文摘

神经性疼痛仍underrecognised行驶在慢性疼痛患者接受治疗。因此,他们的生活质量是大大减少,大量医疗费用发生。痛苦的解剖位置必须确定明确的诊断,但当前神经心理学工具不能这样做。基质金属蛋白酶(MMP)认为保持外围神经炎症,和MMP-12升高特别是这样的病理条件。磁共振成像(MRI)的外围神经系统方面取得了进展,由于它的高对比度分辨率和多平面特性。我们试图改善神经病变的MRI特征,通过构造一个MMP-12-targeted磁性氧化铁纳米颗粒(IONP)。它的在活的有机体内效率是评价神经性疼痛的一种啮齿动物模型,在左腰5 (L5脊神经)是严格的结扎。脊神经结扎(SNL)成功地诱导机械触诱发痛和热痛觉过敏,在左后爪在整个研究期间。这些神经病变特征缺席虚假手术的动物。MMP-12 upregulation随之而来的巨噬细胞浸润、脱髓鞘和弹性蛋白纤维损失现场观察结扎。这不是在脊髓神经侧和侧结扎脊神经或受伤离开了L5脊神经。合成的MMP-12-targeted磁IONP稳定,无毒在体外。这是管理到左侧L5脊神经鞘内注射,和减少磁共振(MR)信号观察结扎的网站。组织学分析证实了铁的结扎脊髓神经的存在,而铁中没有检测到受伤离开了L5脊神经。因此,MMP-12是神经性疼痛的潜在生物标志物。它的检测在活的有机体内,使用IONP-enhanced磁共振成像,可以进一步发展为神经性疼痛的诊断和管理的工具。

1。介绍

背部疼痛是最高的疼痛情况和进展报告给慢性腰痛患者的三分之二。这些患者出现疼痛的和/或神经性组件,但后来的组件通常是underrecognised (1]。神经性疼痛的定义是疼痛引起的直接后果病变或疾病,影响躯体感觉系统。需要识别的解剖位置和病理学诊断。然而,最方便的方法记录病人的历史,和体检,依靠病人合作(2]。因为病人的疼痛是影响认知的经验、情感、和教育因素,更客观测量的神经性疼痛。目前的筛选工具来评估神经损伤神经心理学的性质,包括问卷调查和各种电诊法的测试。然而,他们不能提供确凿证据为神经性疼痛或定位准确pain-generating网站(3]。

核磁共振成像技术越来越多地应用于观察神经损伤和疾病的无创。在t2加权图像(T2-WI),周围神经通常与周围组织和可能出现略微hyperintense或isointense,相对于肌肉组织。然而,受伤的神经出现在T2-WI明亮,T2弛豫时间延长(4]。虽然信号先生受伤的周围神经的变化是显著的,它缺乏特异性。再生神经不能区别长期退化的(5),同样的信号变化可能会观察到正常神经(6]。核磁共振成像造影剂,比如钆(7,8)、锰(9),全氟化碳10],IONP [11- - - - - -13),是解决这一差距。然而,到目前为止使用造影剂在患者和动物模型是特异性的。因此,在目前的研究中,我们试图设计一个IONP-based MR对比剂,选择性裂解,并开始了本地受伤的神经根。

IONP显著降低T2信号通过提高周围的水质子的自旋自旋弛豫时间(14]。IONP实验被用来观察巨噬细胞迁移到受伤的坐骨神经在活的有机体内(11,13]。Bendszus和斯托尔(13]报道IONP-induced信号损失坐骨神经损伤后8天。然而,信号增加11因为iron-laden巨噬细胞招聘是短暂的,和受伤的神经内巨噬细胞渗透保持静止13]。IONP可以检测酶活性,当共轭肽序列。当肽序列是由细胞外的目标酶裂解,释放IONP会被周围组织(15- - - - - -18]。与不属预定目标的IONPs靶向IONPs可能防止损伤其他组织,因为他们只会被那些表达目标酶(吸收19]。因此,巨噬细胞因子,包括基质金属蛋白酶,可能存在潜在的目标在活的有机体内IONP-based MRI。

