文摘
过氧物酶体proliferator-activated受体α(PPARA)是一类常用的分子靶点治疗血脂异常和糖尿病。最近,PPARA的潜在作用在其他病理条件下,如癌症,已被认可。利用生物信息学分析,我们发现PPARA pancancers表示在相对较低的水平,和kaplan meier分析显示,高PPARA蛋白表达与结肠癌患者更好的生存。在体外实验表明,非诺贝特调控细胞周期分布,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖,通过激活PPARA上皮间充质转变。PPARA激活抑制DNMT1活动和废除methylation-mediated CDKN2A镇压。Downregulation CDKN2A cyclin-CDK复合物导致修复,导致细胞周期阻滞在G1期通过CDKN2A / RB E2F通路的调控。最后,我们证明了非诺贝特政府抑制肿瘤生长和DNMT1活动在活的有机体内。PPARA受体激动剂、非诺贝特可能作为适用代理表观遗传治疗结肠癌的病人。
1。介绍
结直肠癌(CRC)的发病率排名第三和第四的死亡率。CRC是全球最常见的癌症,每年有近900000人死亡(1,2]。虽然新的治疗方案,包括免疫疗法和新辅助化疗,明显改善患者预后,CRC的5年生存率仍然低于15% (3]。因此,调查的分子机制参与癌症启动开发新的治疗策略是必要的。
除了基因改变(即。,deletion, amplification, and translocation), epigenetic modifications play an important role in malignant progression of tumors. CpG islands (CGI) are contiguous groups of dinucleotides mainly located at the 5的基因,具有高GC含量(4]。大多数基因启动子的cgi unmethylated,允许活跃转录(5]。CGI甲基化变化是许多人类癌症的标志并导致伴随基因失活(6- - - - - -8]。DNA甲基转移酶1 (DNMT1)是一个主要的DNA甲基转移酶甲基化DNA复制过程中维护,负责和失活老鼠DNMT1的结果在早期胚胎杀伤力9]。种能阻碍DNMT3b DNMT3a和主要作为新创甲基转移酶(10]。
crc的特点是低水平的绝对基因组甲基化与正常组织相比,这一特点导致基因组不稳定性高,结果在癌症发展(11]。此外,特定基因的启动子甲基化已被确定在crc,以及甲基化与基因沉默的cgi。等几种肿瘤抑制基因的甲基化RASSF1, PTEN、和CDKN2A与异常的细胞活动,包括异常的细胞老化,扩散和死亡(12- - - - - -14]。
过氧物酶体proliferator-activatedα受体配体依赖性转录因子(PPARA)是一个属于核激素受体超科(15,16]。研究已经证明,PPARA在脂质代谢中起着至关重要的作用和炎症反应17,18]。非诺贝特是一种选择性PPARA受体激动剂,调节脂质运输和代谢,并广泛用于治疗高脂血症(19]。除了代谢的功效,但最近的研究显示PPARs[的抗肿瘤功能20.- - - - - -24]。研究也证实了非诺贝特的oncosuppressive效应在不同的人类癌症细胞系通过不同的信号通路(25- - - - - -27]。报告还显示PPARA DNMT1活动的抑制作用在小鼠模型28]。在目前的研究中,我们证明了PPARA受体激动剂,非诺贝特,抑制DNMT1-mediated CDKN2A的甲基化和发挥抗癌作用通过促进细胞凋亡,抑制细胞迁移,抑制细胞增殖通过CDKN2A / RB / E2F通路。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
结直肠癌细胞系HCT116、结肠癌细胞系SW480 Caco-2,和两个正常肠上皮细胞系NCM460 HIEC得到中国科学院委员会类型文化收集细胞银行(中国,北京)。HCT116在完整的DMEM培养(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA),和其他细胞系被维护在RPMI 1640(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)补充10%胎牛血清(沃尔瑟姆的边后卫,热费希尔科学,MA)和1% penicillin-streptomycin。
