骨关节炎大鼠背根神经细胞疼痛行为与KCNA2表达的关系

摘要

客观的．探讨骨关节炎(OA)大鼠背根神经节(DRGs)中钾电压门控通道A亚家族成员2 (KCNA2)表达与疼痛行为的关系。方法．雄性sd大鼠随机分为3组:空白对照组(C组)、生理盐水组(S组)和OA组。分别于注射前1天和注射后1、2、4、6周测定脱爪机械阈值(PWMT)和脱爪热潜伏期(PWTL)。在注射后1周、2周、4周和6周，分析膝关节病变及DRGs中活化转录因子-3 (ATF-3)和KCNA2的表达。结果．与注射前相比，OA组在注射后2、4和6周PWMT和PWTL均显著降低( 或0.01)。与C组（注射后的C组，PWMT和PWTL）相比，在群组中，在oA组（ 或0.01)。在组OA中，一周发现轻微的局部关节软骨表面破坏。软骨表面破坏逐渐发展，软骨基质的脱脂和骨增生越来越加剧，最终在第二个星期内进化到晚期OA。与C组相比，ATF-3表达显着增加，射击后六周的组OA中KCNA2表达显着降低（ 或0.01)。与基线相比，OA组中ATF-3表达显著升高，KCNA2表达显著降低( 或0.01)。结论．OA大鼠疼痛行为与DRGs中KCNA2表达降低相关。

1.介绍

骨性关节炎是老年人的常见病，影响骨骼和运动系统;65岁及以上人群患病率超过50%，75岁及以上人群患病率约为80% [1]．疼痛是OA最重要的症状，也是影响人类健康和致残的主要原因[1，2]．然而，对OA疼痛的发病机制知之甚少，缺乏针对性的治疗和控制OA疼痛的措施。非甾体抗炎药物[3.，4]和阿片类药物[5，6]对缓解OA疼痛有一定的影响，但长期使用这些药物具有很大的副作用，它们不能从根本上逆转或延迟疾病的进展[7- - - - - -10]．虽然手术有效地缓解了高级OA患者的疼痛，但手术本身可能会导致疼痛并增加患者的财务负担。因此，研究OA疼痛的发病机制并探索可能的预防和治疗OA疼痛的目标具有很大的研究价值和临床意义。

研究表明，OA不仅导致局部神经分布的变化[11，12也会对drg造成伤害[11，13]．然而，损伤引起drg神经元兴奋性增加是慢性疼痛的重要机制。一些研究的结果[14- - - - - -16]证实OA疼痛与神经性疼痛(NP)具有相似的特征，但OA疼痛是否与NP相似的机制尚不清楚。最近的研究表明，KCNA2的下调和功能障碍是NP的重要致病机制之一[17，18]．此外，其他研究已经证明，DRG中电压门控钠通道的表达和功能的变化与OA疼痛的痛觉痛觉[19，20.]．因此，我们假设DRGs中的KCNA2与OA动物模型中疼痛行为的改变有关。本文旨在研究OA大鼠DRGs中疼痛行为与KCNA2表达的关系，为进一步探讨OA疼痛的发病机制提供理论依据。

2。材料和方法

2．1.动物和分组

由于雌激素的减少是骨关节炎的重要发病机制，我们选择雄性大鼠，以消除雌激素对动物模型的干扰。雄性Sprague-Dawley大鼠144只，年龄7 ~ 8周龄，体重230 ~ 270 g，合格编号:44007200052028。随机分为空白对照组(C组)、生理盐水组(S组)、OA组。

２.２.模型建立

根据文献[21- - - - - -24[大鼠（60mg / kg）给药，腹膜内注射6％戊巴比妥的6％戊巴比妥的略微改性技术。在充分麻醉后，左膝关节上的毛皮被刮掉，用医用碘消毒，然后用75％乙醇脱碘。穿刺针通过替代替代曲线的侧部插入关节腔中。组OA接受关节内注射4％碘碘酸钠（MIA）（MIA）（麦克林生物化学技术有限公司上海，中国）2毫克（50次溶解 μ.L生理盐水)[21- - - - - -23]， S组注射等量生理盐水，C组只穿刺关节腔不注射。

