肉瘤 肉瘤 1369 - 1643 1357 - 714 x Hindawi 10.1155 / 2020/6312480 6312480 研究文章 深功能和分子特性的高风险的未分化的多形性肉瘤 https://orcid.org/0000 - 0001 - 8666 - 3152 Berlow 诺亚E。 1 2 3 格拉索 凯瑟琳。 3 林鸽 迈克尔·J。 3 程 名山 4 Gandour-Edwards Regina 5 埃尔南德斯 布莱恩。 6 Michalek 乔尔·E。 6 瑞安 克里斯多夫 7 首位 保罗 7 https://orcid.org/0000 - 0002 - 9311 - 5901 朋友 Ranadip 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 5931 - 4915 几百万 林恩。 8 https://orcid.org/0000 - 0002 - 9311 - 5901 Renneker 马克 9 10 https://orcid.org/0000 - 0003 - 2505 - 7487 凯勒 查尔斯 1 2 Verhoef Cornelis 1 儿童癌症治疗发展研究所 比佛顿 或97005 美国 cc-tdi.org 2 电气和计算机工程 德州理工大学 卢博克市 TX 79409 美国 ttu.edu 3 Hematology-Oncology分工 加州大学 洛杉矶 CA 90095 美国 berkeley.edu 4 杰克逊实验室 巴尔港 我04609 美国 jax.org 5 病理学和实验室医学系 加州大学戴维斯分校卫生系统 萨克拉门托 CA 95817 美国 6 流行病学和生物统计学 圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心 圣安东尼奥 TX 78229 美国 uthscsa.edu 7 医学院的 俄勒冈州健康与科学大学 波特兰 或97239 美国 ohsu.edu 8 放射肿瘤学部门 斯坦福大学 斯坦福大学 CA 94305 美国 stanford.edu 9 Patient-Directed磋商 旧金山 CA 94116 美国 10 家庭医学部门 加州大学旧金山 旧金山 CA 94143 美国 ucsf.edu 2020年 1 6 2020年 2020年 09年 12 2019年 07年 02 2020年 10 02 2020年 1 6 2020年 2020年 版权©2020诺亚大肠Berlow et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

Nonrhabdomyosarcoma软组织肉瘤(STSs)是一类50 +的癌症中出现肌肉和软组织的儿童,青少年和成年人。罕见的亚型常常导致无法subtype-specific临床前研究,使许多患者STS有限的治疗方案一线治疗应该是不够的。当临床选择是筋疲力尽,个性化治疗分配方法可能有助于直接病人护理。在这里,我们报告的结果一个成年女性STS复发患者未分化的多形性肉瘤(UPS) self-drove探索一系列广泛的个性化临床实验室改进修正案(clia)水平和研究水平诊断,包括先进的基因组,蛋白质组, 体外活细胞化学敏感性测试,patient-derived异种移植模型,和immunoscoring。她的治疗选择也是多样的,包括新辅助化疗、放疗和手术。佐剂和递归策略包括药物和天然药物,一些免疫疗法,N-of-1方法。确定治疗方案,特别是在进行验证 在活的有机体内研究中,并没有引入临床治疗过程中,但基于fda批准的临床人员提供合理的治疗方案。

 1。介绍

Nonrhabdomyosarcoma软组织肉瘤(NRSTSs)是一组50 +软组织肿瘤发生,从婴儿到老年时代。由于罕见的亚型和有限的临床前研究模型,个人称说亚型保持缺医少药的基础科学和临床前研究的视角。建立的一些临床试验通常对待称说光谱作为一个群体,而不是一个单独的疾病(例如, NCT02180867和 NCT02267083)。远处转移是称说[死亡的主要原因 1]。对化疗的反应不一致使得完整手术切除称说疗法的一个重要方面。

成人软组织肉瘤患者的回顾性研究分析手术切除后生存基于修改国际癌症控制联盟(UICC) tumor-node-metastasis (TNM)标准。两个标准R0M(切除明确利润包括卫星结节和扩散轮廓)和R1M(切除渗透利润包括卫星结节和扩散轮廓)。称说病人手术中有百分之三十八被分类为R1M(不完全切除)。当分段R0M / R1M状态,5年当地recurrence-free生存(探测器)R0M / R1M手术后是92% / 63% ( p = 0.001 )[ 1),5年无病生存期(DFS)是69% / 32% ( p < 0.001 )[ 1metastasis-free), 5年生存率(MFS)是75% / 43% ( p = 0.007 )[ 1]。在最初不可切除的肿瘤患者接受化疗或局部放疗,局部复发/进展后的5年生存率为9% ( 2, 3]。UPS的统计数据显示当前临床护理标准的局限性,38%的称说患者期望∼30%差异5年生存仅根据手术的结果。新疗法是非常需要解决不可切除的肿瘤,剩余当地疾病和肿瘤远处转移改善称说患者的治疗结果。