使用5抑制DNMT1活动进行μM 5-azacytidine (MedChemExpress、上海、中国),和治疗时间是24小时。的pcDNA DNMT1转染进HCT116 SW480细胞upregulation DNMT1的表达式。的pcDNA DNMT1被GenePharma合成有限公司(上海,中国)。
细胞暴露于不同浓度的非诺贝特(Topscience有限公司,上海,中国)48小时,使用相差显微镜观察和形态学变化和成像(200 x)。
2.2。细胞生存能力分析
结肠癌细胞系SW480镀和结直肠癌细胞系HCT116密度5000细胞/ 96 -孔板(100毫升μL中每口井)和三个复制。细胞与非诺贝特治疗药物浓度范围0 - 260μ24小时和48小时。细胞生存能力使用细胞计数检测设备(YEASEN、上海、中国)根据指令。
2.3。集落形成实验
细胞使胰蛋白酶化、计算和播种在6-well板每口井的700个细胞,用不同浓度的非诺贝特治疗。14天之后,可见菌落数和拍照。
2.4。伤口愈合实验
HCT116、SW480细胞种植在6-well盘子。使用200年μL吸管提示当细胞融合达到80% - -90%。抓挠后,细胞用磷酸盐,然后采用无血清培养技术。愈合率量化后的间隙尺寸测量文化使用ImageJ软件。
2.5。细胞免疫荧光
HCT116 SW480细胞被播种在6-well文化板块镀细胞爬片。与非诺贝特治疗后24 h,细胞被固定用4%多聚甲醛和permeabilized Triton x - 100年的0.1%。然后,细胞被孵化与主要(增殖细胞核抗原)钙粘蛋白、波形蛋白的抗体。染色体与DAPI counter-stained (Beyotime、上海、中国)。图像是用荧光显微镜观察。
细胞凋亡分析通过TUNEL分析使用EdUTP TUNEL细胞检测设备(Beyotime、上海、中国)根据制造商的指示。共焦显微镜下显微照片拍摄。
2.6。EDU染色
5-Ethynyl-2 - - - - - -脱氧尿苷(EdU)进行染色试验fenofibrate-treated细胞利用一个EdU免疫荧光染色工具包(Ribobio,中国)根据制造商的指示29日]。结果观察到使用一个倒置荧光显微镜(200 x)。
2.7。流式细胞术分析
HCT116和SW480细胞株服用不同剂量的非诺贝特24 h,然后沾膜联蛋白V FITC和propidium碘(PI) (BD生物科学,圣何塞,CA)。细胞凋亡是由流式细胞术分析(Cytomics FC500;贝克曼库尔特,富勒顿,CA)。
分析了细胞周期的分布阶段细胞周期检测工具(Beyotime,中国)。样本与75%乙醇固定−20°C 24 h。固定细胞接受RNaseA和沾propidium碘根据制造商的指示(30.]。流式细胞术研究的细胞周期分析。
2.8。动物实验
动物实验进行根据美国国立卫生研究院实验室动物保健和使用指南和被批准的动物保健和使用委员会上海同济大学,中国。裸体小鼠随机分为两组( ),每个老鼠皮下注射 HCT116细胞正确的腋窝。非诺贝特是悬浮在盐水和intragastrically在200毫克/公斤/鼠标一天一次。小鼠麻醉和牺牲三周后非诺贝特管理。肿瘤大小和鼠标重量在实验记录。组织是收获进行进一步分析。
异种移植组织和4%多聚甲醛固定石蜡和嵌入式,切片,苏木精和伊红染色。通过显微镜观察组织病理变化(200 x)。
2.9。DNMT1内容
测量DNMT1内容fenofibrate-treated细胞或肿瘤组织进行了使用人类或鼠标DNMT1酶联免疫试剂盒(HZBIO、上海、中国)。样本添加到每个在enzyme-labeled涂板和孵化37°C 30分钟。洗后,颜色是用发色体试剂A和B;然后,反应被终止停止解决方案。吸光度值为450 nm波长使用标(BioTek标)。
2.10。Methylation-Specific PCR
