文摘

炎症性肠病的发病率和患病率(炎症性肠病、克罗恩病和溃疡性结肠炎)正在增加。炎症性肠病的病因是多方面的,包括遗传易感性,特异表达的免疫反应、微生物生态失调,和环境因素。然而,许多现有的疗法与标记相关的副作用。因此,开发新的药物治疗炎症性肠病是一种重要的区域调查。在这里,我们调查的抗炎作用α没药醇,天然单环的倍半萜烯醇存在于许多芳香植物,在结肠炎症。为了解决这个问题,我们用分子对接和动态研究了解α没药醇与PPAR -γ结肠上皮细胞中表达,这是高度:体内(老鼠)和体外(RAW264.7巨噬细胞和HT-29结肠细胞腺癌)模型。分子对接和动态分析显示α没药醇与PPAR -γ核受体蛋白质结肠上皮细胞中高度表达。治疗α没药醇DSS-administered小鼠显著降低疾病活动指数(DAI)、髓过氧化酶(MPO)活动以及结肠长度和保护结肠的微体系结构。α没药醇治疗也减少促炎细胞因子(il - 6,摘要意思的表达β肿瘤坏死因子-α和IL-17A)在蛋白质和mRNA水平。cox - 2的表达和伊诺炎症介质降低以及组织亚硝酸盐水平。此外,α没药醇降低活化增殖的磷酸化蛋白激酶(MAPK)信号和核因子k B (NFκB)蛋白质和增强结肠上皮PPAR -γ转录因子表达。然而,PPAR -α和β/δ表达式并没有改变,说明α没药醇是一种特定刺激的PPAR -γ。α没药醇也增加了PPAR -γ转录因子的表达而不是PPAR -α和β/δ在进行预处理LPS-stimulated RAW264.7巨噬细胞。α没药醇显著减少促炎趋化因子的表达(CXCL-1和引发)mRNA在HT-29细胞治疗肿瘤坏死因子-α和HT-29 PPAR -γ启动子活动。这些结果说明α没药醇减轻结肠炎症通过抑制MAPK信号和刺激PPAR -γ表达式。

1。介绍

炎症性肠病(IBD)是慢性炎症性疾病,包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC),影响整个胃肠道或限于结肠。这些疾病的特点是复发和汇款肠道炎症,上皮损伤。IBD的发病率和患病率不断上升的全球(1,2]。炎症性肠病的病因是多方面的,包括遗传易感性,免疫反应,特异表达和肠道微生物组失调,以及环境因素。药物用于治疗炎症性肠病中存在由于各种因素的限制个人IBD患者。因此,开发新的药物来治疗IBD患者继续体现研究的重要领域。

过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs),一群核受体蛋白,调节脂质代谢,细胞增殖,胰岛素敏感和扮演至关重要的角色限制肠道炎症(3]。有三种亚型PPARs, PPARα,PPARβ/δ和PPAR -γ。PPAR -γ是用三种形式表达PPAR -γ1、2和3所产生同样的基因的选择性剪接。有趣的是,PPAR -γ1,PPAR -γ3码475氨基酸相同的蛋白质(4]。PPAR -γ1是广泛表达,而PPAR -γ3只结肠中高度表达,脂肪组织,和巨噬细胞4]。事实上,结肠muscosa PPAR -的最高表现γ人体任何组织(5]。PPARs二聚化类维生素a X受体(RXR),然后这个复杂的绑定到特定区域的DNA称为PPAR响应元素(PPRE)激活靶基因的转录。PPARs是介导的抗炎反应通过抑制促炎细胞因子和趋化因子激活通过内生时,合成,或植物化学的配体(6- - - - - -8]。特别是,PPAR -γ1,PPAR -γ3高度结肠上皮细胞中表达,在巨噬细胞和淋巴细胞(在较小程度上9]。PPAR -γ表达下调60%信使rna和蛋白质水平相比UC患者结肠黏膜的CD患者(9]。因此,调制PPAR -γ在结肠内成为一个潜在的药物可以利用目标治疗炎症性肠病,尤其是溃疡性结肠炎,以及结肠癌。

α没药醇是一种天然的单环的倍半萜烯醇,洋甘菊chamomilla和其他芳香植物,如Eremanthuserythropappus Smyrniopsisaucheri,鼠尾草runcinata,和Vanillosmopsis物种(10,11)拥有强大的镇痛,抗菌,消炎作用[12- - - - - -14]。在骨关节炎的小鼠模型,α没药醇抑制炎症和细胞外基质(ECM)变性引起晚期糖化终端产品(年龄)15]。α没药醇cotreatment在LPS-stimulated RAW264.7巨噬细胞抑制促炎介质如cox - 2的表达,伊诺表达式,NF -κB信号通路减少促炎细胞因子反应(14]。激活NF -κB在促炎细胞因子的转录中起着重要的作用。明显的激活NF -κBsignaling观察巨噬细胞和上皮细胞分离的IBD患者同时发生炎症的严重程度在这些病人16]。