基质金属蛋白酶是一个家庭的钙依赖锌肽链内切酶,负责细胞外基质(ECM)退化。他们的活动是在生理条件下严格控制。神经损伤后,基质金属蛋白酶降解2屏障和髓磷脂。此外,他们会加剧白细胞浸润,细胞因子释放。因此,基质金属蛋白酶被认为维持炎症病理等周围神经病变(20.]。某些基质金属蛋白酶,如MMP-12,保持低表达在损伤坐骨神经。然而,神经损伤,有增加表达式,它仍然可以提高到20天受伤后(21,22]。我们假设,高架MMP-12活动现场可以检测到神经损伤在活的有机体内。一个MMP-12-targeted磁IONP可以定位MRI pain-generating网站。因此,我们试图评估MMP-12-targeted IOPN鼠SNL模型。这个特殊的模型更好的概括部分神经损伤在大多数神经性疼痛患者(23]。第一个目的是确定SNL机械提取阈值的影响(MWT),热延迟撤军(TWL),巨噬细胞浸润,MMP-12表达式,髓鞘形成,和弹性蛋白纤维内容。第二个目的是评估细胞毒性,细胞吸收,和特异性,合成的MMP-12-targeted磁IONP在体外。最后的目的是检查在活的有机体内核磁共振的动物收到MMP-12-targeted磁IONP和验证IONP吸收脊神经的组织学分析。

2。材料和方法

2.1。动物

程序涉及动物机构批准的动物保健和使用委员会的新加坡国立大学(r14 r13 - 4649 - 0009),并进行了按照国家实验动物研究咨询委员会的指导方针。7-week-old男性Sprague-Dawley老鼠(比起现场、新加坡),最初重200 - 250克,被安置在控制温度(20-26°C)和湿度(30 - 70%),与一个12小时的光暗周期上午7点到下午7点(灯)。还提供了一些食物和水随意。动物SNL或虚假的手术。他们评估机械触诱发痛和热痛觉过敏,冯·弗雷和哈格里夫斯,分别测试。这些测试3天完成术前,术后7和13天。脊髓神经是从鼠安乐死SNL 1或2周后通过免疫组织化学方法研究或虚假的手术和组织学染色或MMP-12活动分析。老鼠接受了鞘内注射的MMP-12-targeted IONP, SNL或虚假手术2周后,核磁共振后被安乐死。

2.2。外科手术

所有外科手术后进行皮下enrofloxacin管理局(10毫克/公斤)。老鼠深深anesthetised与异氟烷(5%的感应和2%的维护在空气中)和放置在一个位置。胸背区域是剃毛,皮肤是三次擦洗,交替碘和70%的乙醇,在动物被覆盖。

SNL手术开始通过背正中切口。左边paraspinal肌肉分开的尖尖的夏普和钝性剥离过程,揭露左16种横突。哈佛左侧横突小心地使用骨机,暴露左侧L5脊神经。神经是紧密的结扎,以铬肠道缝合,3 - 5毫米远端背根神经节(DRG)。与3 - 0可吸收缝合肌肉和皮肤被关闭。利多卡因(10毫克/毫升,辉瑞)注入下缝合皮肤,和Banocin粉应用于缝合皮肤。在虚假的手术,左侧L5脊神经接触但不结扎(24]。注入MMP-12-targeted探针,L5椎体暴露在类似的方式。层状骨是最低限度使用咬骨钳,允许鞘内注射10μl的MMP-12-targeted IONP到左侧L5 DRG的GC注射器(25]。

任何手术后,动物被安置分别与干净的床上用品和治疗皮下enrofloxacin连续3天每天两次。也会给那些注射MMP-12-targeted探针丁丙诺啡(0.06毫克/公斤)连续3天每天两次。动物被监控任何手术后痛苦的迹象。没有神经赤字或瘫痪的实例由于SNL整个课程的学习。

