有潜力实现变革性的个性化癌症护理。此外，患者选择根据通过多次检测提供的数据来改变她的补充健康选择和临床决定。诊断为高级别UPS后的中位生存期为9.6个月(8.2个月至11.4个月，95% CI) [20.].尽管有多发性癌症病史，但该患者在UPS诊断后存活了3.5年，复发后存活了16个月。

作为治疗选择的工具，每种模型开发和分析方法都有其固有的优点和缺点。虽然为PCB-209建立了PDX模型，但大约50%的患者肿瘤不会移植[21]此外，尽管预测准确率很高，但模型建立的时间表以及PDX开发和测试的成本对许多患者来说可能是令人望而却步的(∼87%）的低通道PDX模型[21]病人肿瘤的分子测序现在是一种快速、可靠和经济的选择。然而，大约60%的患者没有可操作的测序结果[22，23]单一药物治疗往往无法持续控制疾病进展[24]形态蛋白质组学和类似的基于IHC的方法可以检测肿瘤细胞中蛋白质的存在，而肿瘤细胞通常是靶向治疗的相互作用伙伴。不幸的是，基于IHC的方法的吞吐量仍然低于基于测序的方法，因此将分析范围限制在一小部分基因上。功能方法提供了通过靶向治疗药物（如PTIM方法）或单个基因的单靶点敲除（如高通量siRNA筛选，未对患者肿瘤进行）证明干预效果，这可能是临床决策所需的关键数据。功能性方法依赖于新鲜和存活的肿瘤组织的可用性，这可能会导致后勤方面的挑战，或者如果没有足够的肿瘤组织可用，则可能无法获得。选择合适的技术和方法开发个性化治疗我将取决于时间、组织和财政资源的可用性。尽管如此，对于每年60万癌症患者来说，推进精确和个性化医学临床应用的需求是压倒性的[5]．

PCB-209病例是每年发生的众多神秘和高危UPS病例的代表。然而，我们发现了重要的功能关系和可行动的靶标和化合物，这可能对理解和治疗UPS有潜在价值集体为未来的病人。此外，该病例报告强烈提醒人们，一旦一线疗法不再控制疾病，UPS就缺乏临床试验或临床验证的治疗选择。虽然开发更多的临床前资源和测序实验将有助于对UPS的科学理解，但复发的稀有性和频率需要在可行的情况下为复发的UPS确定个性化治疗方案，特别是当个性化将是可行治疗的唯一途径时。

4.方法

4．1.细胞模型的建立

人类未分化多形性肉瘤（UPS）样本PCB209是通过家族性和散发性肿瘤儿童癌症登记处（CCuRe FAST）肿瘤银行计划获得的。PCB209肿瘤组织在手术切除后24小时接受。肿瘤组织被切碎并用胶原酶消化（10 分离的细胞在RPMI-1640培养基（11875085；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）中培养，并添加10%胎牛血清（FBS）（26140079；Thermo Fisher Scientific）和1%青霉素链霉素（15140-122；Thermo Fisher Scientific），然后在37°C/5%CO下培养₂. 肿瘤组织被送往杰克逊实验室（JAX），在那里建立了PCB209的PDX模型。PCB-209 PDX型号分配给JAX型号ID TM00381。所有参加CCuRe FAST的患者都提供了知情同意书，临床和病理信息保存在一个身份不明的数据库中。该研究的所有方面均由俄勒冈健康与科学大学（OHSU）机构审查委员会（IRB）审查和批准。

4．2．PCB209全基因组测序分析

用Illumina HiSeq 1000对端测序，用Illumina BaseCall软件筛选质量。使用Bowtie将Reads映射到参考人类基因组(NCBI build 36.1, hg18) [25]，并标记和移除可能的PCR重复。当变异至少有三次支持读取并构成至少10%的位置覆盖率时，SNV被确定为可能的变异。如果该变异在匹配的正常人中至少有8倍覆盖率，并且该变异在不到两次读取和2%的时间内发生，则称为体细胞变异报道。

复制数变化被量化为分段规范化日志₂-转化肿瘤/正常外显子覆盖率。CNVer[26]用于将基因称为获得或丢失，需要外显子拷贝数增加或丢失30%（比率）≥1.3或≤0.7）将该基因称为获得或丢失。测序分析基于先前公布的方法[27]．