的称说 未分化的多形性肉瘤(UPS),原名恶性纤维组织细胞瘤(瘤),是一个激进的恶性软组织或骨肉瘤发生远侧地和检查( 4, 5]。UPS是4th最常见的软组织肉瘤,大约每100000人/年(3例 6),发生在年龄谱,困扰儿科,年轻的成年人,和成人患者中,尽管UPS最常发生在60 - 80岁的病人。UPS常常表现为肿瘤质量导致的肿胀、疼痛、癌症病理骨折,和额外的系统特性( 4, 5]。UPS具有高复发和重大转移负担(远处转移比地区,更有可能与肺最常见转移网站)( 4, 5]。整体头部和颈部UPS肿瘤5年存活率为48%和77%,躯干和肢体UPS情况下( 4, 5]。这里,我们目前的情况下成年女性患者,关注多种方法探索个性化的治疗。治疗的时间表和事件中提供了补充图 1。

 2。结果 2.1。临床表现

我们的指示病例是一个61岁的女性历史的双边乳腺癌、基底细胞癌、多发性脂肪瘤。她出现肿胀,痛苦的正确后大腿上发现成像质量包含14厘米。Tru-cut®活检显示高档(FNLCC等级3)未分化肉瘤。没有转移的证据被发现额外的成像,和她被评为第三阶段,T2bN0M0。

 2.2。最初的治疗

病人开始在当地与新辅助治疗癌症中心,组成的一个循环的阿霉素和异环磷酰胺,其次是2周期异环磷酰胺与并发放射治疗引起肿瘤减少大约30%。广泛切除手术计划,包括她提出了股骨的一部分。为了避免牺牲的骨骼和坐骨神经,她选择了6轮组成的高剂量化疗4周期阿霉素和异环磷酰胺紧随其后的是两个周期的吉西他滨和多西他赛导致肿瘤大小减少约67%,但与增加毒性。经过9个月的新辅助化疗,病人骨和坐骨神经保留手术在一个专门的癌症中心。明确的利润。梭形细胞肉瘤病理显示5厘米的多形性,大多数的有丝分裂率很低,除了嵌入式2厘米面积更高年级的疾病出现58有丝分裂/高通滤波器。从组织病理学治疗效果很明显。三个额外的辅助化疗周期与阿霉素和异环磷酰胺是推荐,但病人只能容忍一个周期。

 2.3。探索治疗选项

在第二轮的新辅助治疗,病人终于明白她的复发的风险是相当大的,决定扩大她的软组织肉瘤和探索知识的肉瘤的研究,试验,在机构和专业知识在她治疗机构。辅助治疗的临床试验可能适用于她的案件被寻求,但是没有找到合适的工具。因此,她决定用她的资源和专业管理经验调查自己的治疗方案和研究资源。

病人招募的持续帮助一位经验丰富的医学提倡医生(合著者m . r .)为她提供信息相关的疾病类型和帮助她探索潜在的策略来克服有限的信息和研究可供她比较罕见的癌症。病人随后追求很多非标准的治疗选择追求有效和持久的治疗反应。探索非标准治疗选项,从手术切除肿瘤组织被送到多个实验室进行分析,希望更精确和更少的有毒辅助治疗建议将出现。

 2.4。商业<斜体>体外< /斜体>化学敏感性分析

处理现场手术切除肿瘤组织创建一个主细胞培养,然后暴露于各种单药和联合化疗和/或与肉瘤相关靶向治疗药物。两个独立的商业实验室(理性疗法和Weisenthal实验室)测试药物功效程序性细胞死亡的基础上使用类似的实验室方法化学敏感性。商业化学敏感性测试发现,与多个实验室的一致性(4 8测试代理相同的解释,补充表 1),一些药物的肿瘤可能是敏感的,包括vorinostat,干扰素,达卡巴嗪,铂, 粘质沙雷氏菌(绿青鳕的毒素)、青蒿素、phenylbutyrate,顺铂和吉西他滨,vinorelbine和拉帕替尼(补充表 1)。电阻或低敏感性预测药物病人以前处理包括阿霉素、异环磷酰胺,吉西他滨,泰索帝(补充表 1)。基于体外化学敏感性结果和生活质量的挑战前几轮的大剂量化疗,患者选择不追求进一步使用化疗药物预测耐药的化学敏感性分析。一个单独的研究水平灵敏度分析在俄勒冈州健康与科学大学(也是OHSU)在后面一节中介绍。商业之间的一致性 体外分析和研究水平的敏感性分析中提供了补充表 2。

