羟氯喹强化PPAR诱导细胞凋亡α对手在786 - o透明细胞肾细胞癌的细胞与抑制自噬相关

文摘

透明细胞肾细胞癌(ccRCC)是肾细胞癌的主要病理模式。ccRCC细胞表现出一定程度的固有耐药性由于一些基因突变。近年来,过氧物酶体proliferator-activated受体-α(PPARα)拮抗剂已报告作为靶向治疗药物能够诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞ccRCC细胞系。压力引起的自噬,在真核细胞中,在扩散中起着复杂的作用,生存和肿瘤细胞的死亡。在我们的研究中,我们发现PPAR的表达α很低在高度分化ccRCC 786 - o组织和细胞系但高分化不良ccRCC组织。PPAR的水平α表达ccRCC组织相关的等级分化,但不要ccRCC患者的性别或年龄。研究结果还显示,PPARα拮抗剂GW6471可以降低细胞的生存能力和诱导自噬在786 - o ccRCC细胞系。这种自噬可以抑制羟氯喹。当处理羟氯喹和GW6471, 786 - o细胞的生存能力下降进一步相比仅GW6471或羟氯喹治疗,和细胞凋亡被提拔。与此同时,当人类肾2细胞cotreated羟氯喹和GW6471细胞生存能力只有轻微的影响。因此,我们的发现表明,GW6471和羟氯喹可能构成小说和ccRCC可能有效的治疗。此外,这种方法可能是由于其对正常肾组织影响很小。

1。介绍

肾细胞癌是一种恶性肿瘤来源于正常肾小管上皮细胞、透明细胞肾细胞癌(ccRCC)是其主要病理模式(1]。根据流行病学调查,肾细胞癌的发病率在各种泌尿系统肿瘤中排名第二(2]。转移发生在大约1/3^{理查德·道金斯}最初被诊断为肾细胞癌的患者(3]。由于基因突变的存在,肾细胞癌可以抵制传统的化疗药物和放疗(4]。Antiangiogenetic酪氨酸激酶抑制剂,如舒尼替和索拉非尼,开发并应用于临床研究(5,6]。不幸的是,这些药物肾细胞癌的抗据报道近年来(7,8]。因此,有必要开发新型靶向药物肾细胞癌。

过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR)是一种类固醇激素受体超家族的成员,包括三个主要的亚型,即PPARα,PPARβ/δ,PPARγ(9]。PPARα异质二聚体类维生素a X受体(RXR)可以绑定过氧物酶体扩散者响应要素(PPRE)和调节多个基因的表达与脂质,葡萄糖,氨基酸代谢,以及炎症反应(10]。多年来,研究人员发现,PPARα可能是一个潜在的目标管理白血病,恶性胶质瘤黑色素瘤、乳腺癌,结肠癌,和(11- - - - - -15]。关于ccRCC, PPAR自我等人报道αGW6471,对手可以诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞16]。PPARα可能是治疗肾细胞癌的潜在目标。

自噬是一种机制,细胞器和大分子蛋白质“包装”成自噬小体。小分子生成在溶酶体分解细胞器和大分子的回收的真核细胞(17]。Autophagy-related基因(atg)代码的大部分autophagy-associated蛋白质的初始化自噬,自噬小体的形成。自噬流量是一个积分自噬的过程(18]。自噬可以调节扩散的基础水平,增长,分化来实现细胞内稳态(19,20.]。等压力,当细胞在细胞周期阻滞,能源缺乏,和生长抑制自噬的水平是增强以便适应修改后的条件,避免死亡或其他不良结果(21,22]。自噬在肿瘤细胞生长和死亡的作用尚不清楚,但一些研究人员相信,它有一个保护作用通过增强细胞凋亡或诱导自噬细胞死亡,这对“双剑效应”在肿瘤细胞的命运23]。

目前尚不清楚GW6471可以诱导自噬;除此之外,其影响ccRCC细胞的命运仍然是未知的。因此,在这项研究中,我们试图找到是否可以诱导自噬在786 - o ccRCC GW6471细胞系。此外,我们试图确定的角色GW6471 786 - o细胞。我们发现PPAR的表达α很低在高度分化ccRCC 786 - o组织和细胞,但在低分化ccRCC组织。随后,我们提出了证据表明GW6471可以减少786 - o细胞的生存能力和诱导自噬积分。当786 - o细胞cotreated GW6471和羟氯喹,这是一个自噬抑制剂,生存能力远远低于GW6471或羟氯喹单独处理时,和细胞凋亡被提拔。此外,当人类肾2 (HK-2)细胞cotreated GW6471和羟氯喹对细胞生存能力没有显著影响。因此,羟氯喹和GW6471可以作为一本小说和潜在的战略管理ccRCC有益。此外,这种方法可能是安全的,因为它只有在正常肾组织的影响最小。