在网上对接分析显示α没药醇PPAR -有很强的亲和力γ结合位点。PPAR -γ形成一个复杂的NF -κB亚基p65核层面导致促炎基因表达的改变由NF -κb抑制NF -κPPAR - B在应对活动γ配体变弱的表达各种细胞因子il - 1等结肠上皮细胞βcox - 2, il - 6,引发,TNF -α,干扰素γ,进气阀打开,趋化因子(9,17]。根据这些观察,我们调查了调解的抗炎作用的分子机制α没药醇在结肠炎症的小鼠模型,LPS-stimulated RAW264.7巨噬细胞,和TNF -α挑战结肠细胞腺癌(HT-29)。

2。材料和方法

2.1。化学试剂和细胞

葡聚糖硫酸酯钠(DSS)(36000 - 50000兆瓦kDa-MP生物医学,梭伦,哦,美国)。α没药醇溴化hexadecyltrimethylammonium (HTAB)和orthodianisidine盐酸盐(奇数)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。il - 6、il - 1β和肿瘤坏死因子-αELISA试剂盒购自研发系统(明尼阿波利斯,美国)。逆转录工具包是采购应用生物系统公司(美国CA福斯特城)。有EvaGreen 5×mastermix从索利斯生物因素(爱沙尼亚塔尔图)。Macrogen Inc .(韩国首尔)提供了mastermix和定量rt - pcr引物。蛋白酶和磷酸酶抑制剂从热电电子采购(美国罗克福德,IL)。抗体是购自圣克鲁斯生物技术(美国达拉斯,TX);目录数据给出了在我们宝贵的出版物16]。商用pNL 1.3和pNL1.3。CMV向量从Promega购买(猫# N1021 & N1101麦迪逊,WI,美国),和PPRE-pNL1.3质粒从Addgene购买(猫# 84394,水城,妈,美国)。其他试剂从供应商获得在我们之前出版上市(18]。

RAW264.7巨噬细胞和HT-29结直肠恶性腺瘤细胞从美国获得类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。

2.2。分子对接

分子对接研究PPAR -γ配体结合域。PPAR -晶体结构γ配体结合域(PDB ID: 5 y2t)解决在1.70从蛋白质数据库(检索http://www.rcsb.com)。在准备对接的蛋白质结构模拟,结合配体和水分子被移除。此外,氢原子被添加,随后,添加氢原子的位置进行了优化的梯度规范0.05小炉匠8程序(19]。正确的质子化作用州每个残留物被分配使用PROPKA程序(引用:doi:10.1021 / ct200133y)。的二维结构配位体(lobeglitazone)和约束α没药醇被吸引,随后转化为3 d结构马文草图5.6.0.0计划(http://www.chemaxon.com)。生成的3 d结构几何优化分配gasteiger指控后UCSF嵌合体1.8 [20.)项目的组合最陡下降和共轭梯度几何搜索条件,直到梯度收敛于0.05和0.01,分别。分子对接研究进行Autodock维纳(21]。捕获的结合位点适应性PPAR -γ结合位点,与绑定lobeglitazone残基形成氢键相互作用,即Ser289, His323, His449, Tyr473,和残留形成疏水相互作用,即Cys285, Leu330, Ile341, Met348被选为灵活的残留物。周围的网格框是结合配体的中心尺寸 ,足够大的搜索结合位点可能构象空间。灵活对接进行了穷尽性的100访问整个搜索空间的结合位点和合成绑定自由能估计,绑定的姿势,和关键的相互作用进行了分析。

2.3。分子动力学仿真研究和MM-PBSA计算

PPAR -γ裸露的蛋白质,以及复杂的停靠α没药醇结合位点的PPAR -γ,受到了MD模拟使用Gromacs 4.5.6 [22]。MD模拟进行生物信息学资源和应用程序的远程服务器设施(BRAF) C-DAC,浦那。蛋白质的拓扑构造的参数实现Gromos54a7力场(23),而配体拓扑兼容Gromos54A7生成在作为服务器(24,25]。适当的溶剂合物系统,一个简单点电荷(SPC216)水模型(26),和适当的中和系统如钠离子和氯离子。这种溶剂化系统受到的能量最小化的最陡下降标准删除空间冲突。平衡在恒压系统,体积,和温度300 K条件100秒。这个平衡系统受到50 ns MD模拟与培训在共价键使用距离算法[27)和12的截止值的长程静电学如库仑和林纳德琼斯与粒子网格埃瓦尔德方法(28]。Post-MD分析是通过测量偏差的蛋白质和配体原子均方根偏差(RMSD)。原子的波动程度的残留蛋白质的根意味着广场波动(RMSF)测量也被认为是在估算protein-ligand复合物的稳定性。回转半径(Rg)均方根距离的原子的集合共同质心和提供信息的蛋白质结构的紧凑性,也进行了分析。氢键的形成是最重要的一个键作用力。氢键形成的现象在MDS的进展进行了分析以及氢键形成的数量。