2.3。行为评估

机械触诱发痛评估使用·冯·弗雷细丝,自动动态足底触觉计系统(UgoBasile、意大利)。系统置于高架钢丝网,和老鼠在透明盒单独放置在网格。为每个审判,灯丝仔细定位下的足底表面后对爪爪和上升到新闻。应用力范围从5克到40 g,最多6秒或直到爪子撤回。参与者达到力,后爪撤回在6秒时,至少5个6试验。热痛觉过敏被哈格里夫斯评估方法使用热足底试验装置(UgoBasile、意大利)。这个系统下面放置一个塑料升高的平台,和老鼠在透明盒单独放置在这个平台。对每一个试验中,红外源(40 mW)定位下midplantar表面后爪,最多20秒或直到爪子被撤回26]。5试验的平均戒断时间,爪子在20秒,撤回TWL计算。参与者和TWL差异计算为每个老鼠,减去MWT或TWL左后与正确的后爪爪(24]。

2.4。组织学和免疫组织化学

标本被终端心脏灌注来自动物的安乐死。这些老鼠都深深地anesthetised与1毫升灌注聚氨酯和400毫升1%的亚硝酸钠,其次是400毫升4%多聚甲醛(PFA)。DRG之间,近端和远端长度和两端的切除脊髓神经,5 - 7毫米。收获离开L4、L5和16种,对L5脊神经放在4% PFA和加工石蜡包埋。染色之前,5μ米厚的部分被二甲苯和水分利用分级deparaffinised乙醇和蒸馏水。

与抗原免疫组织化学开始检索使用胃蛋白酶为15分钟37°C。内源性过氧化物酶活性被1%的过氧化氢为10分钟,其次是抗生物素蛋白和生物素块(sp - 2001,向量实验室、CA、美国),持续15分钟。部分孵化与1.5%正常山羊血清(ak - 5001,向量实验室、钙、美国),前2 h孵化与小鼠单克隆抗体CD68 (MAB1435,默克密理博,MA)或兔多克隆抗体MMP-12 (bs - 1854 r, bios,妈,美国),在稀释1:200。生物素化的山羊anti-mouse (ba - 2900,向量实验室、钙、美国)或anti-rabbit (ak - 5001,向量实验室、CA、美国)免疫球蛋白抗体稀释1:200年1.5%正常山羊血清申请30分钟。此后,avidin-biotin复杂试剂(ak - 5001,向量实验室、钙、美国)申请了30分钟,其次是可视化使用ImmPACT向量红色碱性磷酸酶(sk - 5105,向量实验室、钙、美国)20分钟。幻灯片在苏木精复染色(美国3801562,徕卡生物系统公司,IL)为1分钟。

英国在Verhoeff-van Gieson (ab150667 Abcam)染色,幻灯片是沉浸在8分钟的工作弹性染色解决方案,蘸差异化解决方案40倍,硫代硫酸钠溶液中放置1分钟,在自来水冲洗所有的试剂。然后他们被沾染了范Gieson 30秒的解决方案和95%乙醇冲洗,持续30秒。

Luxol快蓝染色后进行补水部分95%乙醇。幻灯片沉浸在0.1% Luxol快速蓝色(S3382-25G Sigma-Aldrich,密苏里州,美国)解决方案16 h 57°C水浴。短暂的在95%乙醇和蒸馏水洗涤后,部分分化在0.05%碳酸锂(美国152537 MP生物医学,CA)解决方案1分钟,用蒸馏水洗净。

普鲁士蓝染色是由浸泡幻灯片工作解决方案的含水20%的盐酸和10%水亚铁氰化钾(p - 3289, Sigma-Aldrich、钙、美国)解决方案为20分钟,其次是0.1%核快红(美国60700年Sigma-Aldrich, CA)解决方案5分钟。幻灯片在蒸馏水后彻底清洗每一个解决方案或污渍。

彩色幻灯片都是在分级乙醇脱水,二甲苯。与DPX安装幻灯片后(06522年,Sigma-Aldrich、钙、美国),亮视场图像获得(日本奥林巴斯CX41)。对于每一个标本,至少40 2部分μ米被选中。对于每个部分,3不重叠的图像区域的利益。使用ImageJ,他们转换为灰度图像和面积百分比呈正染色是派生的。每个标本6图像的平均面积百分比为用于统计分析。