2。材料和方法

2.1。细胞系和文化

786 - o ccRCC细胞系和HK-2人类正常肾小管上皮细胞系细胞库的获得中国科学院。这两个细胞系在罗斯威尔公园纪念研究所- 1640培养基培养(美国Gibco)补充10%胎牛血清(美国Gibco)和1% penicillin-streptomycin(美国Gibco) 37°C孵化器有限公司(美国热)5%₂和饱和湿度。

2.2。药物

的PPARα拮抗剂GW6471和受体激动剂WY14643从多国评价购买(美国),羟氯喹是来自Dulai生物(中国)。

2.3。免疫组织化学染色(包含IHC)

ccRCC组织和邻近的正常组织收集40例病理部门的东吴大学第三附属医院,和所有组织被员工及时嵌入石蜡。随后,所有样本deparaffinized二甲苯和水分梯度乙醇(100%、95%和90%)。组织被加热在乙二胺四乙酸(EDTA)抗原检索和水洗三次磷酸盐(PBS),每个洗3分钟。之后,免疫组织化学染色工具包(箴言,中国)申请与兔子反PPAR包含IHC染色α主要多克隆抗体(美国普鲁泰克,稀释1:100)根据制造商的指示。组织脱水在另一个梯度乙醇(85%、95%和100%)。细胞核被苏木精染成。所有组织都覆盖着使用荧光显微镜载玻片,然后观察光学显微镜在光学模式(日本奥林巴斯IX77)。光密度的semivalue (OD)包含IHC测量使用软件ImageJ(美国)。ccRCC组织的分化等级是由两名有经验的独立分析病理部门的员工。病人的年龄和性别特征是列在表中1。的收集和使用的组织是第三附属医院伦理委员会批准的东吴大学。

2.4。RNA提取和定量实时聚合酶链反应(存在)

786 - o和HK-2细胞总RNA提取使用总RNA-pure工具包(前基因,中国)和溶解在RNase-free ddH₂O(前基因,中国)按照制造商的指示。接下来,RNA样本用于生成cDNA使用RT容易™我工具包(前基因,中国)。最后,cDNA样本用于与实时PCR中存在容易™工具(前基因,中国)。放大了使用ABI7500(美国应用生物系统公司)。PPAR的引物α由豆类和GAPDH是合成生物技术(豆类,中国),和序列表中列出2。GAPDH应用作为内部控制,和PPAR的相对表达水平α计算了2^{- - - - - -ΔΔCT}方法(24]。表中给出了详细的程序中存在3。

2.5。细胞生存能力分析

786 - o和HK-2细胞被播种( )96 -孔板和孵化的依从性。他们用不同组的药物治疗第二天6、12、24、48小时。然后,10μL细胞计数Kit-8 (CCK-8)试剂(Phygene,中国)被添加到每个。孵化后2小时,吸光度( )每个在450纳米测量的标仪(美国热)。可行的细胞的百分比计算使用下面的公式:

2.6。吖啶橙染色

786 - o细胞被播种( )在24-well板块与不同组的依从性和治疗药物24小时。染色之前,每个与PBS洗15分钟,三次,这些细胞被固定使用4% poly-formalin 10分钟。染料吖啶橙(AO)(中国Solarbio稀释至10μ染色之前g / mL)被添加到每个。15分钟后,每个与PBS再次洗15分钟,三次。所有的井都使用荧光光学显微镜观察到的荧光模式。AO的细胞核被染成绿色和橙色的溶酶体的荧光是(25]。

2.6.1。流式细胞仪细胞凋亡测定

收集786 - o细胞治疗后,用PBS洗两次。细胞凋亡测定使用膜联蛋白V-FITC / Propidium碘(PI)双荧光染料工具包(Phygene,中国)按照制造商的指示。凋亡细胞的比例计算使用流式细胞仪CantoII流式细胞仪(美国BD)。四个“盖茨”除以一个十字架在流式细胞仪的图像:幸存细胞位于左下角(膜联蛋白V(-)和π(-));早期凋亡细胞位于右下(π膜联蛋白V(+)和(-));晚期凋亡细胞位于右上角[膜联蛋白V(+)和π(+));坏死细胞位于左上角(膜联蛋白V(-)和π(+))。