 2.5。免疫疗法

病人也追求癌症免疫疗法,重点维护免疫治疗协议在美国癌症研究协会的年度会议( 7]。随后,当地的一个综合医生规定病人修改Recchia协议使用低剂量皮下白介素2(1 - 1.2单位)和口服cis-retinoic酸(0.5毫克/公斤)每周3次,每隔一周。病人能够获得和使用维护免疫疗法基于皮下胸腺刺激器称为thymosin-alpha(1.6毫克,每周两次) 8)已批准在美国以外的地区。她还安排leukapheresis和获得个性化的树突状细胞疫苗( 9]。

 2.6。额外的健康方法

地形执行测试来识别潜在的可操作的血液水平的各种维生素,矿物质,炎症标记物,凝固标记,和免疫标记,导致补充与特定的维生素(特别是维生素D)、姜黄素、绿茶提取物、ω- 3脂肪酸,和蘑菇提取物。病人也优化她睡眠时间表和从事各种身心的方法,包括积极的物理治疗和训练计划从手术中恢复和改善身体健康。

 2.7。异种移植模型开发

从病人的肿瘤组织样本(表示pcb - 209)被送到实验室后手术切除的肿瘤组织。从活组织样本,创建一个主细胞培养,研究水平目标代理敏感性面板进行,并通过测序进行全基因组和转录组测序的合作伙伴。肿瘤组织与杰克逊实验室(JAX),共享一个patient-derived异种移植(PDX)成立于一只老鼠(PDX模型TM00381),使下游的评估潜在的化疗和靶向治疗药物。对数表达式数据显示高度相关( ρ= 0.9432)之间的pcb - 209原发肿瘤和pcb - 209 PDX肿瘤(图 1(一))和苏木精和伊红染色分析原发肿瘤组织和PDX肿瘤组织(数字 1(b)和 1(c))显示组织学移植前后一致。代表包含IHC pcb - 209图像显示存在感兴趣的蛋白质从morphoproteomic分析或发表UPS生物学( 10, 11)(图 1(d) - 1(h))。

RNA-seq和组织学的pcb - 209。PTIM RNA-seq数据确定目标和多个pcb - 209染色图像。RNA-seq和组织学的数据被用来部分指导群 在活的有机体内PDX审判。(一)RNA-seq pcb - 209与pcb - 209的表达PDX。(b))。(c) PDX)污渍。(d)为COX2染色。GLI2 (e)染色。(f) ki67的染色。为活跃(g)染色。PRKCA (h)染色。(我)RNA-seq RPKM发表在日志中2对目标识别的格式PTIM通知RNA-seq数据分析。红色代表高表达,绿色表示低表达。左列的表达式是原始细胞培养,和右列是文化创建的异种移植小鼠的表达式。

 2.8。研究水平化学敏感性分析

主要pcb - 209组织培养和随后筛选PPTI 2.1版单剂化学屏幕。由于初代培养细胞生长缓慢,pcb - 209的主要文化在只有19个播出60代理(补充表 3)。肿瘤组织移植的pcb - 209 PDX小鼠模型建立培养并筛选与PPTI 2.1版单药化学屏幕(补充表 3)。小学文化的比较与PDX响应数据显示灵敏度CDK9抑制(alvocidib)的主要文化;对毛/自噬途径抑制(奎纳克林)和GLI1/2抑制PDX文化(甘特图61);和一致性对蛋白酶体抑制(carfilzomib)和碱性/抑制(crizotinib)。温和的crizotinib敏感性是一致的在研究水平屏幕和商业屏幕。化学筛选确定共有16个化合物与pcb - 209 PDX细胞培养的活动。

 2.9。基因组和转录组分析

DNA和RNA分离出pcb - 209主要肿瘤组织被全基因组和全转录组测序。基因组分析主要是通过下一代测序(门店),由基础医学、Caris,也是OHSU的基因组分析共享资源。

十个可操作的变化被发现,包括几个 FGF的基因, CCND1和 EMSY放大的基因, 碱性增益, TP53和 CDKN2A / B损失,和一个突变 ATRX(F529fs)。没有fda批准的药物临床试验或sarcoma-specific匹配识别基因异常。门店还发现了12意义不明的变体。当时,基因组进行分析,微卫星基因的地位并没有报道。尽管如此,这三个测试microsatellite-related基因( MSH2, MSH6, PMS2)完好无损。