２.３.观察指标

2.3.1。痛苦的行为

预适应30min后，分别于关节内注射前1天和注射后1、2、4、6周测量大鼠疼痛行为。根据参考文献[17，25，26]和轻微改变后，用不同折力(2、4、6、8、10、15、26和60 g)的Aesthesio Von-Frey丝(Ugo Basile, Gemonio, Italy)刺激左爪中点。实验时间≤4 s，每隔30 s重复5次，记录3次或3次以上的正反应折叠力作为撤回机械阈值(PWMT)。根据其他一些研究[17，27，28]，用红外热痛测试仪(RWD, San Diego, USA)的激光热源灯照射大鼠左爪，温度为55℃。记录从照射开始到大鼠舔足现象发生的时间。切断时间为60 s，以避免组织损伤。照射以10分钟为间隔重复3次，3次测量的平均值被认为是爪子撤退热潜伏期(PWTL)。

2.3.2。膝关节组织病理学

左膝关节组织分别于1、2、4、6周注射关节腔，4%多聚甲醛固定48 h，然后放入脱钙溶液中。液体每三天换一次，关节组织切成8-μ.m厚石蜡切片，两周后使用。将上述石蜡切片进行脱蜡、水合染色。苏木精-伊红染色(中国碧云天生物技术研究所)，加入苏木精染色液10分钟，1%盐酸醇分异水洗5 ~ 10 s，加入伊红染色液1 ~ 3分钟。进行藏红花素O-Fast Green染色(北京百奥莱博科技有限公司)，染色步骤如下:苏木精染色5min，盐酸醇分化后水洗5 ~ 10 s，洗涤后加入强化绿液3 min, 1%乙酸快速漂洗10 ~ 15 s，番红花O液染色2 ~ 3 min。将染色后的切片脱水、上蜡、封口，置于显微镜下观察。

2.3.3。ATF-3在DRG的表达

The animals were killed at one, two, four, and six weeks after the intra-articular injection: the rat’s thoracic cavity was cut open quickly, the left ventricle was inserted, and the right atrium was cut open, and 4% paraformaldehyde was injected for fixation. The DRGs at L3-5 of the left lumbar vertebra of the rat were obtained for frozen section. The sections were rewarmed at room temperature for 30 min. Then, the sections were blocked by the rupture solution containing 0.2% Triton X-100 and 5% goat serum at room temperature for 2 h, and the corresponding primary antibodies of rabbit-anti-rat ATF-3 (GTX129120, 1 : 200, GeneTex, Radnor, USA) and mouse anti-rat NeuN (GTX30773, 1 : 200, GeneTex, Radnor, USA) were added dropwise at 4°C overnight. On the next day, the sections were removed and rinsed, and the corresponding fluorescent secondary antibodies of donkey anti-rabbit (AB141637, 1 : 1000, Thermo Fisher, Waltham, USA) and goat-anti-mouse (ab150113, 1 : 1000, Abcam, London, UK) were added; they were incubated for 2 h at room temperature and stained with Hoechst 33342 (Sigma, St. Louis, USA) for 10 min. On observation by confocal microscopy after the sections were sealed, the neurons were green, ATF-3 were red, and image analysis was performed using Image J software (NIH, MA, USA).

2.3.4。KCNA2在DRGs中的表达

分别于关节腔注射后1、2、4、6周获得大鼠左侧L3-5 DRGs组织，置于−80℃冰箱中保存。所有样本均切成小块，加入组织裂解液，冰匀浆，裂解。4℃，12,000 r/min离心30min。获得上清液，并用双氰菊酯酸法平衡测定蛋白浓度。然后在沸水中变性，置于−20°C冰箱中保存使用。获得相同数量的蛋白质样品进行电泳。将蛋白分离并转移到聚偏氟乙烯膜上，在室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h。滴加兔抗大鼠KCNA2多克隆抗体(GTX54835, 1: 1000, GeneTex, Radnor, USA)， 4℃孵育过夜，去除后冲洗。然后加入辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔二抗(ZDR-5118, 1: 1000，中国北京中山金桥生物科技有限公司)，室温孵育2 h。采用ECL Western Blotting Substrate kit (Thermo Fisher, Waltham, USA)显色，Image J Software进行分析。

2.3.5。统计分析

所有数据都与SPSS 20.0统计软件包（SPSS Inc.，IL，USA）分析，并显示为平均值±标准偏差（SD）。所有数据都由Excel 2010（Microsoft，Ma，USA）绘制。通过反复措施分析方差（ANOVA）分析疼痛行为数据。PWMT和PWTL组之间的比较分别通过多路复用分析和简单的效果测试进行，并且使用最小显着差异（LSD）测试进行Intragroup比较。通过单向ANOVA分析其余数据，然后进行LSD测试。 被认为是统计学意义的。

结果

３．１．三组大鼠疼痛行为的变化

与基线相比，组OA的PWMT和PWTL显着降低（ 或0.01)关节内注射后2、4、6周;PWMT和PWTL在四周时最低( ）.在OA模型建立之后4到六周的PWMT和PWTL没有显着差异（ ）.与C组相比，在第2、4、6周时，OA组的PWMT和PWTL均显著降低( 或0.01）（见图1）.