2.4。动物

C57BL / 6 J小鼠(12周)重25 - 30 g从中央采购动物设施,不啻,阿联酋大学。两只动物每笼保持每个实验开始前1周驯化的实验。动物们保持在温度 ,12 h光暗周期,50 - 60%湿度。食物和水都是随意提供的。UAEU机构动物伦理委员会批准了当前的研究(# ERA_2019_5845)批准。

2.5。实验设计

老鼠被随机分配到5组,每组8动物):我:未经处理的控制。组2:DSS。第三组:DSS +没药醇(Bis)(100毫克/公斤体重/天)。第四组:DSS + Bis(200毫克/公斤体重/天)。V: DSS + SAZ(50毫克/公斤体重/天)。DSS(2%)制备新鲜每天在热压处理过的饮用水。年底的密集治疗协议,使用戊巴比妥过量的动物安乐死(100毫克/公斤体重)。冒号是戴手术切除和长度测量,包括盲肠。冒号被冰冷的生理盐水清洗去除粪便的内容。清洗后,结肠刮黏液层分离,这是snap-frozen立即使用液态氮和储存在−80°C到进一步使用。 Another set of colons were cut longitudinally and coiling started from proximal (in the center) to distal as like swiss roll and then fixed using 10% formalin for hematoxylin and eosin (H&E) staining.

2.6。评估疾病活动指数(DAI)得分

老鼠体重每日观察稀便,腹泻,出血。傣族的分数计算是基于参数作为发表在我们之前的研究(29日]。简而言之,傣族从日常记录获得的分数的分数占损失的重量,便溏/腹泻,出血如表示1。

2.7。促炎细胞因子估计通过酶联免疫吸附试验(ELISA)

结肠粘膜均质磷酸酶和蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板(美国热电电子猫# A32959)溶解在缓冲里帕(猫# 20 - 188,微孔,圣路易斯,密苏里州,美国)与锆珠(2毫米,猫# 11079124 zx Biospec,巴特尔斯维尔,好的,美国)在Precellys 24组织均质器(贝尔坦公司仪器、Montigny-le-Bretonneux、法国)。然后,合匀浆离心机在1000×g在4°C。离心后,上清液转移到一个新的微型离心机管与温和的混合管旋转一夜之间在4°C。匀浆是离心机在4°C 15000×g为30分钟,上层清液的稀释(1:3)与里帕缓冲区,和它的蛋白质浓度估计使用皮尔斯BCA分析工具包(美国热电电子猫# 23225)。未稀释的匀浆一直在-80°C整除,供以后使用。肿瘤坏死因子-α,il - 1β、il - 6和IL-17细胞因子测定的ELISA测定结肠粘膜匀浆根据制造商的指示。

2.8。髓过氧化酶(MPO)测定

组织MPO活性测定如前所述[30.]。短暂,~ 25毫克刚刮结肠粘膜均质使用锆珠在50 mM磷酸盐缓冲剂(pH值6)含0.5%溴化hexadecyltrimethylammonium (HTAB)。匀浆处理通过冻融循环(液氮和25°C水浴)和用30秒。这个过程重复了三次。悬浮液被离心机在20000 g 20分钟在4°C。上层清液(0.1毫升)增加了2.9毫升的50 mM磷酸盐缓冲剂(pH值6)含有盐酸o-dianisidine 0.53毫米和0.15毫米,过氧化氢和吸光度的变化测量每15秒,5分钟在460海里。这些研究结果表示在单位(U) MPO /毫克的蛋白质。上层清液的蛋白质浓度是由皮尔斯BCA蛋白质分析工具包(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。MPO活性测定平均吸光度在460 nm /孵化时间/蛋白质浓度。

2.9。组织病理学评价

准备的瑞士roll-colon使用10%甲醛溶液固定过夜。脱水过程进行了使用乙醇浓度递增的顺序。组织脱水是嵌入在石蜡。石蜡包埋(蛋糕)结肠切成薄片(2μ米厚)和使用)染色组织学分析。临床病理学家评估组织病理学的变化确定每个样本的得分。这些样本被蒙蔽组织病理学评价: 。结肠炎症程度是决定按照先前发表的研究中解释表2(31日]。