4．3．PCB209和PCB209X RNA深度测序分析

PCB209转录组文库采用Illumina HiSeq 1000对端测序，Illumina BaseCall软件过滤。使用Bowtie将Reads修剪到85个mers，并与参考人类基因组(NCBI build 36.1, hg18)对齐[25]。映射到转录本的阅读覆盖率在每个位置求和，结果除以转录本长度乘以样本中的阅读次数乘以一百万。

4.4。化学屏幕

使用定制60剂靶抑制剂筛网筛选PCB209一次肿瘤培养物，其表示小儿临床前检测序列版本2.1（PPTI屏幕）。基于每个化合物的公布的活性范围，在[10,100,1000,100,000nm]或[100,1000,10,000,100,000nm]中检测所有筛选剂。复合物购自第三方供应商，包括Selleck Chem和Sigma-Aldrich。在384孔板中以5000个细胞/孔的384孔板涂有PCB209的主要细胞培养物。将筛选板在37℃/ 5％CO中孵育₂，72小时。按照制造商的方案，通过CellTiter Glo®发光细胞活性测定（类别G7570，普罗梅加，麦迪逊，威斯康星州）评估细胞活性，并使用BioTek Synergy HT平板阅读器（BioTek，Winooski，VT）定量发光。单剂IC₅₀数值的计算是通过在Microsoft Excel中进行山曲线拟合，然后手工管理和修正。

4.5.患者来源的异种移植模型开发

组织共享的所有方面都经过俄勒冈健康与科学大学机构审查委员会的审查和批准。在JAX将肿瘤组织块植入4 - 6周龄女性免疫缺陷NOD中，生成PCB209的PDX模型。Cg -Prkdc^SCID.Il2rg^tm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠。当移植的肿瘤生长到∼1000 嗯^3.，肿瘤被切取并分成多个3-5个部分 嗯^3.将片段重新植入5只6-8周龄雌性NSG小鼠的新队列中进行第1代扩增，并将额外片段送去进行质量控制评估（见下文）或冷冻保存在10%二甲基亚砜中。P1肿瘤生长至1000 嗯^3.被收获并分为四个部分，每个用于质量控制，对基因组学的冻结，RNA-SEQ的rnalater（Ambion），并分成3-5毫米^3.切片并在10%二甲基亚砜中冷冻保存。

PDX模型开发质量控制程序包括测试LCMV（淋巴细胞序列炎病毒），细菌污染和肿瘤细胞含量的原发性肿瘤。使用短串联重复（str）测定，P0和P1肿瘤片段是指DNA指纹纹理，以确保随后的通道中的模型来源。

人CD45（IR75161-2，安捷伦科技公司）的免疫组织化学（IHC）在石蜡块中嵌入的移植肿瘤组织上进行，以确定淋巴成像。人ki67（IR62661-2，安捷伦科技公司）和波形蛋白（IR63061-2，安捷伦科技公司）的IHC移植瘤H&E切片由委员会认证的病理学家（RGE）审查，以评估移植瘤与患者肿瘤之间的形态学特征一致性。

型号信息可访问http://tumor.informatics.jax.org/mtbwi/pdxDetails.do?modelID=TM00381．

4.6. 概率目标抑制图（PTIM）建模

我们使用了PTIM建模[16，17，28]整合PCB209药物数据和RNA测序数据，为PCB209选择个性化药物组合。

RNA-seq整合。我们使用量化的表达数据来消除化学筛选结果中可能的假阳性，并促进PTIM建模目标中的真阳性。在这里，我们在4fpkm处对初级和PDX RNA序列的最小平均基因表达设定阈值，以确定PTIM计算模型中的潜在包含。RNA序列数据整合如下：(我)T:药物筛选靶标(2)G:用RNA-seq表达筛选药物靶点(3)主要的，重要的（十）：靶基因表达x在原发肿瘤样本中（iv）PDX（十）：靶基因表达x在移植的PDX肿瘤样本中（五）µ（x)：[小学(x) + PDX(x) / 2（六） 如果µ（x≥4，保持目标x审议（vii） 如果µ（x) < 4，删除目标x从考虑（八） 守住目标x审议

