OPN缺陷的严重性增加骨关节炎与异常软骨细胞衰老和细胞凋亡和移植Osteoarthritis-Associated基因的表达

文摘

目标。最近的一份工作报告,骨桥蛋白(OPN)水平升高与关节软骨和滑膜液中进步的骨关节炎(OA)关节损伤,对OA和OPN的保护作用抑制OA-associated基因的表达。目前的研究调查了OPN缺陷是否容易OA软骨细胞衰老和细胞凋亡的调控和OA-associated基因的表达。方法。的mRNA水平COL2A1和OPN人类OA软骨细胞与正常软骨细胞之间的比较。OPN siRNA SA -的影响β加表情和凋亡软骨细胞的百分比被使用SA -检查β加染色和细胞凋亡测定,影响COL2A1和OA-associated基因的表达(COL10A1, il - 1β肿瘤坏死因子-ɑMMP-13和ADAMTS5)进行免疫印迹分析和定量实时rt - pcr。此外,体内OA模型建立了检查的影响OPN siRNA OA软骨细胞的衰老和凋亡和OA-associated基因的表达。结果。COL2A1和OPN的mRNA水平相比减少膝关节OA软骨细胞与正常软骨细胞。OPN缺乏增强OA软骨细胞的衰老和凋亡,增加COL10A1的表情,il - 1β肿瘤坏死因子-ɑMMP-13, ADAMTS5但COL2A1的表达下降。同时,OPN的缺乏可能导致严重,加速体内OA,也是增强软骨细胞的衰老和凋亡与高架OA-associated基因的表达。结论。本研究的发现表明OPN不足会导致加速OA,与增强衰老和细胞凋亡相关的OA软骨细胞和调节OA-associated基因的表达。

1。介绍

作为最典型的形式的关节炎,骨关节炎(OA)的特点是关节软骨的退化和改变其他联合组织。有超过10%的老年人口受此影响疾病症状(1),OA被广泛认为是衰老过程的一部分。关节软骨细胞的衰老和凋亡是发现与OA的发病机理有关2,3]。我们先前的研究表明,SA -升高β加是与进步膝OA关节损伤(4]。在这样的基础上,目前的研究为目的执行进一步检查上游中介(s) OA软骨细胞的衰老和凋亡。

骨桥蛋白(OPN),一个多功能磷酸化蛋白由300个氨基酸,aging-associated进展的一个重要部分,引起自发性OA (5]。OPN的表达增加,钙沉积被发现在骨关节炎软骨中增强,而长篇OPN是主要和磷酸化转译后的修改才有效。OPN可以抑制的磷酸化状态的形成,发展,和矿化羟磷灰石晶体,而减少OPN和骨钙素的骨头中扮演一个重要的角色在促进脆弱性髋部骨折(6- - - - - -8]。OPN也是一个关键的调节软骨退化由于其内在因素影响MMP-13的表达和蛋白多糖损失(9]。报导了几个基质金属蛋白酶,调节OPN的表达;例如,MMP-9可以裂开一个OPN片段调节肿瘤免疫逃避,虽然MMP-10可以诱导的超表达OPN在钙化的主动脉瓣狭窄10,11]。OPN的表达升高,被发现在OA关节,被认为是与关节病变的严重程度在OA (12- - - - - -16]。Osteoprotegerin(功能)的一个重要组成部分在维持关节软骨的体内平衡。尽管一些研究证实,OPN和功能在其他疾病有关系,OPN和功能之间的相关性在OA尚未充分阐述了16]。最近,OPN已经证明调节ADAMTS4的表情,TIMP-1, TIMP-2 HIF-2α、il - 6和引发(17- - - - - -20.]。基于类风湿性关节炎模型小鼠,Yumoto et al。21,22]表明OPN对关节软骨的破坏有显著的影响通过促进血管生成,诱导软骨细胞凋亡21]。在切除卵巢的老鼠,OPN和VEGF的表达增加;此外,软骨终板骨软骨重塑和诱导骨质疏松椎被发现导致软骨表面的血管生成,增加孔隙度(23]。与此同时,OPN caspase-3活动不足会抑制增加引起的肿瘤坏死因子-α软骨细胞的文化。直到最近,OPN的影响缺乏知识OA软骨细胞的衰老和凋亡在OA的发病机制仍然是有限的。