３．２．三组大鼠膝关节组织病理学变化

OA组局部软骨表面不完整、不透明，软骨基质中蛋白多糖均匀染红，软骨下皮质骨、小梁骨均匀染绿，1周时潮线清晰。两周时，软骨表面损伤加重。软骨基质减少，软骨下皮质骨和小梁骨增多，部分潮位线模糊。第4周时，软骨损伤进一步加重，局部骨暴露，关节腔狭窄，软骨基质大大减少，软骨下皮质骨和小梁骨的范围较第2周时进一步扩大，潮位线不清。6周时关节软骨严重损伤，暴露骨面增厚，软骨基质广泛减少，软骨下皮质骨和小梁骨增大，部分骨向关节腔凸出。C组在第1、2、4、6周关节软骨表面完整光滑，关节软骨细胞清晰，可见潮线，无骨质增生(图)2）.

３．３．三组大鼠drg中ATF-3的表达

为确定OA大鼠DRGs是否受累，取关节内注射同侧L3-5 DRGs进行ATF-3表达分析。结果显示，与注射前相比，MIA注射后2、4、6周，DRGs中ATF-3的表达显著增加( 或0.01)，与C组相比，OA组DRGs中ATF-3表达在关节内注射后2、4、6周显著升高( 或(图0.01)3.）.

3.4。KCNA2在三组大鼠DRG中的表达

我们进一步探索了DRGS中KCNA2的表达。结果表明，在与基线的关节内术后，KCNA2的表达明显减少了两种，四个和六周（ 或0.01），与C组进行比较，在组OA中DRG中KCNA2的表达在两年，四个和六周内显着降低（ 或(图0.01)4）.

4。讨论

OA是临床常见病和多发病，疼痛是影响患者生活的主要原因。然而，OA疼痛的机制非常复杂，目前对其机制知之甚少，这给OA的预防和治疗带来一定的困难。

4．1.建立科学合理的动物模型

大鼠单侧膝关节内注射MIA，在一定程度上破坏了关节软骨、滑膜和韧带，改变了关节原有的稳定性，导致OA的发生。这些病理改变与人类OA相似。由于关节的慢性恶化与慢性疼痛行为相关，该模型可以评估动物模型中疼痛的变化。该模型建模周期短，稳定可靠，操作简单，成功率高。因此，在OA研究中得到了广泛的应用[24，29，30.]．根据之前的几项研究[11，21- - - - - -23，31，32，我们选择了MIA的剂量、浓度和体积。本研究显示OA组大鼠膝关节在关节内注射MIA后1周内发生病变，4周后病变与晚期人OA相似。OA组大鼠疼痛行为变化明显，提示OA模型建立成功。

4．2．OA模型大鼠疼痛行为的变化

Fernihough等人[24[据报道，与部分内侧半月切除术相比，关节内注射患者构建的膝关节OA模型的疼痛行为变化与OA患者中的疼痛行为变化更相似。此外，另一项研究提供了证据表明，大鼠中的苗族和半月板横转化模型与人膝关节OA类似，但炎症可能在半月板转化模型中的疼痛行为发展中发挥更大的作用[33]．Kim等人[29]报道，与生理盐水组相比，OA组的PWMT和PWTL明显降低。以上结果提示OA疼痛特征与NP疼痛相似。疼痛超敏和疼痛过敏是NP的两个突出症状。本研究显示，关节内注射MIA 2周后，OA组大鼠PWMT和PWTL较C组明显降低，并在关节内注射后4周达到峰值，提示OA疼痛与NP具有相似的特征，疼痛过敏和超敏反应参与OA疼痛的发病机制。