2.5。MMP-12活动分析

MMP-12浓度在左L4、L5和16种,L5脊神经,收获从大鼠安乐死二氧化碳接触,确定使用MMP-12活动试验(美国CA - 71157, AnaSpec)。标本均质检测缓冲区中含0.1% Triton x - 100和离心机在10000 g×15分钟在4°C。分析缓冲区的上层清液得到进一步稀释10倍。相对于人类MMP-12 MMP-12浓度计算催化域(1μ- 55525 g / ml, Anaspec,美国CA)标准曲线。1毫米5-FAM-Pro-Leu-OH被用作5-FAM荧光仪器校准参考标准。50μl的脊髓神经标本稀释浮在表面的,人类MMP-12催化域稀释,5-FAM-Pro-Leu-OH稀释,只包含测定底物控制缓冲区被添加到96孔板。50μl MMP-12底物被添加到每个孵化前45分钟的37°C。此后,50μl停止所有井的解决方案是添加,荧光强度在交货/ Em = 490/520 nm测量(PHERAstar荧光计,BGM Labtech,德国)。每个样品测定总蛋白相对于白蛋白标准曲线,使用微BCA蛋白质化验设备(微BCA蛋白质化验设备,热科学,妈,美国)。

2.6。MMP-12-Targeted IONP准备

IONPs合成并涂以右旋糖酐,根据约瑟夫森描述的方法等。27]。纳米颗粒与MMP-12共轭探头连接器,通过碘乙酸succinimidyl链接器,它充当一个膜转运蛋白和定位一半(Succyl-eeeeeeeee-RPKPVE-Nva-WR-rrrrrrrr-c)。动态光散射和zetapotential测量(莫尔文Zetasizer Nanoseries,联合王国)。

确定铁浓度,MMP-12-targeted IONP消化在4部分65%硝酸的混合1 30%过氧化氢的一部分。摘要干在Perfluoroalkoxy杯电炉,重组,和稀释0.4%硝酸浓度60 ng / g。样本分析了石墨炉原子吸收光谱法(瓦里安AA240Z SpectraLab科学公司,加拿大),使用标准准备从Titrisol铁标准(109972年,默克公司、德国)外部校准。

2.7。探测细胞毒性,细胞吸收,在体外核磁共振成像

探测细胞毒性评价了甲基噻唑基四唑(麻省理工;M2128, Sigma-Aldrich、钙、美国)测定,MMP-12-expressing U87神经胶质瘤细胞(28]。1×10的密度⁵U87神经胶质瘤细胞被播种在96孔板和孵化MMP-12-targeted IONP在不同浓度(20和10μg / ml) 4 h,其次是孵化与10μl (MTT解决方案(5毫克/毫升)2 h。此后,媒体是吸气,溶解在二甲亚砜,在570 nm测定吸光度。细胞生存能力计算与控制细胞吸光度相比的百分比。

观察细胞吸收的探测器,U87神经胶质瘤细胞被播种到48-well板,5×10的密度³细胞每口井。细胞孵育10μg MMP-12-targeted IONP PFA 40分钟和固定为4%。洗后细胞与PBS,他们使用普鲁士蓝染色协议上面描述。

一个在体外MRI在7 t扫描仪(力量Clinscan系统,德国)使用U87神经胶质瘤细胞的密度1×10⁵。他们要么不及时治疗,孵化与MMP-12-targeted IONP 1 h,或选择性MMP-12抑制剂孵育,MMP408(中科院1258003-93-8,默克密理博,德国)29日]2 h,紧随其后的是一个1 h孵化与MMP-12-targeted IONP。各自的治疗后,细胞与胰蛋白酶消化,离心机,固定为4% PFA在4°C, 1 h和嵌入在1%琼脂糖。T2-WI获得了以下参数:FOV 50 mm, TR 2750 ms, TE 37女士,切片厚度1毫米。平均灰色区域中感兴趣的区域(ROI)用ImageJ测量软件。MMP-12未经处理的神经胶质瘤U87细胞活动,这些与MMP408孵化,使用上述分析量化。

2.8。在活的有机体内核磁共振成像

一天后鞘内管理MMP-12-targeted IONP,核磁共振成像扫描仪进行大鼠7 t(西门子Magnetom ClinScan syngo,德国)。老鼠深深anesthetised与异氟烷在空气(5%的感应和2%的维护)。温度和呼吸监测期间T2-WI收购。使用以下参数:FOV 60毫米,TR 1010 ms, TE 37女士,切片厚度0.8毫米,和飞机分辨率0.188×0.188毫米。