基于上述发现,假设OPN的缺乏是容易通过增强OA软骨细胞衰老和细胞凋亡的upregulation OA-associated基因的表达。因此,我们的研究针对全面检查OPN的影响缺乏人类OA软骨细胞的衰老和凋亡和OA-associated基因的表达。

2。材料和方法

2.1。人类软骨细胞培养的准备

本研究进行了符合赫尔辛基宣言的建议在收到湘雅医院的伦理委员会的批准。人类OA软骨得到从20例(59 - 75岁)接受全膝关节置换手术。OA是实验室诊断的基础上,临床和影像学检查(Kellgren-Lawrence等级4)。从5例手术获得正常软骨组织(17-55岁)进行了上述的膝上截肢由于严重的创伤。年龄在两组之间的差异没有统计学意义。

原发性软骨细胞从培养软骨组织中提取的。标本被剁碎,孵化与胰蛋白酶37°C 15分钟。然后,软骨是处理杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;Gibco /生命技术、大岛屿,美国纽约)含有0.2%胶原酶(Gibco /表达载体,大岛,纽约,美国)在37°C 15小时。分离的细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM (DMEM;Gibco /生命技术、大岛屿,美国纽约)和100 U /毫升penicillin-streptomycin。删除不依从细胞后,贴壁细胞在新鲜培养基孵化6-well板(1×10⁴细胞/)。所有程序都是首次通过细胞执行。的软骨细胞,II型胶原蛋白是证实OA膝盖软骨细胞的高表达。

首次通过软骨细胞被播种在起始密度24-well板1×10⁴细胞/嗯,直到成为支流。的软骨细胞,II型胶原蛋白是确认显示在正常人类的膝盖软骨细胞表达高于OA膝盖软骨细胞。此外,OPN mRNA水平分析QPCR OA软骨细胞和正常的软骨细胞。

随后,OA软骨细胞被分成3组:对照组(1):未经处理的;(2)数控组:治疗控制小干扰RNA 24小时;和(3)OPN核组:治疗OPN小干扰RNA。

2.2。小干扰RNA转染

OPN和控制小核RNA)是获得GenePharma(中国上海)和被用来使转染核进入人体膝关节OA软骨细胞遵循制造商的建议。首先,这些细胞被放置在一个没有抗生素的生长介质6-well板1天在转染前为了实现融合在转染过程中30 - 50%。然后,100年的复合物p摩尔的核和Lipofectamine 2000(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)准备并添加到每个。转染24小时后,大楼被拆除,取而代之的是新鲜中含有10%的边后卫。额外的24小时后,RNA和蛋白质提取的细胞被收获。

2.3。免疫印迹分析

利用sds - page和转移到止动剂,解决了蛋白质聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。然后,屁股被封锁的4% BSA在室温1小时和探索兔反抗体OPN, COL2A1, COL10, il - 1β肿瘤坏死因子-ɑ、MMP-13 ADAMTS5(1: 500)另一个1小时,在室温下。随后,这些墨迹洗了三轮和孵化HRP-conjugated二级anti-rabbit抗体。蛋白质表达的变化计算使用BioRad数量一个软件β肌动蛋白应用作为一个内部控制保证相同的蛋白质样品加载。

2.4。定量逆转录聚合酶链反应分析(QPCR)

核糖核酸提取试剂盒(表达载体),准备2互补脱氧核糖核酸的合成µ使用上标3 g RNA表达载体。的相对表达人类COL2A1 mRNA-encoded COL10, il - 1β肿瘤坏死因子-ɑ、MMP-13 ADAMTS5检查和分析使用SYBR绿色实时PCR ABI棱镜7700序列检测系统(应用生物系统公司)。所有目标基因的序列引物和探针从商业来源获得β肌动蛋白作为内部控制(应用生物系统公司)。为每个单独的基因mRNA水平被ΔΔCt量化,然后归一化方法β肌动蛋白,PCR融化曲线检查来评估每一个特定的产品。之间的差异感兴趣的基因的平均Ctβ肌动蛋白是用ΔCt,ΔCt和Ct的校准器样本之间的差异被ΔΔCt表示。日志2(−ΔΔCt)值代表基因表达的相对水平。

