文摘

神经性疼痛是一个公共卫生问题。尽管许多药物是用于治疗神经性疼痛,有效和安全的药物尚不存在。在这项研究中,我们测试了疼痛的反应CCI老鼠,和ELISA试验进行检查促炎细胞因子的表达。我们发现amorfrutins显著减少疼痛行为CCI老鼠和抑制促炎细胞因子(TNF的表达α、il - 6和il - 1β)和趋化因子(CCL2 / CCR2)在脊髓。然而,PPAR的并发管理γ拮抗剂,GW9662逆转amorfrutins antihyperalgesic效应引起的。结果表明,amorfrutins抑制炎症和通过激活PPAR趋化因子表达γCCI老鼠,从而缓解神经性疼痛。因此,PPARγccl2 / CCR2通路对神经性疼痛可能代表一种新的治疗选择。

1。介绍

病变引起的神经性疼痛是不适应的痛苦或疾病影响躯体感觉系统(1];其临床症状是自发的拍摄正在进行或疼痛和stimulus-evoked痛苦(2]。药物治疗的一线选择神经性疼痛;然而,当前使用的药物,如三环类抗抑郁药和serotonin-noradrenalin再摄取抑制剂疗效有限和严重的副作用3]。因此,应进一步探讨神经性疼痛的机制发展新的治疗策略。目前的研究表明,促炎细胞因子导致神经性疼痛的生成和维护4]。基于这一概念,它提供的可能性有关其他的治疗策略。

过氧物酶体proliferator-activated受体配体依赖性转录因子(PPARs)属于核激素受体总科,包含三个亚型PPARα,PPARβ/δ,PPARγ(5]。PPARγ无所不在地表达整个身体;脂肪细胞分化的调节,在脂质代谢中发挥作用和葡萄糖体内平衡。此外,越来越多的研究显示PPAR的关键角色γ在炎症基因镇压6]。PPARγ受体激动剂可以抑制促炎细胞因子的生产养殖单核细胞(7]。PPAR的天然受体激动剂γ,amorfrutins中发现甘草麻和无定形病后(8]。Amorfrutins绑定并激活PPARγ没有这些副作用合成PPAR所致γ受体激动剂(9]。

趋化因子及其受体是关键炎症介质(10]。趋化因子诱导的促炎细胞因子,调节免疫细胞的招募到炎症组织。然而,趋化因子的表达升高导致慢性炎症,在神经性疼痛中扮演重要角色11]。实验证据表明,几种趋化因子与神经性疼痛动物模型(12],CCL2 / CCR2信号得到了极大的关注。CCL2属于CC趋化因子亚科和优先结合CCR2趋化因子受体(13,14]。在神经性疼痛模型中,机械触诱发痛的发展完全废除在CCR2−−/老鼠(15]。在其他模型,CCL2和CCR2长期保持调节受伤后(16]。这些研究代表了一种有前途的治疗目标。

神经性炎症导致神经性疼痛的维护,但PPARγ可以抑制炎症基因的表达。趋化因子在神经性疼痛中发挥作用的关键炎症介质(17]。因此,本研究的目的是评估通过PPAR amorfrutins是否能减轻疼痛γ/ CCL2神经性疼痛的信号模型。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

HMC3细胞系获得Procell(武汉,中国)和修改鹰的培养基培养(MEM)补充10%胎牛血清(P / S的边后卫)和1%低于5%有限公司₂在37°C。

2.2。动物模型

慢性收缩损伤(CCI)模型建立了根据贝内特的过程描述和谢18]。老鼠与戊巴比妥麻醉。一个切口在髋骨,平行于坐骨神经。肠道神经暴露,和四个4 - 0 hromic缝线用于松散的神经结扎1毫米的间隔。虚假的操作组相同的手术切断坐骨神经的除外。没有自恋CCI老鼠。的行为表现虚假的操作组手术前是一样的。