2.7。西方墨点法

收集到的786 - o细胞与药物治疗24小时与PBS洗两次。细胞溶菌作用决定使用在冰上裂解缓冲工具包(注册机,中国)根据制造商的指示。所有样品都是离心机在4°C和12000克/分钟5分钟。使用蛋白质定量测定蛋白质浓度估计工具包(注册机,中国)的指令。 缓冲区被添加到所有的蛋白质样品和加热到100°C 5分钟。分离的蛋白质在8%、10%或15%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳。后,蛋白质在凝胶被转移到聚乙二烯二氟化物膜(美国微孔),和5%脱脂牛奶的膜被封锁溶解在Tris-buffered盐水(TBST) 1小时。阻塞完成时,膜与稀释孵化兔反主要抗体TBST一夜之间(ABclonal,中国,每个抗体的稀释:PPARα:1:2000年,LC3: 1: 1000 p62 / Sequestosome-1: 1: 1000年,PARP: 1: 1000年,Caspase-3: 1: 1000 GAPDH: 1: 4000)。第二天,膜被TBST洗15分钟,三次,和孵化山羊anti-rabbit辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体(ABclonal、中国、稀释1:8000使用TBST) 1小时。与二级抗体孵化后,膜清洗与TBST 10分钟,三次。最后,使用增强化学发光的蛋白质信号检测+试剂由蛋白质(美国微孔)和可视化成像系统(Tanon,中国)。光学密度的semivalue西方墨点法测定ImageJ使用软件。

2.8。统计分析和图像捕获

每个独立实验至少进行三次。所有数据提出了价值 。价值的数据进行分析,图是使用软件棱镜6(美国)。所有比较价值的数据进行了分析使用未配对的学生的 - - - - - -测试中,单向方差分析分析费舍尔至少显著差异(LSD)测试,和卡方检验方差的研究。所有包含IHC和荧光图像被软件Image-Pro-Insight(美国)。 被认为是一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。PPARα不善表达的高度分化ccRCC 786 - o组织和细胞系但低分化ccRCC组织中高度表达的吗

在本研究的第一部分,PPAR的表达α调查在786 - o ccRCC组织和细胞系。图中所描绘的一样1(一)和1 (b)执行,包含IHC检测PPAR的表达α在ccRCC组织。结果表明,PPAR的表达α较低的高度分化ccRCC组织比邻近的正常组织。然而,PPARα低分化ccRCC组织中高度表达,这是类似于邻近的正常组织。在786 - o细胞系,如图1 (c)- - - - - -1 (e)我们观察到,PPAR的表达式α信使rna和蛋白质低HK-2细胞相比,推断从存在和免疫印迹。另一方面,我们研究了PPAR的相关性α表达ccRCC组织在一些临床因素,包括性别、年龄、年级的区别。在表4,PPAR的表达α在ccRCC组织相关等级的分化,而不是性别或年龄的病人。

3.2。GW6471下降786 - o细胞的生存能力但不依赖于时间的方式,存在剂量依赖的相关性和GW6471没有影响细胞的生存能力对HK-2细胞存在剂量依赖的相关性或时间

接下来,我们进行了CCK-8试验检测的变化生存能力786 - o细胞和HK-2细胞GW6471对待。如图2(一个)细胞的生存能力786 - o处理GW6471减少剂量依赖性(0 - 75μ米)的方式。此外,它是指出,WY14643没有显著影响786 - o细胞的生存能力在任何的测试浓度(0 - 75μ然而,米)。图2 (b)表明,当786 - o细胞治疗25μM GW6471 12小时,没有显著差异在细胞生存能力相比,6 h组的细胞。另一方面,当786 - o细胞治疗25μM GW6471 24小时,细胞生存能力降低相比,6 h和12 h组。然而,786 - o细胞治疗的可行性GW6471 48小时相比没有明显不同与治疗24小时。最后,如图2 (c),没有显著影响可行性HK-2细胞接受GW6471或WY14643任何测试浓度(0 - 75μ米);图2 (d)表明,当HK-2细胞治疗25μM GW6471或者WY14643 6、12、24、48小时,也有对细胞生存能力无显著影响。这些结果表明,GW6471可以减少786 - o细胞的生存能力但不依赖于时间的方式,存在剂量依赖的相关性和GW6471 HK-2细胞对细胞生存能力没有影响存在剂量依赖的相关性或时间。