使用基因组DNA提取基因组DNA提取工具包(TIANGEN)。筛选了DNA (20μL)亚硫酸氢受到修改使用亚硫酸氢EpiTect快速转换工具包(试剂盒)。CDKN2A启动子的甲基化状态进行了分析使用methylation-specific引物(M)和nonmethylation-specific引物(U),放大产品被琼脂糖凝胶电泳分离和可视化SYBR绿色在紫外光照射下染色。引物(表S1)用于methylation-specific聚合酶链反应(MSP)一样的序列被赫尔曼et al。31日]。
2.11。生物信息学分析TCGA的人类肿瘤样本数据集的
RNA序列资料和相关的临床信息pancancer样本从癌症基因组图谱(TCGA)数据检索门户10月,2020年。RNA-seq数据规范化,每千碱基片段每百万(FPKM)使用log2规模。种能阻碍DNMT3b DNMT1的转录水平、DNMT3a PPARs, ACOX1, CDKN2A进行了分析。生存概率被kaplan meier计算方法。此外,Cox回归分析进行了计算风险比率对多种癌症类型基因的兴趣。此外,临床分期之间的关系和基因表达是评估通过“ggpubr”包R。
2.12。免疫印迹分析
总蛋白从细胞或组织中提取使用里帕溶解产物(美国表达载体)。等量的蛋白质样品(40μ每车道和80 g细胞样本μg每车道组织样本)运行在钠dodecylsulfate-polyacrylamide (SDS)凝胶,然后转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。膜被封锁与5%脱脂牛奶1 h然后孵化一夜之间在4°C主要抗体。Abcam Anti-DNMT1(1: 500年,剑桥,英国),anti-PPARA (Abcam 1: 1000年,剑桥,英国),anti-E2F1(1: 500年,细胞信号技术,丹弗斯,MA), anti-pRb(1: 500年,细胞信号技术,丹弗斯,MA), anti-CDKN2A(1: 500年,细胞信号技术,丹弗斯,MA), anti-CyclinD1(1: 1000年,细胞信号技术,丹弗斯,MA), anti-CDK4(1: 1000年,细胞信号技术,丹弗斯,MA), anti-CDK6(1: 1000年,细胞信号技术,丹弗斯,MA),和anti-RB(1: 200年,圣克鲁斯生物技术,CA)抗体被用于实验。然后,PVDF膜与相应的二次孵化抗体室温1 h。初级和二级抗体WB使用的稀释剂,在这个实验中(YEASEN、上海、中国)。信号检测使用《奥德赛》双色红外激光成像系统(Li-Cor、林肯、NE)。
2.13。定量实时聚合酶链反应分析
细胞或组织的总RNA提取使用试剂盒的试剂根据制造商的指示。大约500 ng的提取RNA被用来合成cDNA使用逆转录工具包(豆类生物技术,大连,中国)。定量PCR在应用生物系统公司7500进行实时PCR系统使用50 ng cDNA和SYBR绿色PCR反应混合液(YEASEN、上海、中国)。基于2相对基因表达进行了计算△△CT算法。所有的引物设计使用跨外显子的原则来避免基因组DNA污染。引物序列用于这个研究提供了表S2。
2.14。统计分析
群学生的比较分析 - - - - - -测试;多组比较分析了通过单向方差分析。斯皮尔曼相关分析的相关性进行评估表达式。kaplan meier分析进行了分析总体存活率。使用Cox多变量分析进行了多元回归分析模型。值< 0.05被认为是具有统计学意义。用SPSS 17.0软件进行统计分析(IBM)。
3所示。结果
3.1。基因表达模式分析PPARA和DNA甲基转移酶在人类结肠癌
首先,我们执行pancancer分析识别PPARs的平均表达水平在不同类型的肿瘤。结果表明,PPARA低表达于肿瘤的组织,如图1(一)。随后,Cox比例风险回归分析用于评估PPARs在各种肿瘤预后标记。基因与危害 病人有显著相关性的结果。森林图在图1 (b)表明在大多数癌症类型、PPARs包括PPARA,可能作为消化道癌症的预后指标。随后,我们专注于PPARA表达的临床意义。PPARA在结肠癌和表达下调与TNM阶段TCGA COAD数据集(图1 (c))。此外,评估后PPARA蛋白质水平,患者的预后PPARA高或低PPARA表达式显示更高的表达表现出更好的预后(图1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