因为基因分析结果不是临床可行的,病人委托发表的文献回顾检查研究确定变异的基因异常,异常基因( 即。,而不是为病人的特定突变)22变体基因识别可能的药物或天然产物与出版活动。大部分的变异基因已从细胞基于行的实验相关的引用,这被用来进一步个性化辅助补充计划。

RNA与pcb - 209原发肿瘤组织和pcb - 209 PDX外植体组织也派整体基因表达转录组测序以确定和识别系统性PDX建立后基因表达的变化。基因组和转录组数据中总结圆环图格式(图 2(补充表)和表格格式 4)。

圆环的pcb - 209 RNA序列和全基因组测序数据。最外层的圆圈代表日志数据2按比例缩小的基因表达(绿色代表消极的,红色代表积极)确定突变的基因拷贝数变化。中间的圆圈代表确定突变的基因或indels(黑色)或缺乏(白色)。最里面的圆圈代表拷贝数变化(粉色是放大,淡蓝色的是删除,白色是没有变化)。基因突变和放大( TNS3, BRINP1, RABEP1, CDH4)都写在蓝色的圆,和基因有关 在活的有机体内研究( HDAC1, 碱性, GL1, HDAC3, FLT4, PSMB8, HDAC2, JAK2, PSMB5, MAP2K1, PRKCA, BCL2, MAP2K2, AKT2, BCL2L1, MAPK1)。

 2.10。Morphoproteomic免疫组织化学分析

Morphoproteomic分析(免疫组织化学小组)资格和量化蛋白质表达从福尔马林固定,石蜡包埋组织(FFPE)幻灯片识别特定病人的治疗方案。Morphoproteomic免疫组织化学的分析是由布朗实验室休斯顿德克萨斯大学健康科学中心( 12)和集中在纯度更高的部分肿瘤显示IGF1R和PRKCA主要上游信号传感器驱动程序和mTOR下游效应器。高蛋白COX2的表达领域,SIRT1, STAT3, HIF1A, PPARG, NES, CD133 GLI2,和SPARC也确定了。建议包括albumin-bound紫杉醇和标示外代理或天然药物包括二甲双胍,COX2抑制剂,vorinostat,褪黑激素。Morphoproteomic分析建议引用细胞株和动物研究。病人选择放弃化疗,HDAC抑制剂但却开始二甲双胍(850毫克/天),COX2抑制剂,褪黑激素(20毫克/晚上)。Morphoproteomic补充表中给出了分析结果 5。

 2.11。概率目标抑制地图建模

概率目标抑制地图(PTIM)建模 13- - - - - - 18)集成不同化学筛选数据匹配的基因组和转录组测序数据来设计个性化的药物组合。PTIM建模识别药物组合的个体可能不减缓或阻止肿瘤生长但结合将协同和减缓肿瘤的生长。PTIM建模分析pcb(图- 209 PDX化学筛选数据 3(一个))和集成电路板(图- 209基因组和转录组测序数据 3 (b))确定目标解释 在体外化学屏幕敏感性和用来预测是一个有效的药物组合,abt - 737 (BCL2抑制剂)midostaurin (multikinase抑制剂)。PTIM建模是独立于morphoproteomic只分析和集成电路板- 209 PDX化学敏感性试验数据和基因组和转录组分析数据(补充表 6)。

概率目标抑制剂(PTIM)模型映射的PCB209 xenograft-derived化学屏幕。橙色的文本显示目标被赎- 737;蓝色文字表示目标midostaurin所抑制。(一)儿科临床前测试计划(PPTI) 60通知PTIM化学屏幕。(b)通知PTIM RNA-seq + PPTI化学屏幕。PTIM模型用于指导大PDX的一部分 在活的有机体内试验显示在图 2。数字中列出个人框表示按比例缩小的灵敏度值,1是一个高度敏感的目标组合和0是一个无效的抗/目标的组合。

 2.12。Patient-Derived异种移植治疗选择和验证

的patient-derived异种移植模型建立了从病人的肿瘤是用于执行 在活的有机体内测试多个潜在的治疗方案。结果 在活的有机体内测试提出了肿瘤卷21天治疗开始后,选为实验端点(图 4)。