2.10。RNA提取和实时rt - pcr

结肠粘膜的RNA提取和转换的cDNA和实时PCR进行如前所述[32]。18 s基因产物作为内部参考目前的基因研究。CT值的变化计算使用CT(2 -δCT方法ΔΔCT) (33]。本研究使用的所有基因的引物序列是在我们之前的研究报告(32]。引物用于实时PCR分析如下:人类PPAR -γ(PMID号20421464):转发:5 - - - - - -TTCAAGAGTACCAAAGTGCAATCAA-3 ,反向:5 - - - - - -AATAAGGTGGAGATGCAGGCTC-3 。人类PPARα(PMID号28732066):转发:5 - - - - - -ATCGGCGAGGATAGTTCT-3 ,反向:5 - - - - - -AATCGCGTTGTGTGACAT-3 。人类PPARβ/δ(PMID号16197558):转发:5 - - - - - -GTCACACAACGCTATCCGTTT-3 ,反向:5 - - - - - -AGGCATTGTAGATGTGCTTGG-3 。鼠标PPARα(PMID号26308623):转发:5 - - - - - -ATGCCAGTACTGCCGTTTTC-3 ,反向:5 - - - - - -CCGAATCTTTCAGGTCGTGT-3 。鼠标PPARβ/δ(PMID号28404991):转发:5 - - - - - -CTCAATGGGGGACCAGAACA-3 ,反向:5 - - - - - -AAGGGGAGGAATTCTGGGAGA-3 。鼠标IL-17A (PMID 27578011):转发:5 - - - - - -ATCCCTCAAAGCTCAGCGTGTC-3 ,反向:5 - - - - - -GGGTCTTCATTGCGGTGGAGAG-3 。

2.11。免疫印迹

结肠粘膜冷冻样本均质与蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒里帕缓冲区使用珠均质器如前所述[32]。未稀释的匀浆蛋白浓度测定用皮尔斯BCA蛋白质分析工具包(美国热电电子猫# 23225)。20μg(结肠组织,RAW264.7巨噬细胞)蛋白质是解决使用钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)使用凝胶8 - 12%,随后转移到PVDF膜。这些PVDF膜使用特定的抗体(免疫涂抹cox - 2,进气阀打开,PPAR -αPPAR -β/δPPAR -γp^Ser536NFκB p65)。内部控制规范化使用的屁股是GAPDH。

2.12。测量超氧化物歧化酶、过氧化氢酶酶活性和组织亚硝酸盐浓度

超氧化物歧化酶(SOD)是化验用的方法Kakkar et al。34基于50%抑制的形成NADH-phenazine methosulphate-nitroblue四唑(电视台)甲瓒在520海里。一个单位的酶作为酶的数量需要减少50%抑制电视台/分钟/毫克的蛋白质。过氧化氢酶活性(CAT)是由Sinha的方法(35]。猫的价值活动都表示为摩尔的H₂O₂利用/分钟/毫克的蛋白质。一氧化氮(NO)的含量在结肠匀浆测定方法使用格里斯试剂的陆et al。36];亚硝酸盐浓度,没有生产的一个指标,计算了纳米₂标准曲线,表示为μ摩尔/毫克的蛋白质。急冻结肠癌样本处理生化估计第二天的样本集合。

2.13。生巨噬细胞和HT-29细胞培养

RAW264.7巨噬细胞和HT-29结肠癌细胞培养在37°C和5%的股份有限公司₂在湿润孵化器high-glucose DMEM,包含100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素,10% (v / v) heat-inactivated胎牛血清的边后卫。培养的巨噬细胞被播种( 细胞每)到6-well板治疗前24小时。诱导炎症巨噬细胞治疗1毫克/毫升有限合伙人有或没有α没药醇(20和40μ米)24 h。治疗后,炎症介质的表达中收集(il - 6、il - 1β肿瘤坏死因子-α),收集细胞与里帕缓冲区添加蛋白酶抑制剂PPAR -的测量αPPAR -β/δPPAR -γ和p^Ser536NFκB p65蛋白。HT-29细胞被用来执行PPAR -γ催化剂试验。只有PPAR - HT-29细胞利用γ发起人/ nanoluciferase化验。

2.14。细胞生存能力分析

巨噬细胞和HT-29细胞(5000细胞/)被播种到96孔板和一系列处理α没药醇浓度(0、12.5、50、100、150年和200年μ米)24小时和48小时。根据制造商的指示,细胞生存能力决定使用细胞Titer-Glo®显示治疗后生存工具包。发光测量使用Tecan(无限®200 PRO)板读者。数据被表示为可行的细胞百分比(量化通过ATP内容)α没药醇治疗组与未经处理的相比,对照组。