最近的报告表明,肿瘤抑制基因的DNA甲基化导致癌症恶化。在目前的研究中,意味着DNA甲基转移酶的表达水平DNMT1 DNMT3a和蛋白质精氨酸甲基转移酶,PRMT6,评估在pancancers使用生物信息学分析。高水平的几个甲基转移酶被观察到在不同肿瘤组织(图1(一))。森林图表示DNMT1在大多数癌症的预后价值,与一个 (图1 (b))。此外,结肠癌细胞株高内生甲基转移酶的表达和低的内源性表达PPARA相对于正常NCM460 HIEC细胞进一步选择在体外化验(图1 (e))。
3.2。非诺贝特PPARA受体激动剂,减毒细胞生存和增殖
PPAR激动剂的影响对结肠癌细胞增殖评估治疗5000个细胞与不同浓度的非诺贝特(0 - 300μmol / L) 24和48 h。细胞生存的决心使用CCK8工具包。如图2(一个)对细胞增殖的抑制作用,非诺贝特对HCT116细胞的IC50范围180 - 200μmol / L(24小时),100 - 120μmol / L(48小时);非诺贝特也施加一个抑制SW480细胞对细胞增殖的影响,以IC50范围160 - 180μmol / L(24小时),80 - 100μmol / L(48小时)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
我们选择合适浓度的非诺贝特(180年和200年μmol / L HCT116细胞和160年和180年μmol / L SW480细胞)的后续治疗。与非诺贝特孵化后24 h,细胞与EDU(绿色)和DAPI染色(蓝色)。非诺贝特治疗与绿色荧光细胞的比例降低剂量依赖性的方式( )(图2 (b))。为了进一步证明非诺贝特对细胞生长的抑制作用,采用集落形成试验。治疗HCT116不同剂量的非诺贝特和SW480细胞克隆数量减少,特别是在高剂量组(图2 (c))。PCNA的表达水平,有丝分裂发生的内生标记,发现低剂量、高剂量,vehicle-treated组使用中存在和免疫荧光染色。降低PCNA mRNA水平和蛋白水平对非诺贝特治疗建议抑制细胞增殖的调控非诺贝特(数字2 (d)和2 (e))。
3.3。PPAR激动剂,非诺贝特,促进细胞凋亡在体外
调查是否PPARA激活促进细胞凋亡在体外有或没有,结肠癌细胞非诺贝特治疗通过流式细胞术进行评估。数据表明,非诺贝特细胞凋亡增加,尤其是晚期凋亡率(图3(一个))。随后,我们证实了非诺贝特的proapoptotic影响使用TUNEL染色,检测凋亡细胞DNA断裂。图3 (b)表明非诺贝特政府积极染色细胞的数量增加(绿色荧光)。此外,细胞形状的变化与非诺贝特孵化后使用光学显微镜检查。脱落细胞的数量增加,伴随着形态变形和皱巴巴的表象。这种形态的变化观察时间和剂量依赖性的方式(图3 (c))。伯灵顿的表达水平,一个典型的apoptosis-related蛋白促进细胞凋亡增加了非诺贝特治疗,而prosurvival bcl - 2蛋白降低免疫印迹(图如图所示3 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。非诺贝特的PPAR激动剂,抑制细胞迁移和上皮间充质转变
细胞迁移是衡量使用fenofibrate-treated中的伤口愈合实验细胞。抓治疗试验的数据在图所示4(一)。非诺贝特显著降低CRC细胞的迁移能力,表现出延迟关闭的划痕。接下来,我们检查是否存在专制PPARA激活对上皮间充质转变的影响(EMT)。几个EMT EMT的生物标志物的表达进行了测试使用中存在(图4 (b))。波形蛋白和MMP9的mRNA水平fenofibrate-treated组减少,而钙粘蛋白水平调节。为了进一步证实这项发现,表情的变化EMT-associated标记由非诺贝特使用免疫荧光检测,并观察到类似的结果(图4 (c))。综上所述,PPARA激活能发挥抑制细胞迁移和EMT的抗肿瘤效应。
(一)
(b)
(c)
3.5。PPAR激动剂、非诺贝特、增强肿瘤抑制基因表达和压抑DNMT1的内容
罗等人的研究。28]证实PPARA导致的损失几个甲基转移酶的异常表达,促进了CRC发展在一个小鼠模型。因此,我们假设PPARA受体激动剂,非诺贝特,可以减少DNMT1的内容和救援methylation-silenced肿瘤抑制基因的表达。首先,我们发现使用中存在DNMT1 mRNA水平下降当PPARA激活后非诺贝特治疗(图5(一个))。