pcb - 209 xenograft-derived 在活的有机体内试验结果。意味着肿瘤体积的杰克逊实验室的所有治疗组pcb - 209 patient-derived异种移植(PDX)模型 在活的有机体内临床前研究。(一)crizotinib-treated PDX小鼠肿瘤的生长( n= 6)与控制( n= 4)。(b) carfilzomib-treated PDX小鼠肿瘤的生长( n= 7)与控制( n= 4)。(c) panobinostat-treated PDX小鼠肿瘤的生长( n= 8)与控制( n= 4)。(d)肿瘤生长的塞来昔布( n= 5),trametinib - ( n= 5)和塞来昔布+ trametinib-treated ( n= 4)PDX老鼠与控制( n= 4)。(e)肿瘤生长的abt - 737 ( n= 7)midostaurin ( n= 8)和abt - 737 + midostaurin-treated PDX老鼠( n= 2)与控制( n= 4)。的 p值的计算没有midostaurin + abt - 737由于低人口样本,由星号表示。低数量的模型组合实验是由于微生物杰克逊实验室的注意事项。在(a e),终点是治疗天30 -。

 2.12.1。全基因组测序

全基因组测序发现几个nonactionable变异,包括放大 碱性基因。虽然不是特别相关 碱性放大,pcb - 209显示中度敏感crizotinib 在体外(补充表 3);因此,ALK-inhibitor crizotinib被选中 在活的有机体内PDX验证,无显著减缓肿瘤的生长与控制( p = 0.5 ,图 4(一))。

 2.12.2。化学筛选

两个临床可用的化合物绝对最低的IC50值(panobinostat pan-HDAC抑制剂,carfilzomib蛋白酶体抑制剂)选择研究水平的化学敏感性分析 在活的有机体内PDX验证。Panobinostat还显示效果在pcb - 209主要文化(补充表 3)。panobinostat和carfilzomib抑制目标被发现表达主要和PDX肿瘤组织(图 1(我))。Carfilzomib无显著减缓肿瘤生长( p = 0.2 ,图 4 (b)),而panobinostat显示显著的肿瘤增长放缓( p < 0.05 ,图 4 (c))。

 2.12.3。免疫组织化学分析

Immunohistochemistry-based分析结果和现有药物协同作用的证据 19)动机的选择塞来昔布(COX2抑制剂)和trametinib (MEK抑制剂不被morphoproteomic免疫组织化学(包含IHC)分析) 在活的有机体内验证。塞来昔布和trametinib显示可能的组合 在活的有机体内效果但没有统计学意义( p = 0.5 ,图 4 (d))。

 2.12.4。概率目标抑制剂地图建模

PTIM建模pcb - 209数据引导的选择与midostaurin abt - 737的结合 在活的有机体内验证。单独,abt - 737和midostaurin都预测不显示效果 在活的有机体内但结合显示协同作用和功效。

正如预测的那样,PTIM-guided单一代理没有显示显著减缓肿瘤生长( p = 0.148 ,图 4 (e))。由于低复制的结论 在活的有机体内实验中,PTIM-guided组合不能分析统计学意义。然而,PTIM-guided组合跟踪以最低的肿瘤体积 在活的有机体内( µ= 450毫米3,图 4 (e))。

 2.13。复发和结果

15个月后首次手术和扩展在接下来的大约18个月,由PET / CT成像(体检)显示软组织改变她的大腿强烈提示局部复发,导致一些额外的手术。三次,只有良性组织变化被发现,但发现恶性细胞的两倍。值得注意的是,在良性的网站和组织化学评估复发网站显示相当大的免疫激活(恶性组织中,有49个CD8 +肿瘤浸润淋巴细胞/高功率的字段)。最后,大约3.5年之后她的早期诊断,疾病成为广泛侵入她的大腿,要求右腿截肢。几周之内,快速增长的疾病被发现在她的骨盆和腹部。一个简短的标示外ipilimumab pembrolizumab未遂,但病人很快就死了。

概率目标抑制剂地图(PTIM)模型呈现在图 3捕捉试验3组:第一个PTIM块标识panobinostat面板(C),一个高度选择性HDAC抑制剂,作为一个可行的治疗方案。块2标识carfilzomib,蛋白酶体抑制剂,作为一个可行的选择。块3 RNA-seq-informed模型中的简单模型(4块)标识的组合abt - 737 (BCL2 BCL2L1抑制剂)和midostaurin (AKT2抑制剂)作为一个可行的治疗方案。Crizotinib被确认由于pcb - 209显示 在体外应对crizotinib和碱的存在放大。vorinostat morphoproteomic方法确定二甲双胍,褪黑素,和塞来昔布与Abraxane作为可行的治疗方法,启发塞来昔布的结合和trametinib (MEK抑制剂不被包含IHC分析)进行验证由于现有药物协同作用的证据 19]。值得注意的是,vorinostat panobinostat pan-HDAC抑制剂类似,显示 在活的有机体内功效,但IC50以上临床可行的浓度。IHC-motivated方案是独立开发使用morphoproteomic罗伯特·布朗博士提供的数据在休斯顿德克萨斯大学的医学院。布朗医生的建议没有精确地跟随;因此,我们学期塞来昔布和trametinib“IHC-motivated”。IHC-motivated组合并不涉及PTIM建模方法。