2.5。SA -β加染色和细胞凋亡测定

积极的蓝色染色的SA -β女孩被选作为细胞衰老的生物标志物(24]。检测SA -β加染色,细胞在subconfluent文化DPSB清洗和在3.7%甲醛固定3 - 5分钟,然后用DPSB洗净了。随后,细胞被孵化有限公司₂失望环境与SA -一夜之间β半乳糖苷加染色剂的解决方案(1毫克/毫升、40毫米柠檬酸/磷酸钠,pH值6.0,5毫米亚铁氰化钾,5毫米铁氰化钾,150毫米氯化钠,MgCl和2毫米₂在37°C)。阳性染色将出现2 - 4小时后,12 - 14小时后进行分析。总共500个细胞被轻量级显微镜获得SA -得分β加积极的。软骨细胞凋亡是量化通过流式细胞仪分析细胞染色FITC-conjugated膜联蛋白V (25]。

2.6。老鼠体内OA模型

共有36个雄性SD大鼠(200±20 g, 12周大)被分成三组:(1)虚假的组:膝盖sham-operated鼠,n= 12;(2)对照组:膝关节不稳定扰动引起的内侧半月板(DMM模型)在左膝盖和注射质粒不属预定目标的控制,n= 12;和(3)OPN核组:膝关节不稳定引起DMM的左膝,注射OPN siRNAn= 12 (Cyagen生物科学有限公司,中国)。允许重复注射3周和6周后,分别。

膝关节软骨的每个大鼠解剖和分析转染效率和组织学评价。标准进行组织学分析使用红色染料O以及苏木精和伊红染色,并进行了一系列的测试来检测OPN, SA -β加,MMP-13 ADAMTS5,胶原蛋白II型和aggrecan。石蜡切片是经常deparaffinized烤20分钟和后水化和蒸馏水洗了三遍(每次3分钟)和磷酸盐(PBS)。然后,部分进一步处理复杂的酶消化抗原检索在室温下15分钟,孵化以3%的H₂O₂解决方案10分钟,然后洗了三次(每次3分钟)和PBS。随后,一夜之间,部分被覆盖在4°C的抗体OPN在1:50 (Proteintech,中国),SA -β加1:50 (Proteintech,中国),在1:MMP-13 50 (Proteintech,中国),在1:ADAMTS5 50 (Abcam,中国),胶原蛋白II在1:50 (Proteintech,中国),和aggrecan 1: 100 (Proteintech,中国)。准备的样本然后用30孵化µL的生物素化的山羊anti-rabbit二级抗体30分钟,洗了三次(每次5分钟)和PBS进一步使用50染色µL (3,3′-diaminobenzidine解决方案以适当的终止和用自来水冲洗3小时。此后,对比染色用苏木精5分钟了。然后,每个部分是由一系列分级的酒精脱水10秒,清除使用二甲苯和安装与中性香脂。奥林巴斯显微镜照相机进行拍摄了部分。软骨组织的相对分布OPN可以可视化和量化的光密度(OD)。半定量的评估进行OPN表达的平均光密度扫描的基础上与ImageJ放射自显影图。灰度图像获取和转化为吸光度单位,为了分析该地区从软骨表面cartilage-bone结。分析软骨细胞凋亡在软骨组织中由TUNEL分析使用装备制造的罗氏诊断(南京凯基生物生物技术。,中国)。

2.7。统计分析

所有的值都是平均数±标准差。MS Windows SPSS(16.0版)是用于统计分析。单向方差分析(方差分析)应用于不同组之间的比较方法。皮尔逊相关性和线性回归是用来检查OARSI成绩之间的相关性和关节软骨的蛋白质的光密度。值≤0.05被认为具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。OPN的表达水平和COL2A1人类OA软骨细胞减少

OPN和COL2A1的mRNA水平相比人类正常软骨细胞和OA软骨细胞之间为了评估OPN的表达和软骨相关矩阵基因在软骨细胞。实时PCR表明OPN的mRNA水平和COL2A1显著降低OA软骨细胞相对于那些在正常软骨细胞(图1(a))。

3.2。OPN的影响siRNA Osteoarthritis-Associated基因的表达和OA软骨细胞的衰老和凋亡

免疫印迹分析进行评价可拆卸的小干扰rna转染OPN的效率。结果表明,在人类OA软骨细胞OPN的表达抑制小干扰rna转染OPN-specific(图1(b))。

检查OPN在OA软骨细胞的功能,COL2A1 mRNA和蛋白表达水平,COL10A1, il - 1β肿瘤坏死因子-ɑ、MMP-13 ADAMTS5 OPN-knockdown OA软骨细胞和控制之间的比较。OPN的差别,对这些导致减少COL2A1表达式(在基因和蛋白质水平)和增加COL10A1的表情,il - 1β肿瘤坏死因子-ɑ、MMP-13 ADAMTS5(基因和蛋白质水平)与对照组相比,NS组(图1(c))。与此同时,SA-beta-Gal表达式(图2(一个)(图)和凋亡细胞百分比2 (b))增加OA软骨细胞OPN对待核控制与NS组。