(一)
(b)
(c)
接下来,多种肿瘤抑制基因的表达决心(图5 (b))。记录,沉默基因的表达与启动子甲基化。研究表明,p21 p27、CDKN2A种和RASSF1A基因被激活在两个非诺贝特治疗后癌症细胞系。我们进一步发现,上游的表达DNMT1的监管者,Oct4, Nanog, Sox9 fenofibrate-treated细胞减少,与具备干细胞有关。此外,我们测量了DNMT1结肠癌细胞,发现酶含量显著减少酶浓度高剂量治疗非诺贝特(图5 (c))。
3.6。非诺贝特恢复DNMT1的差别CDKN2A通过对这些基因的表达
确定非诺贝特治疗的机制的脱甲基CDKN2A启动子,MSP进行评估CDKN2A启动子的甲基化状态。在图中6(一)M和U称为甲基化和unmethylated等位基因的PCR产物,分别。分析表明,fenofibrate-free组,观察甲基化产品,而没有带fenofibrate-treated组中观察到。因此,我们推断,启动子的甲基化状态是被非诺贝特治疗(图6(一))。
(一)
(b)
(c)
5-Azacytidine DNMT1的有效抑制剂。调查的影响的超表达或基因数DNMT1 CDKN2A,结肠癌细胞治疗5-azacytidine, DNMT1超表达质粒,和非诺贝特。结果表明,DNMT1基因数导致CDKN2A信使rna和蛋白质含量增加,而DNMT1过度导致减少CDKN2A水平(数字6 (b)和6 (c))。CDKN2A诱导的表达变化5-azacytidine可以增强非诺贝特治疗。此外,非诺贝特能扭转引起的低表达的CDKN2A DNMT1超表达质粒。总的来说,这些发现表明,PPARA受体激动剂,非诺贝特,上调CDKN2A通过抑制基因的表达由DNMT1甲基化。
3.7。非诺贝特通过CDKN2A调节细胞周期/ RB1 / E2F1通路
DNMT1负责维护细胞的DNA甲基化在每一轮循环。CDKN2A CDK抑制剂,作为负调节细胞周期的过程。在当前的研究中,非诺贝特政府镇压DNMT1的表达和减轻CDKN2A DNMT1-mediated沉默。因此,我们研究了非诺贝特的分子机制调节细胞周期分布。PI染色进行控制和药物治疗细胞,和细胞周期分析的结果在图所示7(一)。非诺贝特治疗抑制G1→年代过渡,诱导G0 / G1期细胞逮捕,进入S期和阻塞。活动以来的细胞周期蛋白D /到/ CDK6复杂的G1 / S过渡至关重要和CDK抑制剂,可以抑制我们检测到的变化表达cyclinD1、非诺贝特治疗后到,CDK6细胞。免疫印迹和存在分析的结果表明,非诺贝特CDKN2A诱导激活,导致低表达水平的CDKs(数字7 (b)和7 (c))。在G1期,激活cyclin-CDK E2F1的水平调节的复杂和被释放从RB / E2F叠连群异常生长刺激的反应。
(一)
(b)
(c)
为了进一步验证我们的发现,关键因素的表达参与了RB / E2F信号通路被检查。总RB的表达调节,而水平的磷酸化RB和E2F1非诺贝特治疗后减少。这些结果表明,非诺贝特治疗减少了蛋白质和转录水平的复审委员会和E2F CDKN2A cyclin-CDKs的差别通过对这些基因的激活。
3.8。非诺贝特的PPAR激动剂,抑制肿瘤的生长在动物模型
我们建立了一个动物模型HCT116 cell-bearing裸体小鼠。当肿瘤组织达到平均体积为1毫米3,老鼠被随机分为两组。小鼠治疗组接受200毫克/公斤非诺贝特200年暂停μL每天填喂法盐水。对照组与同等体积的生理盐水填喂法。所有轴承肿瘤小鼠在实验中幸存下来。肿瘤大小是小得多的药物治疗组相比,癌症组。
每个老鼠的体重记录每周两次,和数据在图所示8(一个)。肿瘤异种移植是切割并且沾)观察病理变化。幻灯片从fenofibrate-treated组织坏死病变(图8 (b))。DMNT1内容组织匀浆由ELISA试验测定。非诺贝特治疗后,组织DNMT1酶水平的治疗组低于汽车集团(图8 (c))。此外,非诺贝特显著下调DNMT1的信使rna和蛋白质水平和到增加PPARA和CDKN2A(数字的表达水平8 (d)和8 (e))。综上所述,PPARA激活抑制肿瘤在活的有机体内通过上调CDKN2A的表达。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