由于小队列大小造成杰克逊实验室的技术因素,abt - 737 + midostaurin队列不能拥有一个完整的统计分析生成的。然而,个别药物发现的化学显示屏幕和PTIM模型 在活的有机体内活动,和abt - 737 + midostaurin协同效应趋势。总的来说,两三个治疗方案可能相关,abt - 737 + midostaurin panobinostat能够缓慢 在活的有机体内肿瘤的生长。注意,abt - 737 + midostaurin挽面板(E),这两种药物单独有轻微的结合能力减缓肿瘤生长但似乎提供更大的减少肿瘤的生长。

 3所示。讨论

虽然精度/个性化治疗选择方法并没有导致的靶向治疗药物,病人的临床过程,针对病人的临床前模型和数据集的发展有可能使变革个性化的癌症治疗。此外,病人选择改变她补充提供健康的选择和临床决策基于数据通过多种化验。中等长度的生存高档UPS后诊断为9.6个月(8.2个月至11.4个月,95% CI) ( 20.]。尽管多种癌症的历史之前,病人存活3.5年之后她的UPS诊断和16个月后复发。

作为治疗选择的工具,每个模型的开发和分析方法固有的优点和缺点。而PDX模型建立了pcb - 209,大约50%的患者肿瘤不会灌输( 21]。此外,模型建立和时间表PDX开发和测试的成本可以禁止许多病人,尽管预测精度高(∼87%)低PDX模型( 21]。病人肿瘤的分子测序现在是一个快速、强劲、经济的选择。然而,大约60%的患者熊没有可操作的测序结果( 22, 23],单一药物治疗往往不能可持续控制疾病进展( 24]。Morphoproteomics和类似IHC-based方法询问蛋白在肿瘤细胞的存在,这往往是靶向治疗的互动合作伙伴。不幸的是,IHC-based方法保持低吞吐量比sequencing-based方法,从而限制分析的范围小的一组基因。功能方法通过靶向治疗药物提供干预效果的证据(如PTIM方法)或单目标击倒的单个基因(如高通量siRNA屏幕,不执行病人的肿瘤),可临床决策所需的关键数据。功能方法依赖于可用性的新鲜和可行的肿瘤组织可以导致后勤挑战或可能无法访问如果不足肿瘤组织。选择适当的技术和方法发展的个性化治疗取决于可用性的时候,组织,和金融资源。尽管如此,需要推进临床使用精度和个性化医疗是压倒性的每年600000年输给了癌症患者( 5]。

pcb - 209例是代表众多的神秘和高风险的UPS每年发生的情况下。然而,我们发现了重要的功能关系和可操作的目标和化合物可能是理解和治疗UPS的潜在价值 集体为未来的病人。另外,这种情况下报告作为提醒了人们缺乏的临床试验或者临床验证治疗选择UPS一旦前线治疗不再控制疾病。而额外的临床资源开发和测序实验将有助于进步的科学理解,复发的稀有和频率需要确定个性化的治疗方案对复发性UPS只要可行,尤其是个性化将是唯一的一个可行的治疗之路。

 4所示。方法 4.1。细胞模型的建立

人类无差别的多形性肉瘤(UPS)样本PCB209是通过儿童癌症登记处家族和零星的肿瘤(CCuRe-FAST)肿瘤银行项目。PCB209肿瘤组织收到了24小时后手术切除。肿瘤组织是剁碎,用胶原酶消化(10毫克/毫升)一夜之间在4°C。在媒体rpmi - 1640细胞培养分离(11875085;热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)补充10%胎牛血清(的边后卫)(26140079;penicillin-streptomycin热费希尔科学)和1% (15140 - 122;热费希尔科学),然后在37°C / 5%孵化有限公司2。肿瘤组织在一夜之间被杰克逊实验室(JAX),创建PCB209 PDX模型。pcb - 209 PDX TM00381模型被分配到JAX模型ID。所有的病人参加CCuRe-FAST提供知情同意,临床和病理鉴定数据库信息维护。所有方面的研究进行了综述和批准的俄勒冈健康与科学大学(也是OHSU)机构审查委员会(IRB)。