3.3。GW6471诱导细胞自噬在786 - o积分

GW6471可以减少细胞生存能力和诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡在786 - o细胞;因此,我们调查是否GW6471可以诱导细胞自噬在786 - o (16]。基于现有引用其他人类肿瘤接受GW6471和我们自己的初步实验,我们选择25μM GW6471 WY14643和50μM细胞羟氯喹治疗持续时间的24小时的实验研究[26]。羟氯喹(或氯喹,应用在一些研究自噬)是一种自噬拦截器,可以抑制自噬体与溶酶体的融合27]。我们首先利用AO染色溶酶体,如图3(一个)和3 (b)的荧光信号,发现每个细胞的溶酶体规范化的光明GW6471比未经治疗的治疗组和WY14643治疗组。在GW6471和羟氯喹治疗组,荧光信号远比,仅在GW6471或羟氯喹治疗组。如数据所示3 (c)和3 (d)LC3-II / LC3-I的比率,这是一种自噬诱导的标志和免疫印迹分析,提高GW6471组与未经处理的相比,WY14643组。GW6471与羟氯喹组LC3-II / LC3-I最高的比率在所有实验小组。p62 (sequestosome-1 SQSTM-1),一种蛋白质可以用来监测自噬流量,减少被发现仅在GW6471组但GW6471增加羟氯喹组,如图3 (e)和3 (f)(27]。AO染色和免疫印迹结果表明GW6471诱导细胞自噬在786 - o积分。

3.4。在Cotreatment GW6471和羟氯喹,786 - o细胞的细胞生存能力进一步下降

自噬可以影响肿瘤细胞的命运;因此,我们研究了抑制自噬是否可以改变786 - o细胞治疗的可行性GW6471随后。提出了图4,cotreatment GW6471和羟氯喹24小时下降786 - o细胞的生存能力比治疗更深刻GW6471,独自羟氯喹,WY14643羟氯喹。

3.5。羟氯喹和GW6471 Cotreatment,凋亡细胞的比例在786年被提拔,o细胞

786 - o细胞治疗的可行性GW6471和羟氯喹是低于细胞治疗GW6471或独自羟氯喹。我们研究了786 - o细胞死亡的机制处理的组合GW6471和羟氯喹。流式细胞仪进行,如图5(一个)和5 (b)GW6471组中,凋亡细胞的比例高于未经处理和WY14643有或没有羟氯喹组。当786 - o细胞cotreated GW6471和羟氯喹,凋亡细胞的比例高于细胞治疗GW6471孤单。随后,我们进行免疫印迹检测cleaved-PARP和裂解caspase-3,这两个标记的细胞凋亡。从数据推断出5 (c)- - - - - -5 (e)裂解PARP的表达式和裂解caspase-3 GW6471,羟氯喹,和WY14643羟氯喹组高于未经处理和WY14643组。当786 - o细胞co-treated GW6471和羟氯喹,裂解PARP的表达式和裂解caspase-3在所有实验中最高的群体。结果显示在图5表明,羟氯喹强细胞凋亡在786 - o GW6471对待。

3.6。Cotreatment GW6471和羟氯喹,HK-2细胞显示对细胞生存能力无显著影响

我们终于探索GW6471结合羟氯喹能否影响HK-2细胞的可行性。显示在图6,当HK-2细胞治疗药物的24小时内,没有明显影响细胞生存能力的实验小组,包括与羟氯喹GW6471集团。此结果表明cotreatment GW6471和羟氯喹可能不会对HK-2细胞有明显的细胞毒性的影响。