4所示。讨论
PPARA在肿瘤发生和发展中的作用仍存在争议。几项研究已经阐明的抗肿瘤效应PPARA在各种癌症,包括乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌(32- - - - - -34]。一些研究得出相互矛盾的结论,表明PPARA受体激动剂可能会导致hepatocarcinogenesis长期管理;然而,具体机制尚不清楚35]。在目前的研究中,我们分析了PPARs的表达水平在pancancers并指出PPARA表达在低水平在几种类型的肿瘤,包括结肠癌。结肠癌样本PPARA蛋白高表达被观察到有更好的预后比PPARA较低水平。这些结果表明PPARA可能作为肿瘤抑制基因在结肠癌。最近,据报道PPARA-specific受体激动剂具有抗癌作用的各种肿瘤。非诺贝特PPARA活化剂,属于fibrate类的药物。越来越多的研究显示其潜在作用作为抗肿瘤剂影响多个生物学途径(36- - - - - -39]。
DNMT1负责维护全球甲基化和异常的CGI甲基化在人类癌症细胞,而种能阻碍DNMT3b DNMT3a和被认为作为维护和新创甲基转移酶。DNMT1的升高表现一直在报道结肠腺癌,肝癌,肺癌40- - - - - -42]。
基因启动子区域的甲基化导致转录镇压。谢霆锋et al。4)表明,肿瘤抑制基因的启动子甲基化促进了结肠癌的致癌作用。在这项研究中,我们观察到非诺贝特治疗增加PPARA表达和减少DNMT1活动,伴随着一系列的高表达的肿瘤抑制基因,包括RASSF1A基因,一种p21和p27。CDKN2A信使rna和蛋白质水平调节HCT116和SW480 fenofibrate-treated细胞相比,控制。确认假设非诺贝特废除CDKN2A的甲基化,我们使用methylation-specific PCR检测启动子的甲基化状态。在使用methylation-specific引物反应,没有乐队的观察甲基化CDKN2A fenofibrate-treated组。此外,DNMT1的表达水平和CDKN2A测量在结肠癌细胞DNMT1抑制剂治疗后,5-azacytidine, DNMT1超表达质粒。结果表明,非诺贝特功能抑制因子,类似于一种甲基转移酶抑制剂。
有一些报告表明PPARA目标激活抑制细胞增殖的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,CDKN2A [43,44]。在目前的研究中,我们发现在G1期细胞与非诺贝特治疗被捕,G2 / M细胞的数量也减少了。此外,非诺贝特CDKN2A抑制DNMT1表达水平的升高,降低了激活的细胞周期蛋白D1 / CDK复合体,和磷酸化RB。细胞周期蛋白D1 / CDK复合物细胞cycle-related分子促进G1 / S过渡(45]。在静止的细胞,hypophosphorylated RB蛋白与E2F并抑制其转录活动。增长的刺激或癌变状态下,cyclin-CDK复合物诱导RB磷酸化激活。磷酸化RB然后释放E2F转录因子,它触发的过渡细胞周期G1期的S期,从而,使不受控制的细胞增殖(46]。总之,RB / E2F通路参与CDKN2A fenofibrate-mediated表观遗传变化,导致细胞周期分布的变化。
一些研究表明,DNMT1合作直接与E2F1和HDAC加速异常甲基化在肿瘤(47]。公布的自由E2F1磷酸化RB并结合其同源网站DNMT1启动子区域,发挥了积极作用在DNMT1表达在细胞周期过程中(48]。DNMT1的表达升高诱导DNA甲基化的几种肿瘤抑制基因,包括CDKN2A。然而,冲突的结果出现了关于DNMT1和E2F1之间的关系。在间充质干细胞的表达E2F1与DNMT1并不相关。完整的细胞周期阻滞,血清饥饿并不影响DNMT1的表达,而表达E2F1下降(49]。上述结果显示,DNMT1可能不是一个响应E2F1在细胞周期阻滞的目标。
在目前的研究中,我们发现非诺贝特可能以类似的方式作为甲基化转移酶抑制剂。它减少DNMT1活动和E2F1表达式。背后的机械细节PPAR激动剂在DNMT1抑制尚未确定。导致减少差别DNMT1是否对这些免费E2F1需要进一步调查。
此外,我们表明,非诺贝特抑制肿瘤恶化通过调节细胞凋亡和迁移。流式细胞仪分析和TUNEL化验的结果表明,非诺贝特引起晚期凋亡的增加存在剂量依赖的相关性。然而,这些发现的潜在机制并不是决定在我们的研究中。