 4.2。PCB209全基因组测序分析

孤立的DNA测序的Illumina公司1000年HiSeq paired-end模式和质量由Illumina公司BaseCall过滤软件。读取被映射到参考人类基因组(NCBI构建36.1,hg18)使用领结( 25,可能重复PCR标记,删除。SNV被认定为可能的变体时,至少有三个变体支持读取和构成覆盖至少10%的位置。体细胞变异被称为如果变体至少8 x覆盖匹配正常,和变异发生在不到两读和2%的覆盖率。

拷贝数变化被量化为分段标准化日志2改变肿瘤/正常外显子覆盖率。cnv ( 26)是用来调用基因得到或者失去,需要一个外显子的拷贝数30%的收益或损失(比≥1.3或≤0.7)基因的获得或丢失。测序分析是基于先前发表的方法( 27]。

 4.3。PCB209 PCB209X RNA深度测序分析

转录组PCB209库测序Illumina公司HiSeq 1000 paired-end模式和过滤的Illumina公司BaseCall软件。读取被削减85 -即和对齐参考人类基因组(NCBI构建36.1,hg18)使用领结( 25]。报道读取映射到在每个位置,记录总结,其结果是除以成绩单长度乘以读入样本的数量乘以一百万。

 4.4。化学屏幕

PCB209原发肿瘤文化是使用自定义放映60代理目标抑制剂屏幕表示儿科临床前测试计划屏幕2.1版本(PPTI屏幕)。所有筛选代理进行了测试在(100、1000、10000 nM)或(100、1000、10000、100000 nM)发表的基于每个化合物的活动范围。化合物从第三方供应商购买包括Selleck化学和Sigma-Aldrich。镀PCB209主要细胞培养RPMI增长媒体在384 - 5000细胞/孔板预印和药物。筛选板块在37°C / 5%孵化有限公司2为72小时。细胞生存能力评估CellTiter-Glo®发光细胞生存能力分析(猫。G7570 Promega,麦迪逊,WI)制造商的协议后,发光是量化BioTek协同HT板读者(BioTek Winooski, VT)。单药集成电路50值通过希尔曲线拟合计算在Microsoft Excel紧随其后的是人工管理和改装。

 4.5。Patient-Derived异种移植模型开发

组织的所有方面综述了分享和俄勒冈健康与科学大学批准的机构审查委员会。PCB209 PDX模型生成JAX在4-6-week-old植入肿瘤组织块在女性免疫缺陷NOD.Cg - Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/ SzJ (NSG)老鼠。当道肿瘤增长∼1000毫米3肿瘤是收获,分成多个3 - 5毫米3块采集卵子并种植到一个新的群五6-8-week-old女性NSG老鼠通道1扩张,和额外的碎片被质量控制评估(见下文)或低温贮藏在10% DMSO溶液。P1肿瘤增长到1000毫米3收获,分为四个部分,分别为质量控制,快速冻结对基因组学、RNALater RNA-seq (Ambion),分割成3 - 5毫米3块,低温贮藏在10% DMSO溶液。

PDX模型开发质量控制程序包括测试的主要肿瘤淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒),细菌污染,肿瘤细胞的内容。P0, P1肿瘤片段DNA指纹使用短串联重复序列(STR)试验,以确保模型来源在随后的段落。

免疫组织化学(包含IHC)人类CD45 (IR75161-2,安捷伦科技)进行道肿瘤组织嵌入在石蜡块识别便。包含IHC人类ki67 (IR62661-2,安捷伦科技)和波形蛋白(IR63061-2,安捷伦科技)被用来确保传播肿瘤是人类而不是鼠。道肿瘤)部分综述了在有执照的病理学家(RGE)评估形态特性道肿瘤病人肿瘤之间的一致性。

模型信息的访问 http://tumor.informatics.jax.org/mtbwi/pdxDetails.do?modelID=TM00381。

 4.6。概率目标抑制地图(PTIM)建模

我们使用PTIM建模( 16, 17, 28)整合PCB209药品数据和RNA序列数据为PCB209选择个性化的药物组合。

RNA-seq集成。我们使用量化表达数据从化学屏幕消除可能出现的假阳性结果,促进真正的阳性PTIM建模的目标。这里,我们最低阈值的意思是基因表达在小学和PDX RNA-seq 4 FPKM确定PTIM可能涉及的计算模型。RNA-seq数据集成如下:

T:药物屏幕目标

G:药物屏幕目标与RNA-seq表达式

主 (x):基因表达的目标 x在原发肿瘤样本

PDX (x):基因表达的目标 x在外植PDX肿瘤样本

µ( x):[主 x)+ PDX ( x)/ 2

∀ x ∈ T ∩ G 如果 µ( x)≥4,保持目标 x考虑

∀ x ∈ T ∩ G 如果 µ( x)< 4,删除目标 x从考虑

∀ x ∉ T ∩ G 保持目标 x考虑

PTIM建模确定了联合用药的abt - 737 + midostaurin pcb - 209是一种很有前途的组合。PTIM建模数据集提供了补充表 6。

 4.7。Morphoproteomic分析

Morphoproteomic分析是由罗伯特·布朗博士独立于化学筛选、测序,PTIM建模方法个性化治疗任务。Morphoproetomic分析以前多个出版物中描述( 29日- - - - - - 31日]。无论是PTIM建模还是化学筛选基因组和转录组数据参与IHC-motivated药物的选择组合。

 4.8。统计数据

在PCB209 PDX实验中,肿瘤体积的变化的重要性与治疗评估克鲁斯卡尔-沃利斯方差分析(千瓦)方差分析统计测试。所有统计测试是双边的显著性水平为5%。

 4.9。研究批准

所有的病人参加CCuRe-FAST提供知情同意。所有方面的研究进行了综述和批准的俄勒冈健康与科学大学(也是OHSU)机构审查委员会(IRB)。

杰克逊实验室的所有动物程序执行依法进行了实验动物保健和使用指南和被批准的机构动物保健和使用委员会杰克逊实验室。

 数据可用性

RNA高通量测序数据可通过基因表达综合(地理,加入ID GSE138269)和全基因组测序数据可通过欧洲Genome-Phenome存档(EGA,加入ID EGAS00001003981)。访问受保护的数据需要遵守各自的数据库系统的需求。

 伦理批准

所有方面的研究进行了综述和批准的俄勒冈健康与科学大学(也是OHSU)机构审查委员会(IRB)。杰克逊实验室的所有动物程序执行依法进行了实验动物保健和使用指南和被批准的机构动物保健和使用委员会杰克逊实验室。

 同意

所有的病人参加CCuRe-FAST提供知情同意。

 的利益冲突

调查人员n . e . B。c K。,R。P。have previously filed invention disclosures for the Probabilistic Target Inhibitor Map methodology for personalized combination therapy assignment, which has been licensed through the Children’s Cancer Therapy Development Institute to First Ascent Biomedical Corp. The authors have declared these conflicts to their respective institutions, which have conflicts of interest management plans in place. All other authors declare that there are no conflicts of interest.

 作者的贡献

内执行计算建模和分析,设计和分析实验,写手稿,负责监督这项研究。CG和MQ进行测序数据分析。MG加工和养殖肿瘤组织和执行药物筛选实验。MC监督杰克逊实验室老鼠的研究。RGE进行组织学分析PDX植入老鼠代表杰克逊实验室。BSH和杰姆协助统计分析。RP辅助设计和分析的计算模型。先生和LM提供病历和临床信息。CK与数据分析,协助手稿准备,负责监督这项研究。

 确认

作者感谢苏茜Airhart博士,卡罗尔•布尔特博士和吉姆·杰克逊实验室的凯克的援助和支持patient-derived异种移植研究pcb - 209。作者感谢病人的临床和研究水平的数据共享理解UPS。作者还要感谢罗伯特·布朗女士杰米•Buryanek博士和Bheravi Patel morphoproteomic分析相关的显微照片。作者感谢马修Geltzeiler博士,艾玛·康托尔和伊莲黄与这个项目相关的技术援助。

 补充材料

补充表1。商业体外试验的结果和concordance-table转录从两个独立的商业结果 体外化学敏感性分析表现为病人。提供商业分析人员之间的比较和结果的一致性测试在两个商业屏幕。补充表2。 体外分析业绩的 体外敏感性分析的商业服务和研究水平 体外靶向治疗的屏幕。补充表3。PCB209药物屏幕results-sensitivity研究水平的结果 体外靶向治疗敏感性分析。同一药物屏幕测试以初级PCB209癌细胞,癌细胞以及来自PCB209 patient-derived异种移植(PCB209X)。补充表4。DNA和RNA序列从DNA测序实验数据结果(识别突变和拷贝数变化)和核糖核酸测序实验(定量基因表达)在单个基因一致。补充表5。PCB209 Morphoproteomics-results协商蛋白质组学报告执行,详细成绩,并从免疫组织化学实验分析蛋白质的位置。补充表6。合并药物屏幕和sequencing-merged并从DNA和RNA序列对齐的数据实验和PCB209主要文化和patient-derived异种移植文化研究水平药物屏幕结果,组织在药物和基因水平。补充图1。这手稿中描述事件的时间表在病人护理方面,商业和研究水平实验,复发,结果。

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