2.15。PPAR -γ发起人andNanoluciferase化验

向量和质粒表达lumniscentNanoLuc®荧光素酶)变成了JM109主管结扎法和细菌细胞的培养在125毫升媒体37°C。使用质粒纯化的质粒提取Maxiprep工具包(猫# 12162、试剂盒、德国)按照制造商的指示。质粒DNA和Lipofectamine第混合物回答准备在血清和不需抗生素的DMEM媒体如前所述18]。的瞬时转染PPRE-pNL1.3或pNL1.3基本荧光素酶分泌记者作为控制。HT-29细胞转染24-well板块(Kennebunk猫# 3516,康宁配角,我,美国)使用Lipofectamine第+(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)后,制造商的协议。24小时后,Lipofectamine肝移植+添加媒体被删除,取而代之的是新鲜FBS-media含有2%α没药醇40μ米或PPAR -γ受体激动剂(GW1929)或PPAR -γ拮抗剂(GW9662)或GW9662 +α没药醇40μ24小时段。治疗24小时后,每个细胞上清液被分发到96孔黑版(猫# 237105,热电电子、鲁开德、丹麦),和分泌NanoLuc荧光素酶活性测定使用Nano-Glo®荧光素酶检测缓冲区(WI猫# N1120, Promega,麦迪逊,美国)根据制造商的指示。发光在每个被使用Tecan然后测量多模板读者。

2.16。统计分析

统计分析了使用GraphPad棱镜(版本9)软件,圣地亚哥,加州,美国。组比较的数据方差分析(方差分析)。为多个比较,非参数,图基的事后测试使用。数据表示为 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。分子对接和动态研究

结合配体结合位点的lobeglitazone PPAR -γ被发现与Ser289、His323 His449, Tyr473, Cys285, Leu330 Ile341, Met348。验证灵活对接协议,lobeglitazone停靠在结合位点的优化结构。lobeglitazone几乎匹配的对接构成共晶构成,和根方差(RMSD)原子的姿势被发现以下2(图1)。产生的交互对接构成lobeglitazone也类似于共晶产生的姿势。这确保了验证灵活对接协议进行进一步的研究。优化的结构α没药醇停靠PPAR -的结合位点γ对接结果在下表中给出3。

3.2。的影响α没药醇疾病活动指数(DAI),结肠长度和髓过氧化物酶(MPO)活性

傣族DSS-administered组的得分显著高于对照组。的治疗α没药醇(100和200毫克/公斤体重)显著减少戴DSS-administered动物的分数。SAZ用于治疗炎症性肠病也戴成绩下降;然而,α没药醇比SAZ(图效果更强2(一个))。DSS-administered组显示显著和显著减少结肠长度与对照组相比。没药醇治疗显著预防减少结肠长度DSS-administered组。正如所料,SAZ治疗也阻止了减少结肠长度(数字2 (b)和2 (c))。测量MPO活性作为替代标记的中性粒细胞浸润炎症。DSS管理显著增加结肠MPO活性比控制。没药醇治疗显著和显著降低MPO活性。SAZ治疗也降低MPO活性(图2 (d))。

3.3。的影响α没药醇在结肠组织学

的蛋糕)控制染色组织学显示格式良好的表面绒毛,在整个结肠隐窝。黏膜下层、肌层厚度是正常的。DSS管理导致焦表面上皮,扭曲的绒毛,明显损害的蓄水池,明显水肿粘膜下舱,肌肉层的增厚。没药醇治疗显著防止绒毛和地下室的变化,减少粘膜下水肿,肌层厚度与集团管理只有DSS。这也导致显著减少结肠炎症的分数。SAZ预防结肠微体系结构的变化和减少结肠炎症的分数。然而,α没药醇更有效的减少结肠炎症评分相比SAZ组(数字3(一个)和3 (b))。

3.4。的影响α没药醇促炎细胞因子和中介蛋白质和mRNA的表达

DSS政府大幅增加促炎细胞因子(il - 1的表达β、il - 6、TNF -α和IL-17A)蛋白质和mRNA水平,与对照组相比。α没药醇(100和200毫克/公斤体重)治疗明显减少促炎细胞因子蛋白和DSS的mRNA水平管理的动物。SAZ也阻止了促炎细胞因子的增加(数据4(一)- - - - - -4 (h))。的影响α没药醇等促炎介质cox - 2和伊诺DSS-administered动物也被评估。DSS政府cox - 2的表达明显增加,进气阀打开蛋白质和mRNA水平相比控制。没药醇治疗预防cox - 2和伊诺表达的增加蛋白质和mRNA水平。α没药醇治疗也阻止了DSS-induced组织亚硝酸盐浓度的增加。这与伊诺表达的程度。这些结果表明,α没药醇的抗炎行动是由防止增加促炎细胞因子和介质(数据的表达式4(我)- - - - - -4 (k))。