细胞可塑性由EMT监管电路提高肿瘤细胞的侵袭性特性(50]。钙粘蛋白的转录镇压是经常在恶性肿瘤细胞中观察到。一些研究已经证实DNMT1引起的抑制钙粘蛋白通过其启动子区域的甲基化51]。我们发现,非诺贝特治疗后钙粘蛋白表达增加在体外;然而,upregulation是否与减少DNMT1活动和启动子脱甲基作用需要进一步调查。
最后,我们进行了肿瘤异种移植实验使用HCT116细胞研究非诺贝特的抗肿瘤功效在活的有机体内。非诺贝特减少肿瘤体积明显比vehicle-treated老鼠。坏死区被确定在H&E-stained样本fenofibrate-treated老鼠。DNMT1的表达,到,CDKN2A是有效地减少非诺贝特治疗与控制细胞。这些结果表明,非诺贝特可以切除肿瘤,延缓肿瘤的生长。
这些发现,再加上DNA甲基化的可逆性,支持的可能性非诺贝特作为一个潜在的表观遗传治疗结肠癌患者。
5。结论
总之,目前的工作说明激活PPARA非诺贝特政府防止结肠癌进展通过表观遗传修饰。非诺贝特削弱DNMT1活动和恢复肿瘤抑制基因的表达,CDKN2A,抑制细胞增殖通过阻断G1年代过渡通过RB / E2F通路。此外,非诺贝特抑制癌症细胞通过调节EMT入侵。因此,我们得出这样的结论:非诺贝特可以作为辅助剂在结肠癌治疗。
缩写
| ACC: | 肾上腺皮质癌 |
| BLCA: | 膀胱移行细胞癌 |
| BRCA: | 乳腺浸润性癌 |
| 塞斯克: | 宫颈鳞状细胞癌和子宫腺癌 |
| 胆固醇: | 胆管癌 |
| COAD: | 结肠腺癌 |
| DLBC: | 淋巴肿瘤弥漫型大b细胞淋巴瘤 |
| 光电子能谱: | 食管癌癌 |
| “绿带运动”: | 多形性成胶质细胞瘤 |
| HNSC: | 头颈部鳞状细胞癌 |
| KICH: | 肾脏chromophobe |
| KIRC: | 肾脏肾透明细胞癌 |
| KIRP: | 肾脏肾乳头状细胞癌 |
| AML: | 急性髓系白血病 |
| LGG: | 大脑神经胶质瘤低品位 |
| LIHC: | 肝脏肝细胞癌 |
| LUAD: | 肺腺癌 |
| LUSC: | 肺鳞状细胞癌 |
| 内消旋: | 间皮瘤 |
| 机汇: | 卵巢浆液性囊腺癌 |
| PAAD: | 胰腺腺癌 |
| PCPG: | 嗜铬细胞瘤和副神经节瘤 |
| 马: | 前列腺腺癌 |
| 读: | 直肠腺癌 |
| 不仅: | 肉瘤 |
| SKCM: | 皮肤皮肤黑色素瘤 |
| STAD: | 胃腺癌 |
| TGCT: | 睾丸生殖细胞肿瘤 |
| THCA: | 甲状腺癌 |
| THYM: | 胸腺瘤 |
| UCEC: | 子宫语料库子宫内膜癌 |
| UCS: | 子宫癌肉瘤 |
| UVM: | 葡萄膜黑色素瘤 |
| FPKM: | 每千碱基片段每百万 |
| TCGA: | 癌症基因组图谱 |
| CGI: | CpG岛 |
| 儿童权利公约: | 结肠直肠癌 |
| PPARA: | 过氧物酶体proliferator-activated受体α |
| DNMT1: | DNA甲基转移酶1 |
| RB: | 视网膜母细胞瘤 |
| EMT: | 上皮间充质转变 |
| 人力资源: | 风险比 |
| 存在: | 定量逆转录聚合酶链反应 |
| MSP: | Methylation-specific PCR |
| EdU: | 5-Ethynyl-2 - - - - - -脱氧尿苷 |
| PI: | Propidium碘化 |
| SDS: | 钠dodecylsulfate-polyacrylamide。 |
数据可用性
TCGA基因表达数据和临床数据取自TCGA数据门户(https://portal.gdc.cancer.gov)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
瑞香港提供这项工作的主要贡献。
确认
本研究得到国家自然科学基金委的支持中国(81300340,81471537)。
补充材料
表S1:存在试验中使用的引物列表。表S2: methylation-specific PCR试验中使用的引物列表。(补充材料)