4.3。DRG参与OA大鼠疼痛行为变化的影响

drg作为疼痛信号传输过程的中继站。当周围神经损伤时，drg作为第一级神经元接收到传入的疼痛信号，并将其传递到脊髓背角和更高中枢。此外，Albayrak等报道，对DRG进行脉冲射频治疗有助于减少全膝关节置换术后持续疼痛患者的疼痛程度[34]．因此，DRG在OA疼痛的发病机制中发挥着重要作用[13，35]．关节炎症是一个主要的临床问题，也是使人衰弱的慢性疼痛的主要原因，其特征是明显的机械性痛觉过敏和休息时持续疼痛[36]．痛觉机制需要初级感觉神经元的敏化，其胞体位于DRG，并涉及多个介质触发特定的信号转导途径。这些途径的很大一部分意味着转录因子的激活，基因表达发生改变。在特定的病理条件下，drg实际上负责合成参与反应级联反应的信号分子，最终导致生存或再生等现象[37]．已经提出激活转录因子3（ATF-3）作为其根据其根据蜂窝环境不同的能力来作用作为“自适应响应”[38]．在正常条件下显示出低表达的ATF-3在通过各种病理生理过程刺激细胞时迅速增加[39]．它是在细胞应激反应期间表达的最早的转录因子，其表达的增加通常表明组织损伤。它包含在抗凋亡机制中[40]细胞存活[41),再生(42和神经保护[43已上报信令事件。在p- akt介导的生存途径中，ATF-3/c-Jun异源二聚体被认为在神经损伤等死亡应激下促进神经伸长和抑制细胞凋亡[44]．目前，ATF-3大多被认为是一种神经元损伤标志物，在多种神经性疼痛模型中发现其表达高度诱导[45- - - - - -47]．我们的研究结果表明，在颈部内注射两周后，大鼠的DRG在大鼠中，艾夫3表达显着增加，从而表明神经元受损。然而，在不同模型的炎症疼痛模型中的ATF-3表达的数据并不一致[48- - - - - -50]．例如，足底注射完全性弗氏佐剂(CFA)没有诱导任何ATF-3表达，表明没有相关的神经元损伤[48，49]．有趣的是，在胶原诱导的关节炎和单碘乙酸诱导的骨关节炎关节疼痛模型中，ATF-3也在DRG神经元中表达[51，52，表明某种程度的神经元损伤正在发生。考虑到这些有争议的数据和关于ATF-3在疼痛处理中的作用的稀疏信息，它的表达被证明是增加或减少取决于神经元群体，表明表达atf -3的细胞大小分布和与isolectin B4 (IB4)或降钙素基因相关肽(CGRP)共定位[50]．

4.4。OA模型动物DRG神经元和疼痛行为中KCNA2表达的关系

drg神经元的损伤可能导致细胞膜上离子通道的表达或功能的改变[17，20.]．KV通道是在保持静止膜电位和动作潜在的复极性的重要作用的重要离子通道之一，与神经元的兴奋密切相关。kV通道是由其组成的四聚体α.亚基超族和β辅助单元。Kv信道可分为12个子族按α.亚单位，1−12，其中，在α.Kv1亚家族的Kv1.2 (KCNA2)亚基在drg中高表达[53，54]．DRG中KCNA2的表达降低有助于NP的痛觉痛觉，并增加KCNA2的表达，以衰减NP的症状[17]．最近，Zhao等人[18表明，在脊髓神经结扎法制备的慢性疼痛大鼠模型中，KCNA2在DRGs中的表达明显降低，Kv电流降低，导致神经元异常兴奋放电，导致疼痛的外周敏化。我们的研究结果显示，与C组大鼠相比，OA组大鼠DRGs中KCNA2的表达在MIA注射后2周开始下降，且在4 ~ 6周差异最显著。由于疼痛行为的变化与KCNA2的变化趋势基本一致，我们认为OA大鼠的疼痛行为与DRGs中KCNA2表达的下降有关。但本研究未进一步研究逆转DRGs中KCNA2下调表达后OA模型大鼠疼痛行为的变化。此外，在其他慢性疼痛动物模型中，引起DRG神经元KCNA2表达变化的潜在机制有很多[18，55，56，而这在OA模型动物中并不清楚。然而，我们并没有在这一领域进行进一步的研究。在未来，我们将对上述问题进行更深入的研究。

5.总结

综上所述，本研究证实OA疼痛的性质与NP相似，并证明OA疼痛的发生发展与DRG神经元中KCNA2表达降低有关。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

作者感谢广东省科技厅的财政支持。本研究由广东省科技支持新疆项目资助(no. 514701)资助。2018 yj023)。

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