3.5。的影响α在结肠MAPK没药醇,NF -κB信号通路和PPAR -γPPAR -αPPAR -β、蛋白质、和mRNA表达

MAPK途径与炎症和激活转录因子NF -κB调节多种基因参与炎症通路的表达。因此,我们评估的影响α没药醇MAPK和NF -κB DSS-administered动物的信号通路。DSS-administration显著增加MAPK通路蛋白的磷酸化,兵、物和p38结肠癌与对照组相比。没药醇治疗DSS管理动物显著预防DSS-induced这些蛋白质的磷酸化(数字5(一)-5(c))。同样,DSS政府增加了p的磷酸化^ser536NF -κB p65蛋白指示其激活,没药醇治疗显著降低这种磷酸化(图5(d))。PPAR -γ是一个重要的转录因子,负面影响结肠炎症,结肠上皮细胞中高度表达。因此,的影响α没药醇在结肠上皮PPAR -γPPAR -α和PPAR -βDSS-administered动物蛋白表达测定采用免疫印迹和mRNA表达研究。DSS政府大幅下调PPAR -γ蛋白质和mRNA表达与对照组相比。相比之下,没药醇治疗显著调节PPAR -的表达γ蛋白质和mRNA水平(数字5(e)和5(f))。然而,PPAR -α和PPAR -β蛋白质和mRNA表达不受DSS治疗或管理α没药醇DSS-administered动物(数字5(g) -5(j))。

3.6。的影响α没药醇预处理对LPS-Stimulated RAW264.7巨噬细胞生存能力,促炎细胞因子反应,PPAR -γPPAR -αPPAR -β和蛋白表达

优化细胞治疗协议,RAW264.7细胞治疗与不同浓度(0 - 100μ24小时和48小时)α没药醇评估细胞的可行性。没有明显的细胞毒性甚至在100年首次观测到μ治疗24或48小时后(数字6(一)和6 (b))。基于这些最初的实验,浓度的20倍μM和40μ米α没药醇被用于后续的调查。细胞被使用α没药醇6 h LPS-stimulation之前。随后,分泌促炎细胞因子测定细胞培养上清液,和相应的mRNA水平也用细胞溶解产物样本。LPS刺激显著增加释放促炎细胞因子(il - 1β、il - 6和TNF -α)与控制。没药醇预处理明显阻止LPS-stimulated增加促炎细胞因子分泌和mRNA水平(数字6 (c)- - - - - -6 (h))。了解中介的抗炎作用机制α没药醇在LPS-stimulated RAW264.7细胞,PPAR -的表达γPPAR -αPPAR -β蛋白质和磷酸化pNF——虽然κB p65。我们使用只有一个剂量(40μ米)的α为这些研究没药醇。LPS-stimulation显著减少了PPAR -γ蛋白质的磷酸化表达和显著增加NF -κB p65转录因子。相比之下,没药醇预处理显著增加PPAR -γ蛋白表达和NF -减少磷酸化κB p65。类似于体内数据,LPS-stimulation单独或之后α没药醇预处理并没有改变PPAR -α和PPAR -β蛋白表达(图6(我)- - - - - -6(左))。这些结果表明,α没药醇特别增加PPAR -γ转录因子蛋白表达,而不影响其他亚型的PPARs。

3.7。的影响α没药醇TNF -α挑战HT-29结肠细胞腺癌促炎趋化因子mRNA表达和启动子γ- ppar化验

肿瘤坏死因子-α挑战HT-29细胞腺癌是一种广泛接受体外模型系统对人类结肠上皮炎症。因此,我们最初的实验旨在研究不同浓度的影响α没药醇(0 - 200μM 24 h) HT-29细胞生存能力。没药醇是200年细胞毒性的浓度μ米24 h后(图7(一))。基于细胞生存能力分析数据,我们使用20μM和40μM无毒浓度为后续实验。肿瘤坏死因子-α引起了促炎介质的表达显著增加,CXCL-1,引发mRNA HT-29细胞相比,控制。没药醇cotreatment大大阻碍了增加的mRNA的表达这些炎症介质(图7 (b)和7 (c))。