4所示。讨论

PPARα作为转录因子可以调节营养代谢。在肝细胞,PPARα高度表达,可以调节肉碱palmitoyltransferase 1和中链acyl-coenzyme脱氢酶,从而增强脂肪酸β氧化(28]。在葡萄糖的新陈代谢,PPARα异质二聚体与RXR可以绑定到基因编码phosphofructokinase-1 (PFK-1)和丙酮酸激酶(PK)启动子序列,因此,调节这两个酶的表达(29日]。此外,在PPARα^{- / -}老鼠,精氨酸积累在等离子体和一氧化氮(NO)水平降低(30.),这意味着PPARα可能会影响氨基酸代谢。PPAR的表达α在ccRCC细胞研究过去。在目前的调查,我们的研究结果表明,PPAR的表达α很低的高度分化ccRCC组织和786 - o细胞系,但在低分化ccRCC组织。主要ccRCC细胞的形态学特征是大量存在的脂质滴在细胞质中31日]。ccRCC细胞脂滴的积累与多个基因有关,包括肉碱的underexpression palmitoyltransferase 1 (CPT1A)和脂肪酸合酶的过度(FASN) perilipin-3 [32- - - - - -34]。此外,杜等人报道,脂滴的积累在786 - o CPT1A细胞与低表达相关,和葡萄糖的主要成分是脂滴的形成在786 - o细胞(35]。然而,Wettersten等人报道,CPT1A可能促进acylcarnitines从游离脂肪酸的合成抗炎作用中高档ccRCC [36]。可以由PPAR CPT1A基因α(37]。基于我们的PPAR的研究α表达在不同等级的ccRCC其他调查人员组织和先前的研究,它可以表示,PPARα可能产生复杂,变量的影响在不同等级的ccRCC扩散和发展。最后,正如表的结果4,PPAR的表达α在ccRCC组织相关的等级分化,而不是病人的性别或年龄。PPARα可能是一个潜在的标志区分等级的ccRCC组织。在未来,更多的样本ccRCC组织将收集调查PPAR的表达之间的相关性α在ccRCC和临床相关的配置文件。

PPAR的作用α在不同肿瘤的治疗也是复杂多变的。PPARα不好表现在黑色素瘤和非诺贝特(一个PPAR激动剂α)可以抑制黑色素瘤的转移的差别通过对这些基因的一种蛋白激酶和ERK1/2磷酸化38]。PPARα副神经节瘤中高度表达。副神经节瘤的细胞系GW6471处理时,细胞凋亡被提拔和迁移是抑制通过镇压GSK3 PI3K / /β连环蛋白通路(26]。另一方面,PPARα在胰腺癌组织中与相邻正常组织相比。然而,安妥明(另一个PPARα受体激动剂)可以诱导细胞凋亡,使细胞辐射Wnt /差别通过对这些基因β连环蛋白通路。在ccRCC细胞糖酵解是能源的主要途径。GW6471可以阻止糖酵解和诱导细胞周期阻滞致癌基因的差别通过对这些原癌基因(39]。在这个研究中,我们发现,尽管PPARα在786 - o不善表达细胞HK-2细胞相比,前者细胞的生存能力可以减少GW6471存在剂量依赖的相关性但不是时间的方式。我们的结果类似于那些通过自我et al。16]。然而,我们发现WY14643没有显著的影响在786 - o细胞的可行性。基于ccRCC的新陈代谢,我们推测,PPAR的低表达α可能是至关重要的维持基底的糖酵解水平在786 - o细胞。WY14643没有重大影响的原因786 - o细胞的可行性还有待在将来的研究中探索。