2.9。统计分析

所有数据都表示为平均值±标准偏差(SD)和分析Graphpad棱镜7软件。行为、免疫组织化学、组织学和MMP-12使用Mann-Whitney活动试验数据进行了分析U测试,被认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

3.1。SNL诱发神经性疼痛

行为评估(图1(一)建议结扎左侧L5脊神经成功诱发神经性疼痛在这项研究中使用的所有动物。平均水平面和右和左后爪子TWL区别明显高于7点(22.2±2.04克,4.57±0.687 s)和13天(15.8±2.71,6.11±0.577 s) SNL后,3天前SNL (5.94±2.00 g,−0.389±0.440 s)。虚假的老鼠的平均水平面和TWL差异三个测试点(数据没有差异1(b)和1(c))。因此,机械触诱发痛和热痛觉过敏的左侧明显SNL老鼠直到各自端点(24]。

3.2。巨噬细胞浸润和MMP-12 Upregulation观察结扎脊神经

术后一周CD68免疫染色和MMP-12显示更大的染色的结扎左L5脊神经(CCD68 13.4±7.15%;MMP-12 23.6±18.4%),而左侧L5脊神经sham-operated老鼠(CD68 0.335±0.656%;MMP-12 9.91±9.30%)。SNL老鼠、CD68和MMP-12染色在左L4,离开社会,对L5脊神经低于左侧L5脊神经(图2)。MMP-12活动分析(图3),1周后SNL进一步证实了结扎诱导显著MMP-12 upregulation左侧L5脊神经(0.455±0.253),而虚假的手术(0.106±0.0900)。此外,MMP-12表达式仍升高左L5脊神经SNL(0.510±0.374)后2周。因此,MMP-12-targeted探测器管理SNL或虚假的手术后2周,以确保动物适合鞘内注射。而虚假的手术也感应探测MMP-12水平,它是低于相应脊神经SNL老鼠。观察MMP-12 upregulation在脊髓神经侧和侧结扎左侧L5脊神经。这可能是由于局部炎症反应,手术的侮辱。然而,MMP-12 SNL老鼠的nonligated神经水平仍低于结扎神经。此外,MMP-12水平nonligated神经减少SNL,但增加1和2周后在结扎神经,表明炎症沉降。总的来说,结果表明,巨噬细胞浸润发生主要在结扎的网站,导致增加MMP-12分泌pain-generating现场(21]。

3.3。髓鞘脱失和弹性蛋白纤维损失发生在结扎

显著降低髓鞘和弹性蛋白纤维内容指出在结扎后1周SNL(髓19.6±14.5%,弹性蛋白34.1±11.1%),而相应的虚假的老鼠组织(髓84.5±6.95%,弹性蛋白60.0±4.78%)。脱髓鞘的结扎只是象征成功的实验神经损伤(图4)[30.]。MMP-12是弹性蛋白降解的主要酶(31日]。因此,弹性蛋白纤维损失在结扎符合MMP-12 upregulation观察结扎L5脊神经。

3.4。合成探针提供了足够的对比在体外

优化IONP直径为31.9 nm,铁的浓度1.85毫克,zetapotential 6.36±8.74 mV, U87神经胶质瘤细胞生存能力的107%。此外,我们的MMP-12-targeted relaxivity探针(211.62更易⁻¹年代⁻¹)是与商业造影剂,resovist(228.83更易⁻¹年代⁻¹)。孵化U87神经胶质瘤细胞10μg / ml MMP-12-targeted IONP导致较低的平均灰度值(1310任意单位)收购了先生的形象,比细胞接受调查和MMP408(3: 1460任意单位;4:1480任意单位),未经处理的细胞(1460任意单位),空白(1500任意单位)(图5)。在另一组实验中,5% MMP408 U87细胞MMP-12活动减少了40% (0.254±0.0506 ng MMP-12 /μg白蛋白),而未经处理的细胞(0.423±0.0315 ng MMP-12 /μg白蛋白)。因此,调查没有细胞毒性和由MMP-12选择性裂解在体外,提供足够的对比磁共振成像(12]。