获得进一步的了解观察是否增加PPAR -γ转录调控的蛋白表达,PPAR -γ响应要素推动荧光素酶基因的表达质粒(PPRE-pNL1.3 [secNluc])是转染到HT-29细胞对催化剂反应进行调查。这些转染细胞与治疗α没药醇(40μ米)或PPAR -γ受体激动剂(GW1929), PPAR -γ拮抗剂(GW9662), GW9662 +α没药醇(40μM) 24小时段。产生荧光素酶的发光的决心spectrophotometrically细胞培养基。这两个α没药醇和PPAR -γ受体激动剂(GW1929)治疗显著增加荧光素酶的发光强度在上层的文化相比,参与PPRE-pNL1.3 secNluc转染控制。然而,PPAR -γ拮抗剂治疗不会增加发光强度和类似于参与PPRE-pNL1.3 secNluc转染控制(图7 (d))。这些结果表明,α-bisabolol-mediated增加PPAR -γ蛋白表达是转录调控的。

4所示。讨论

α没药醇是一个包含一个羟基的单环倍半萜烯醇、环己烯环和二甲基戊烯基链。分子对接和动态研究表明,关键氢键形成的倾向只在于孤独的羟基,best-docked构成的α没药醇被发现与Ser289 Cys285形成氢键。的亲脂性的部分α没药醇占据了疏水空腔PPAR -有约束力γPhe282包围,Leu453 Cys285, Gln286。尽管结合能估计是比较高α没药醇(-7.4千卡每摩尔)比lobeglitazone(-9.5千卡每摩尔),分子间相互作用模式显示α没药醇与结合位点产生氢键和疏水相互作用的关键。RMSF分析表明,残留从380年到476年接受波动的情况α没药醇绑定PPAR -γ(图2 (c))。从这个地区的大部分残留存在结合位点,尤其是Ser289 Cys285, Phe282, Leu453, Gln286, Tyr473 His449, His323, Leu330, Ile341, Met348重要nonbonded交互的关键。氢键分析还表明,α没药醇最多可以形成两个氢键PPAR -γ结合位点。至少一个氢键形成一直看到整个MDS(图2 (d))。MDS分析表明α没药醇PPAR -有很强的亲和力γ结合位点。

基于分子对接和动力学研究,以进一步评估的作用α没药醇作为PPAR -γ受体激动剂在结肠炎症,体内和体外模型。α戴没药醇治疗显著降低分数和维护结肠长度和微体系结构。类似的效果α没药醇也观察到在保护肺组织学炎症在脓毒症模型(37,38]。DSS-induced炎症导致增加渗透导致显著的免疫细胞分泌的细胞因子和趋化因子39]。溃疡性结肠炎的发展是伴随着NO-synthase系统的激活和cox - 2表达的增加40]。α没药醇显著抑制炎性细胞因子的表达以及cox - 2和伊诺mRNA和蛋白水平。先前的研究也由报告类似的效果α没药醇抑制cox - 2和伊诺表达式LPS-induced巨噬细胞和rotenone-induced帕金森病大鼠模型(14,41]。

T-helper-17 IL-17A是一种重要的细胞因子分泌的细胞在慢性炎症和自身免疫性疾病的条件。IL-17A强烈与结肠炎。IL-17A淘汰赛中显示减少炎症程度比野生型结肠炎诱导时使用DSS [42]。α没药醇治疗抑制IL-17A表达蛋白质和mRNA水平,表明抑制IL-17A轴可能导致观察到的化合物的抗炎作用。

激活MAPK信号通路介导炎症过程。表达增加MAPKs已经观察到在IBD患者的肠道粘膜(43,44]。因此,分子抑制MAPKs成为治疗的一个有吸引力的目标。结肠炎的实验研究进行了使用特定物抑制剂(抑制剂SP600125), ERK(抑制剂U0126)和p38(抑制剂SB203580)起到保护作用的促炎细胞因子释放(34,36,37]。α没药醇降低ERK的磷酸化、物和p38蛋白质参与MAPK信号通路在目前的研究。α没药醇曾被证明在实验模型中抑制MAPKs LPS-induced肺部炎症和retinone-induced帕金森(41,45]。的能力α没药醇抑制MAPK激活可以部分解释在我们的实验观察到的抗炎作用。

PPAR -γ结肠上皮细胞中高度表达,以及巨噬细胞驻留在结肠粘膜固有层相邻(46]。先前的研究显示低PPAR -γUC患者结肠粘膜的表达与控制(9,47]。同样,巨噬细胞固有层的隔离DSS-induced结肠炎小鼠显示减少PPAR -γ表达,表示它的重要性在结肠炎症48]。事实上,PPAR -γ中起关键作用表达下调炎症通过抑制NF -κB激活(49,50]。PPAR -γ及其配体抑制巨噬细胞激活,炎性细胞因子,如肿瘤坏死因子-生产α、il - 6和il - 1β,表达下调NF -κB信号(3]。我们的结果表明,α专门PPAR -没药醇治疗特别和显著增加γ表达在DSS-administered动物蛋白质和mRNA水平。相比之下,PPAR -α和β/δ亚型没有影响。这些发现表明,α没药醇作为PPAR -γ配体增加PPAR -γ表情,体内结肠炎症模型和RAW264.7巨噬细胞。之前的研究使用ethanolic提取菊花的花(Matricariarecutita)显示激活的PPAR -γ在老鼠和诱导的抗糖尿病的效果。这是归因于ethanolic提取中出现的植物成份,包括α没药醇(51,52]。