在肾细胞癌,基底的自噬水平中扮演一个重要的角色在细胞生长和增殖。马等人应用包含IHC和发现表达ccRCC ATG9更高的组织比邻近的正常组织,这高表达是一个独立的预后危险因素ccRCC [40]。陆等人报道,UNC-51-like激酶1 (ULK1 ATG1)是另一个autophagy-associated蛋白的高表达ULK1是一个独立的预后危险因素ccRCC [41]。当细胞受到压力时,通过抑制自噬可以诱导thePI3K / AKT mTOR和MAPK / ERK / mTOR通路或激活AMPK / mTOR通路(42- - - - - -44]。基于自我等人的发现和我们,我们进一步探讨是否可以诱导自噬GW6471 786 - o细胞。AO荧光染料,染色是酸性泡状细胞器在红色和绿色的核25]。羟氯喹是弱碱性药物,可以稍微增加溶酶体的pH值,抑制autophagosome-lysosome融合,并诱导autophagy-independent严重混乱的高尔基体和endo-lysosomal系统,这可能会导致融合障碍(45]。自噬是细胞和诱导自噬时通量流畅,AO信号可以检测到显著的细胞。由于自噬流量被羟氯喹,溶酶体,自噬体可以积累和观察到的细胞(46]。我们发现,当786 - o细胞治疗GW6471,溶酶体的荧光信号与AO染色比未经处理的和WY14643组。当细胞接受GW6471和羟氯喹,荧光信号明显更明亮、更丰富的比GW6471,羟氯喹,和WY14643羟氯喹组。这个观察证明,溶酶体更在786 - o细胞治疗GW6471比未经处理的和WY14643团体和积累在GW6471羟氯喹组。LC3 (ATG8)是自噬小体的标记,它包括两种类型,即LC3-I LC3-II。LC3-II LC3-I lipidation类型,由ATG4催化和被认为是成熟的一个标志自噬体(47]。p62 (Sequestosome 1 / SQSTM1)是62 kDa蛋白参与细胞生存、细胞凋亡、炎症、和自噬(48]。p62与自噬相关的两个领域。非洲联合银行领域可以绑定到ubiquitinated蛋白质,和LIR域可以与LC3表面的自噬小体。最后,p62退化与货物一起在自噬体与溶酶体融合,当自噬流量是流利的49,50]。然而,当自噬流受阻,p62将积累在细胞(51]。通过免疫印迹,我们的研究表明,LC3-II / LC3-I GW6471组的比例高于未经处理和WY14643组。在GW6471羟氯喹组,LC3-II / LC3-I的比率高于GW6471,羟氯喹,和WY14643羟氯喹组。同时,的表达中p62 GW6471组低于任何其他团体,和p62积累在GW6471氯喹组。这些结果表明,GW6471可以诱导积分786 - o细胞自噬,自噬可以被羟氯喹。

自噬在肿瘤细胞的作用尚不清楚。在肾细胞癌中,自噬发挥双重影响细胞的命运(52]。舒尼替一线药物,这是一种酪氨酸激酶抑制剂,可以阻止血管生成和抑制细胞增殖治疗肾细胞癌(53]。李等人发现,这种药物可以减少细胞生存能力OS-RC-2肾细胞癌细胞系和诱导自噬的差别通过对这些PI3K / AKT / mTOR通路。当OS-RC-2肾细胞癌细胞cotreated舒尼替和氯喹,减少细胞生存能力超过细胞仅接受舒尼替,这可能归因于促进细胞凋亡(54]。哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)是一个传感器的营养和细胞增长,它包含两个亚型,即mTOR1 mTOR2。mTOR可以调节自噬作为一个关键蛋白质的“感知”的变化上游PI3K / AKT信号,MAPK / ERK和AMPK [55]。在肾细胞癌,mTOR的表达高于正常肾组织,因此广受好评的目标治疗RCC (56]。郑等人报道,mTOR双重抑制剂azd - 2014可以抑制细胞生长和诱导自噬在786 - o和OS-RC-2细胞。在两个细胞系对待azd - 2014和氯喹、细胞生存能力下降进一步促进细胞凋亡(57]。这一发现意味着azd - 2014和氯喹可能有协同效应在肾细胞癌的细胞死亡。自噬诱导肾细胞癌的药物可提高细胞死亡。Ubenimex,氨肽酶的抑制剂,可以增强免疫力,被认为是一个潜在的药物治疗肾细胞癌(58]。Ubenimex可以诱导自噬在786 - o和OS-RC-2细胞,当两个细胞系cotreated Ubenimex和雷帕霉素(mTOR的抑制剂),细胞生长抑制。然而,当3-methyladenine (3-MA),另一个自噬拦截器,结合ubenimex,没有显著差异仅在细胞生存能力与ubenimex相比(59]。这个结果暗示,自噬流量增强ubenimex在肾细胞癌与细胞死亡相关。索拉非尼是另一种血管生成抑制剂酪氨酸激酶,也是应用治疗肾细胞癌(60]。药物可以抑制细胞生长和诱导自噬的差别通过对这些mTOR / PI3K / AKT通路在786 - o和ACHN肾细胞癌的细胞。当细胞被cotreated 3-MA和索拉非尼(或击倒的ATG5基因),索拉非尼的毒性作用是逆转和细胞生存能力高相比,索拉非尼治疗(61年]。索拉非尼的观察表明,自噬可以促进细胞死亡在肾细胞癌。有趣的是,在我们的研究中,流式细胞术检测凋亡细胞的比例,执行和结果表明,凋亡细胞的比例与羟氯喹组高于GW6471 GW6471,羟氯喹,和WY14643氯喹组。使用免疫印迹,我们表明,当786 - o细胞cotreated GW6471和羟氯喹,裂解PARP的表达式和裂解caspase-3高于在细胞治疗GW6471或独自羟氯喹。因此,结合使用GW6471和羟氯喹的生存能力下降786 - o细胞并促进细胞凋亡。这一结果表明,抑制自噬可以加强细胞凋亡在786 - o GW6471对待。这段中讨论这些结果总结了原理图7。