所有男性Sprague-Dawley老鼠(200 - 300克)是来自怀安第一人民医院。老鼠被随机分为四组:(a)虚假的小组处理车辆,(b)慢性收缩损伤(CCI)大鼠治疗车,(c)慢性收缩损伤(CCI)大鼠治疗amorfrutins(60毫克/公斤),和(d)慢性收缩损伤(CCI)大鼠接受amorfrutins和GW9662(30毫克/公斤)。

2.3。行为测试

2.3.1。PWMT

爪子撤军机械阈值(PWMT)测试使用电动·冯·弗雷丝(美国IITC)。把老鼠放进不同的树脂玻璃盒子用金属网层。在测试前,老鼠改编30分钟,消除紧张。冯·弗雷丝是指着老鼠的足底表面。当老鼠爪子戒断反应,电动·冯·弗雷灯丝的价值被认为是爪子撤军阈值。每个测量应在5分钟间隔重复3次。

2.3.2。PWTL

爪子撤军热延迟(PWTL)进行使用热爪子的足底镇痛仪(美国IITC)。老鼠为超过30分钟适应环境。然后,滑动测试头,使热源与老鼠的后爪的底部。设置刺激时间在30年代,并自动记录大鼠的时间显示爪子戒断反应。每个测量之间的时间间隔超过5分钟。重复测量3次,取平均值。

2.4。ELISA

TNF的表达α,il - 1β,il - 6在脊髓检查使用传奇马克斯™鼠TNF -α酶联免疫试剂盒(Biolegend,中国),鼠il - 1β酶联免疫试剂盒(Dakewe、中国),传说马克斯™鼠il - 6酶联免疫试剂盒(Biolegend,中国)。

2.5。免疫印迹

每组大鼠在完成后立即斩首的痛苦行为测试治疗14天。取出脊髓L4 ~ 6,迅速把它放在液氮,然后转移到-80°C冰箱。

冷冻样本细胞溶解使用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲。蛋白质(30μg)被钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳分离。蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯膜后,膜与初级孵化抗体(anti-CCL2、anti-CCR2和反β肌动蛋白;1:2000;英国Abcam)和HRP-conjugated二级抗体(1:10000;Amyjet,中国)。蛋白质乐队可视化使用西方发射极耦合逻辑清晰衬底(美国Bio-Rad)。

2.6。统计分析

学生的团体之间的意义进行了分析 - - - - - -测试和单向方差分析。所有使用SPSS 22.0统计分析(美国芝加哥IBM)和GraphPad棱镜8.0.0(美国加州圣地亚哥)。

3所示。结果

3.1。通过PPAR Amorfrutins抑制CCL2 / CCR2表达式γ激活

探讨神经性疼痛的PPAR和趋化因子之间的联系,我们发现CCL2 / CCR2表达LPS-induced HMC3细胞。如图1,amorfrutins非常CCL2 / CCR2蛋白表达减少,而共同服用amorfrutins和GW9662 (PPAR的γ拮抗剂)恢复CCL2 / CCR2的表达。结果表明,amorfrutins可以抑制通过PPAR CCL2 / CCR2蛋白的表达γ激活。

3.2。Amorfrutins缓解神经性疼痛反应CCI老鼠

基于细胞实验的结果,CCI鼠模型用于检查的功能amorfrutins神经性疼痛。在CCI手术后3天,所有组与相应的药物治疗两周每天一次。在注射后1 h, PWMT测量同样的研究员(图2(一个))。CCI老鼠,机械阈值显著降低。然而,amorfrutins管理后,机械阈值增加从第三天,一周后达到最大。来验证是否通过激活PPAR amorfrutins缓解神经性疼痛γ,GW9662 coadministrated amorfrutins。如图2(一个),没有明显变化的PWMT CCI老鼠amorfrutins + GW9662处理。PTWL PWMT后执行(图2 (b))。与上面的结果一致,amorfrutins的热异常性疼痛明显缓解CCI老鼠,但GW9662逆转这种效果。结果表明,amorfrutins CCI老鼠通过激活PPAR缓解神经性疼痛γ。