3.5。低信号先生观察到结扎

在没有受伤的左和右L5脊神经,信号略hyperintense先生周围的软组织。相比之下,左侧L5脊神经SNL老鼠多亮,和hypointensive地区观察到近似结扎(图6)。这些大鼠灌注晚期后,收获脊神经的组织学证实的存在铁只受伤的神经(图7)。先生这一结果表明,信号增加左L5脊神经SNL老鼠是由于结扎手术,而手术切除左侧L5 spinus过程或L5层流骨不损伤神经。此外,它表明,只有受伤的神经组织会裂开,吸收足够MMP-12-targeted IONPs,导致信号减少先生。

MMP-12涉及几个炎症、血管和神经系统疾病发病机制(32]。这种自发酶加剧炎症,通过激活pro-MMP-2 pro-MMP-3。这些酶激活其他基质金属蛋白酶,导致几个ECM的降解蛋白质(33]。通过降解ECM, MMP-12使巨噬细胞浸润到受伤的组织,为组织碎片吞噬作用。这是沃勒变性的一个重要过程,发生在神经再生开始之前(34]。在啮齿动物模型的坐骨神经损伤,MMP-12基因和蛋白质水平升高(21,35,36]。同样的,我们研究了MMP-12蛋白质表达和酶活性的另一个模型是神经性疼痛。我们发现高MMP-12在结扎左侧L5脊神经与巨噬细胞浸润有关,ECM降解,机械触诱发痛和热痛觉过敏。因此,这个模型是恰当地使用在活的有机体内评估合成MMP-12-targeted磁IONP。

MMP-targeted探针对在活的有机体内成像的其他炎症性疾病也被开发出来。基质金属蛋白酶是众所周知的生物标记物对癌症,所以MMP-targeted磁性纳米颗粒保持承诺增强MRI的恶性细胞系和tumour-bearing小鼠模型(37- - - - - -40]。除了周围神经受伤,后爪upregulation MMP-12活动发生在老鼠的胶原诱导关节炎。这是近红外光学成像探测到,使用一个MMP-12-selective福斯特共振能量转移调查(41]。MMP-12也是一个有前途的治疗目标,因为当地政府的选择性抑制剂减少机械触诱发痛和热痛觉过敏,一周后部分坐骨神经结扎(36]。因此,MMP-targeted分子探针是有价值的工具,以改善成像技术。它们可能被用于神经病变检测和管理,以及神经性疼痛的药物开发。

IONP-based MRI是一种可行的技术为临床使用。一些IONPs已通过MRI造影剂,在其他实验和研究IONPs越来越多。虽然MMP-targeted IOPNs测试过几个疾病模型,它们需要进一步发展提高信号检测灵敏度先生(42]。提高可靠性的方法之一是通过开发多目标探测。IONPs的目标效率在周围神经受伤可能提出构建IONPs可以裂解其他调节基质金属蛋白酶,即MMP-9和MMP-7 [21]。其他蛋白表达增加受伤的神经包括aquaporin-4、白介素1受体和periaxin可能检测到antibody-conjugated IOPNs [43]。

这是第一个研究开发一个MMP-targeted nanoprobe增强在活的有机体内MRI在神经性疼痛模型中,尽管有局限性。的临床效用,造影剂应该是系统管理。然而,开发IONPs适合静脉管理仍然是一个挑战。生物屏障和互动与血液蛋白质限制系统循环IONPs达到目标组织(19]。达到足够的biodistribution腰椎神经,大量的磁性粒子必须静脉注射。然而,这是超出了当前的研究的范围。由于生成左侧L5 SNL的困难模式23),样本量小和控制实验使用不属预定目标的IONPs没有完成。

4所示。结论

MMP-12表达升高的结扎神经性疼痛动物模型的脊髓神经。此外,MMP-12是一个潜在的目标酶IONP-enhanced MRI脊髓神经受伤。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者没有利益冲突的声明与这项工作或其提交出版。

作者的贡献

Syeda Fabeha侯赛因和雷蒙德·w·m·兰姆的贡献同样这项工作。

确认

作者要感谢先进分子病理学实验室研究所的分子和细胞生物学,∗明星,新加坡,准备石蜡包埋标本。作者还要感谢临床成像研究中心在新加坡国立大学的援助在活的有机体内核磁共振成像。这项工作是国家医学研究委员会的支持下,新加坡。