尽管自噬在细胞死亡的作用仍不清楚,一些研究人员解释两者之间的关系对细胞器的降解的自噬小体,通过自噬的产生能量。一些细胞器如线粒体和内质网和脂滴可以通过自噬小体退化62年- - - - - -64年]。王等人报道,藤黄酸能诱导细胞凋亡和自噬在胰腺癌。水平的活性氧(ROS)被发现增加将促进受损的线粒体。是观察cotreatment藤黄酸的胰腺细胞和氯喹降低了细胞的生存能力在更大程度上,ROS水平强调自清除受损的线粒体抑制(65年]。在肺细胞,全氟烃基酸可以降低细胞的生存能力和诱导自噬通过吞噬破坏内质网和避免过度内质网应激(66年]。另一方面,可以生成能量通过自噬在细胞的压力。前列腺癌症是一种利用脂质生成能量(67年]。androgen-sensitive前列腺癌雄激素消融可以诱导自噬,通过自噬途径和脂滴可以退化为释放自由glycerinum和发电细胞(68年]。当自噬被推倒ATG5基因,减少前列腺癌细胞的生存能力高于雄激素消融组(69年]。ccRCC细胞主要利用葡萄糖通过糖酵解生成能量。根据自我的发现et al ., GW6471可以抑制糖酵解的差别通过对这些原癌基因在786 - o细胞(39]。我们的研究结果表明,GW6471可以增强自噬,cotreatment GW6471和羟氯喹可以减少细胞生存能力在更大程度上比治疗GW6471孤单。因此,我们推测,羟氯喹抑制自噬流量由GW6471 786 - o细胞葡萄糖的回收自噬可能已被逮捕。葡萄糖含量在786 - o细胞cotreated GW6471和羟氯喹对生存是不够的,而ATP水平可能降低了进一步与GW6471单独组相比,导致细胞凋亡的恶化70年]。

羟氯喹已经应用治疗疟疾和系统性红斑狼疮在很长一段时间71年,72年]。近年来,自噬在肿瘤治疗领域的研究,应用和羟氯喹治疗肿瘤,包括ccRCC,在临床设置(73年]。根据我们的研究结果,cotreatment GW6471和羟氯喹是有效地杀死786 - o肾细胞癌的细胞,但对HK-2细胞几乎没有影响。的结果中包含IHC ccRCC组织和PPAR的表达α在786 - o细胞系,我们的研究结果表明,羟氯喹和GW6471在治疗高度分化ccRCC可能是有益的,以最小的副作用在正常肾组织。

我们发现cotreatment羟氯喹和GW6471 ccRCC管理可能是一个潜在的有效的策略。然而,我们观察到PPARα在高度分化ccRCC不善表达组织和786 - o细胞系,在本研究应用作为细胞模型。因此,我们的研究结果可能是有效的治疗高度分化ccRCC。然而,使用只有一个分析ccRCC细胞系是限制在我们的研究中,我们打算运用更多的肾细胞癌细胞系如Caki-2或UM-RC-2 PPAR的验证作用α在不同病理RCC的模式。

5。结论

我们的研究表明,PPARα是不善表达高度分化ccRCC组织和786 - o细胞但低分化ccRCC组织中高度表达。可以诱导自噬GW6471 786 - o细胞和被羟氯喹。联合使用羟氯喹和GW6471被发现更有效地杀死786 - o细胞比单独使用GW6471或羟氯喹,这可能归因于促进细胞凋亡。此外,这种方法对HK-2细胞的生存能力影响很小,从而维护其安全在正常肾组织。根据这项研究的结果,结合使用GW6471和羟氯喹可作为小说和潜在的临床治疗高度分化ccRCC有益。然而,进一步在活的有机体内研究和临床试验是必需的。此外,PPAR的原因α受体激动剂没有显著的影响在786 - o细胞的增殖和自噬诱导的信号通路GW6471 786 - o细胞在未来需要探索。

数据可用性

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的利益冲突

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引用

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