3.3。老鼠Amorfrutins减少CCI的炎症

炎症已经被证明有助于维护神经性疼痛。来验证是否amorfrutins减少神经性疼痛与炎症、脊髓的促炎细胞因子包括TNF -α,il - 1β,用ELISA检测il - 6(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。结果表明,肿瘤坏死因子的水平α,il - 1β,il - 6在虚假的CCI组高于组。amorfrutin管理局明显抑制促炎细胞因子的upregulation。然而,GW9662 amorfrutins引起的逆转效果,表明通过激活PPAR amorfrutins减少炎症γ。这些发现表明amorfrutins可能通过减少炎症缓解神经性疼痛。

3.4。PPARγ激活抑制趋化因子CCL2 / CCR2表达CCI老鼠

进一步探索PPAR之间的联系γ和趋化因子在神经性疼痛,我们发现CCL2, CCR2在脊髓(图表达4)。与虚假的组相比,CCL2 / CCR2 CCI组中表达增加。在这些药物治疗的老鼠,amorfrutins显著降低CCL2 / CCR2的表达式;然而,GW9662阻止这种效果和恢复CCL2 / CCR2表达式。结果表明,amorfrutins (PPARγ受体激动剂)抑制趋化因子通过PPAR CCL2 / CCR2表达式γ激活。总之,这些数据PPAR之间建立了联系γ和CCL2神经性疼痛,这可能代表了一种新的治疗神经性疼痛。

4所示。讨论

在这个报告中,我们表明,CCI老鼠amorfrutins显著减少神经性疼痛。和炎症细胞因子和趋化因子的水平CCL2 / CCR2被降低了。此外,PPARγ拮抗剂GW9662逆转amorfrutins产生的变化。

越来越多的证据表明,PPAR在缓解神经性疼痛激活中起着作用。在动物模型中,PPAR激动剂吡格列酮,罗格列酮,palmitoylethanolamide(豌豆)和非诺贝特已经被证明能减少疼痛19]。在人类身上,内生PPARα兴奋剂豌豆显示大功效各种人类疼痛的治疗,包括糖尿病神经病变、坐骨疼痛和术后疼痛(20.,21]。小的信息可以在PPAR的使用γ在人类受体激动剂治疗神经性疼痛,部分原因是关键受体激动剂的不良副作用,thiazolidinediones噻唑烷二酮类)。然而,amorfrutins自然PPARγ受体激动剂,显示抗炎效应HFD老鼠没有不必要的副作用(9]。在这项研究中,我们发现PPAR的代表γ受体激动剂amorfrutins减弱机械痛觉过敏和热痛觉过敏CCI老鼠。PPARγ拮抗剂GW9662共同amorfrutins封锁了阿莫的作用,表明通过激活PPAR amorfrutins缓解神经性疼痛γ。这些数据表明,amorfrutins可能是一种新的药物治疗神经性疼痛。

趋化因子表达炎性细胞因子刺激下,如肿瘤坏死因子α和il - 1β。研究revelated趋化因子和痛苦之间的联系;趋化因子表达是调节在动物模型和维护好几个星期22]。此外,PPAR和趋化因子之间的联系也显示在一些研究。例如,在创伤性脑损伤模型中,服用tzd CCL2表达显著抑制了(23]。15 d-pgj2和罗格列酮抑制LPS-stimulated CCL2生产小胶质细胞(24]。在这里,我们发现,细胞因子(TNFα、il - 6和il - 1β)和趋化因子(CCL2 / CCR2)表达式CCI大鼠脊髓的增加。Amorfrutins抑制这些procytokines和趋化因子的生产,但GW9662逆转Amorfrutins的抑制作用。结果说明,PPARγ激活可以减少炎症和抑制趋化因子CCL2 / CCR2表达式。

5。结论

总的来说,我们的结果表明,PPARγ受体激动剂amorfruitins缓解神经性疼痛在CCI老鼠,至少在某种程度上,通过下调促炎细胞因子和趋化因子CCL2 / CCR2。这项研究可能表明潜在的神经性疼痛的治疗选择。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者证实不存在利益冲突。

确认

我们衷心感谢所有实验室成员。