3.3。OPN不足导致严重,加速骨关节炎在活的有机体内

检查OPN体内的影响,OPN的损失函数的策略是由将OPN siRNA注入大鼠膝关节的数字模型。准备鼠样本与样本被不属预定目标的核注入。正如所料,在关节软骨细胞OPN表达的损失数字组OPN证实了核注射免疫组织化学(图3(a))。番红精O和快速绿色染色表明,虚假的手术没有显示矩阵抑郁(图3(b))。数字老鼠的小干扰rna注入了不属预定目标的保留关节面层,但失去了红色染料同时O染色观察(图3(b))。与数字老鼠OPN蛋白聚糖siRNA注入了更大的损失,以及细胞结构和关节软骨的破坏在某些地区(图3(b))。基于OARSI OA软骨组织病理学评分系统,OARSI评分显著增加数字组相对于虚假的手术对照组。此外,OARSI得分明显高于DMM组与小干扰rna注入比DMM OPN蛋白组与不属预定目标的siRNA注入(图3(b))。

3.4。OPN不足导致加速OA与异常软骨细胞衰老和细胞凋亡有关

与sham-operated组相比,数字组表现出更高的SA -表达式β加和凋亡细胞的比例。与此同时,更高的SA -表达式β加和凋亡细胞的比例也观察到数字组与小干扰rna注入相比OPN DMM组与不属预定目标的核注入(图3(c))。有趣的是,SA -的表达β加和凋亡细胞百分比显示关节软骨与OARSI分数正相关(r= 0.72, 和r= 0.81, ,分别)。

3.5。OPN不足导致加速OA的Upregulation Osteoarthritis-Associated基因的表达

鉴于,基质金属蛋白酶(MMP) -13是OA的分解代谢的重要因素之一;在这项研究中,通过免疫组织化学方法MMP-13决心的表达。结果显示增加MMP-13表达式在软骨OPN核注射组相比,在不属预定目标的核注射组(图3(c))。此外,ADAMTS5的表达(OA)的另一个关键异化的因素增加,而胶原蛋白II型的表达式和aggrecan(两个主要关节软骨中的ECM的合成组件)减少在OA软骨OPN siRNA注射组相比,在不属预定目标的核注射组(图3(c))。这些结果表明OPN siRNA注射的老鼠受到OA手术表现出增强的异化的活动和加速软骨细胞在关节软骨损失。有趣的是,MMP-13的表达式和ADAMTS5显示关节软骨与OARSI分数正相关(r= 0.78, 和r= 0.83, ,分别)。

4所示。讨论

最近的研究报道的存在一个明确的软骨损伤程度之间的相关性和软骨细胞的衰老和凋亡26- - - - - -28]。王等人。29日]声称OPN信号通路的基因表达的变化可能解释增强的细胞粘附、生存、增殖、迁移,以及增强炎症反应和减毒细胞凋亡过程中肝再生。Tahir et al。30.)显示,人口CD153 + T卵泡细胞具有细胞衰老狼疮发病机制中发挥了关键作用通过OPN生产。这些发现表明OPN可能占细胞凋亡和细胞衰老特性的变化。因此,为了确定OPN在OA软骨细胞的功能,我们的研究主要集中在OA软骨细胞的衰老和凋亡和OA-associated基因的表达。据报道,OPN对关节软骨的破坏具有重要的影响通过促进血管生成和诱导的小鼠软骨细胞凋亡类风湿性关节炎模型(21]。然而,知识OPN的影响缺乏OA软骨细胞的衰老和凋亡在OA的发病机制仍然是非常有限的。这项研究的结果,首先,表明OPN不足可能会加速OA软骨细胞的衰老和凋亡。