HT-29腺癌的细胞表现出几位人类结肠上皮细胞的细胞方面53]。因此,我们的下一个目标是调查是否α没药醇在HT-29细胞介导抗炎作用。模拟炎症状态,HT-29细胞与肿瘤坏死因子-挑战α,完善的体外模型结肠炎症(54]。HT-29细胞可行性分析表明α在高浓度(100没药醇显示细胞毒性μ米或更高)。基于这些结果,我们选择的浓度20和40μ米,这并不影响细胞的生存能力。α没药醇显著降低CXCL-1和引发趋化因子mRNA表达在肿瘤坏死因子-α挑战HT-29细胞,进一步支持其强有力的抗炎效果。

PPAR -γ属于核受体家族组成的大约50转录因子参与许多生理功能。它是一个重要的核受体控制许多调控基因的表达在脂质代谢,胰岛素敏感,炎症和细胞增殖(55]。PPAR -γ通过配体激活发生约束力导致受体的构象变化,使招聘共激活剂诱导转录激活的蛋白质。的转录活动PPAR -γ是由转译后的变化如磷酸化和泛素化。细胞核内的激活需要heterodimerization核受体与另一个名为X受体类维生素aα(RXRα),导致绑定特定DNA序列元素被称为过氧物酶体扩散国元素(ppr) [56]。许多饮食营养和植物化学物质调节PPAR -γ活动通过激活受体(57]。然而,一些研究也表明增加PPAR -γ蛋白表达除了受体激活。在当前的研究中,我们也观察到增加PPAR -γ蛋白表达。类似的效果也被认为与其他PPAR -γ受体激动剂研究中从其他组58,59]。PPAR -γ受体激动剂LYSO-7预防炎症和降低中性粒细胞浸润和髓过氧化物酶活性在乙醇/ HCl-induced胃损伤大鼠模型。LYSO-7介导的抗炎效应通过增加PPAR -的表达γ信使rna和蛋白质含量(59]。在模型中,乙酸的管腔内的应用导致慢性胃溃疡大鼠,这是伴随着海拔的促炎细胞因子(TNF -α和il - 1β)和蛋白质水平的核p65 NF -亚基κB,但降低了PPAR -γ基因表达(58]。在这个模型中,PPAR -γ吡格列酮配体,减少溃疡的严重性和压抑的TNF -水平α和il - 1β和核p65亚基,但相比之下,增加了大量的PPAR -γ在胃粘膜58]。在另一项研究中,一个βPPAR -咔啉生物碱,骆驼蓬碱增加表达式γ通过一个机制涉及Wnt信号通路,但它并没有直接激活PPAR -γ在transactivation分析(60]。

观察到的PPAR -增加γ表达式由α没药醇在RAW264.7 DSS-administered结肠炎模型和巨噬细胞可能是转录调控的。因此,为了解决这个问题,与PPRE-pNL1.3 HT-29腺癌的细胞转染质粒含有PPAR -γ启动子治疗40μ米的浓度α没药醇(61年]。的α没药醇治疗显著增加PPAR -γpromoter-driven荧光素酶的表达。的α没药醇介导的启动子表达相当的PPAR -γ受体激动剂GW1929。的se results indicate that the increased PPAR-γ表达的α没药醇是转录监管。

5。结论

Phytochemical-based天然配体存在于药用植物在炎症性肠病药物发现感兴趣的,因为他们的潜在的PPAR -提高表达和激活γ在结肠。我们的研究证实α没药醇具有强大的抗炎特性减轻结肠炎症。由观察到抗炎活动α没药醇主要归因于增加结肠PPAR -γ表达和抑制MAPK、炎性细胞因子和NF -κB信号通路。α没药醇或其类似物可能是有价值的治疗炎症性肠病以及其他炎症条件。

数据可用性

请求的数据可用性可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢Tahir Rizvi教授,医学微生物学,帮助PPAR -γ启动子含有质粒的隔离和女士Kholoud阿拉法特为技术支持。本研究支持格兰特# 31 r242 S.B.资助年代扎耶德健康科学中心阿联酋大学。