PTIM模型确定了ABT-737的两种药物组合 + midostaurin是PCB-209的一种有前途的组合。补充表中提供了PTIM建模数据集6．

4.7。Morphoproteomic分析

形态蛋白质组分析由Robert Brown博士进行，独立于化学筛选、测序和个性化治疗分配的PTIM建模方法。形态原体分析以前曾在多篇出版物中进行过描述[29- - - - - -31]．PTIM建模和基因组/转录组数据的化学筛查都没有参与选择IHC动机药物组合。

4.8.统计

在PCB209 PDX实验中，使用Kruskal–Wallis方差分析（KW ANOVA）统计检验评估治疗后肿瘤体积变化的显著性。所有统计检验均为双侧，显著性水平为5%。

4.9。研究批准

所有纳入CCuRe-FAST的患者均提供知情同意。该研究的所有方面都由俄勒冈健康与科学大学(OHSU)机构审查委员会(IRB)审查和批准。

在杰克逊实验室进行的所有动物手术都是按照《实验室动物护理和使用指南》进行的，并得到了杰克逊实验室动物护理和使用委员会的批准。

数据可用性

高通量RNA测序数据可通过Gene Expression Omnibus (GEO, Accession ID GSE138269)获得，全基因组测序数据可通过European genome - phenome Archive (EGA, Accession ID EGAS00001003981)获得。访问受保护的数据需要遵守各自数据库系统的要求。

伦理批准

该研究的所有方面都由俄勒冈健康与科学大学(OHSU)机构审查委员会(IRB)审查和批准。在杰克逊实验室进行的所有动物手术都是按照《实验室动物护理和使用指南》进行的，并得到了杰克逊实验室动物护理和使用委员会的批准。

同意

所有纳入CCuRe-FAST的患者均提供知情同意。

的利益冲突

研究人员N.E.B.，C.K.，和R.P.之前已经提交了个性化联合治疗任务的概率靶向抑制剂图谱方法的发明披露，该方法已通过儿童癌症治疗发展研究所授权给First Ascent Biomedical Corp.作者声明了这些冲突所有其他作者声明不存在利益冲突。

作者的贡献

NEB进行了计算建模和分析，设计和分析了实验，撰写了手稿，并监督了研究。CG和MQ进行测序数据分析。MG对肿瘤组织进行加工培养，并进行药物筛选实验。MC监督了杰克逊实验室的小鼠研究。RGE代表Jackson实验室对PDX植入小鼠进行组织学分析。BSH和JEM协助进行统计分析。RP辅助设计和分析计算模型。MR和LM提供患者病史和临床资料。CK协助数据分析，手稿准备，并监督研究。

致谢

作者感谢杰克逊实验室的Susie Airhart博士、Carol Bult博士和Jim Keck博士，感谢他们在患者来源的PCB-209异种移植研究中的帮助和支持。作者感谢患者分享了临床和研究层面的数据，从而理解了UPS。作者还感谢罗伯特·布朗博士、杰米·布里亚内克博士和贝拉维·帕特尔女士提供了与形态蛋白质组学分析相关的显微照片。作者感谢Mathew Geltzeiler博士、Emma Cantor和Elaine Huang为这个项目提供的技术援助。

补充材料

补充表1。商业体外试验结果和一致性表的结果转录从两个独立的商业体外对患者进行化疗敏感性分析。提供两种商业筛选试验药物的商业分析结果的比较和一致性。补充表2。体外分析业绩的体外商业服务和研究水平的敏感性测定体外靶向治疗筛查。补充表3。PCB209药物筛查结果研究水平的敏感性结果体外靶向治疗敏感性试验。在原发性PCB209癌细胞和取自PCB209患者来源的异种移植物（PCB209X）的癌细胞上进行了相同的药物筛选试验。补充表4。DNA和RNA测序数据来自于DNA测序实验（识别突变和拷贝数变化）和RNA测序实验（量化基因表达），这些实验跨单个基因排列。补充表5。形态蛋白质组学结果来自PCB209咨询蛋白质组学报告，详细说明了免疫组化实验中分析蛋白质的得分和位置。补充表6。合并药物筛选和测序合并并对齐来自DNA和RNA测序实验的数据以及PCB209原代培养和患者来源异种移植物培养研究级药物筛选结果，在药物和基因水平组织。补充图1。本手稿中描述的关于患者护理、商业和研究级实验、复发和结果的事件时间表。（补充材料）

参考文献

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