办公自动化是一个逐步退行性关节疾病引发的撕裂和穿在关节面。骨关节炎的关节软骨的变化涉及进步相关的蛋白水解降解细胞外基质(主要由COL2A1和aggrecan)。OPN的效果差别在这项研究中,对这些缺陷COL2A1暗示,OPN的表达水平缺乏OA软骨细胞可以减少细胞外基质沉积。除了刺激影响软骨基质形成、upregulation效应缺乏OPN的表达水平COL10A1建议进一步诱导OA软骨细胞的表型,肥厚性分化的特点是COL10A1表达水平的提高是办公自动化的一个特点。鉴于OA病因的复杂性,在生物学和生物力学因素(例如,机械应变和炎性细胞因子)会影响合成代谢和分解代谢的因素之间的稳态平衡的关节,这可能最终导致关节软骨的损伤。具体来说,滑膜细胞和关节软骨细胞可以产生各种异化的因素,包括aggrecanases(例如,ADAMTS4和5)、基质金属蛋白酶(如金属蛋白酶- 1和-13)和促炎因子/细胞因子(例如,il - 1、il - 6和TNF -α),所有导致关节破坏在OA (31日,32]。通过调查OPN的角色作为管理者的矩阵退化软骨,目前的研究表明OPN deficiency-induced改变的促炎细胞因子TNF -α和il - 1β据报道,这是调节在OA (31日,32]。这些促炎细胞因子可以增强炎症过程和诱导一些基质降解酶,因此被视为软骨退化的主要监管机构。此外,它也被发现,OPN缺乏诱导MMP-13和ADAMTS5 OA软骨细胞的表达,表明OPN介导和调制ECM降解。

本研究建立了一个鼠标OA模型,它被用来检测OPN不足的作用。最近的一项研究声称OPN缺陷加剧了体内和引起OA和OPN作为一个关键软骨退化的内在调节器通过其影响MMP-13表达和蛋白多糖损失(9]。相比之下,目前的研究表明OPN不足导致严重,加速体内OA和SA -诱导表达升高β加,在OA软骨细胞凋亡细胞的比例。值得注意的是SA -的表达β加和OA关节软骨中的凋亡细胞的比例显示与OARSI分数正相关。此外,OPN缺乏调节OA-associated基因的表达,导致加速OA的upregulation OA-associated基因的表达。这些发现提供了支持我们的体外实验。

目前的研究还表明,在OA软骨细胞OPN的mRNA水平显著降低,在正常的软骨细胞。然而,一些已发表的研究和我们的早期研究表明,滑液中OPN的表达增加,软骨及滑膜OA患者与关节病变的严重程度(12- - - - - -16]。此外,我们以前的结果暗示OPN可以调节ADAMTS4的表情,HIF-2αTIMP-1 TIMP-2, il - 6,引发和可能有保护作用对人类对aggrecan OA软骨细胞降解通过抑制ADAMTS4表达式(17- - - - - -20.]。同样,这项研究也表明OPN缺乏恶化OA的严重程度与增强OA软骨细胞的衰老和凋亡和OA-associated基因的表达增加。因此,OPN表达升高可以被认为是一种适应性反应,以保护细胞分解代谢和炎症的环境中办公自动化的发展。任何失败的这种反应可能导致退化过程的进一步发展。这些发现以及我们的研究结果表明OPN可能负责修复人类骨关节炎软骨和软骨的重塑在提升OPN水平起到了一定的作用。许多研究已经证实,OPN可能影响COL2A1 COL10A1, il - 1β肿瘤坏死因子-α、MMP-13 ADAMTS5基因表达,我们也测试了上述基因的表达。在OA几个基因的关键角色,但他们不是OPN的直接目标。OPN应该绑定到其受体包括整合素和CD44和随后,激活等途径NF -κB通路调节OA-associated基因表达式(33]。

总之,OPN缺乏OA软骨细胞OA-related基因的表达增加,加速细胞凋亡和细胞衰老,增强hypertrophic-like变化。我们的研究表明OPN在保护人类软骨细胞中扮演着关键角色的炎性环境。针对这一点,我们的研究提供了重要参考阐述指出OA的病理生理学和治疗的潜在目标。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

所有作者都批判性回顾了手稿。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。81672225),湖南省的主要研究和开发项目(2016 jc2038),长沙市湘雅中南大学临床大数据系统建设项目(没有。45),湘雅医院的临床科学研究基金会,中南大学(2015 L01)。作者希望感谢患者和健康志愿者为他们的合作,给予同意参与这项研究。

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