文摘
背景。肝缺血再灌注(IR)损伤是一种严重的并发症与肝脏手术,导致肝脏功能障碍有关。PPARγ总是与各种生理途径,它可以减轻肝损伤在红外受伤。目的。在这项研究中,我们探讨了PPAR的潜在机制γ肝红外损伤的病理机制的小鼠模型。方法。处理后si-PPARγ或罗格列酮,老鼠接受肝缺血再灌注。肝组织和血液样本收集评估肝损伤和相对mRNA和蛋白表达检测。结果。PPAR的表达γ再灌注后增加。和PPAR的减轻γ在红外加重肝脏损害;与此同时,upregulation PPAR的表达γ发布了肝损伤。而这些PPAR的影响γ在红外相关AMPK / mTOR /自噬信号通路。结论。PPARγ扮演着一个重要的角色在肝红外受伤至少部分通过AMPK / mTOR /自噬通路。
1。介绍
缺血再灌注(IR)是一种现象发生后,动脉血流恢复到特定的器官或组织(1]。红外损伤的病理生理学主要诱导的氧化应激和炎症级联反应。因此,血液流的再灌注可能导致氧化损伤和炎症而不是复苏。肝红外损伤是一种严重的并发症与肝脏手术和导致肝功能衰竭或原发性无功能,因此,增加发病率和死亡率肝脏手术后(2- - - - - -4]。因为肝切除术或肝移植是治疗终末期肝脏疾病的最有效方法,有必要检测术前和围术期干预可能减少IR-induced肝细胞损伤,特别是在肝硬化患者。
作为核受体家族的一员,过氧物酶体proliferator-activated受体-γ(PPARγ)作为与DNA形成响应的元素和可以调节各种代谢反应(5,6]。PPARγ有一个重要的作用在调节肝脏的炎症反应和氧化应激红外损伤(7- - - - - -9]。PPAR的保护效应γ受体激动剂,如替米沙坦(10],irbesartan [11],darglitazone [12),罗格列酮(13,吡格列酮(14),在红外损伤已报告(15]。这些证据表明,PPARγ受体激动剂可以调节炎症反应、氧化应激在红外和新陈代谢。腺苷单磷酸盐激活蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶(AMPK / mTOR)信号通路已经被证实,这是一个至关重要的监管机构的细胞过程,包括细胞生长、生存能力,分化,生存和新陈代谢16- - - - - -18];mTOR也被确定为一个关键调制器的自噬19];及其失调已经在内的各种病理障碍,包括扮演重要角色在调节肝脏红外受伤。和PPARγ可以调节mTOR通路。在这项研究中,我们表达下调和调节PPAR的表达γ和探索PPAR的功能γ在肝红外受伤,我们治疗小鼠mTOR抑制剂,雷帕霉素(拉伯),以确保PPARγ显示其影响肝红外损伤通过AMPK / mTOR通路。
2。方法
2.1。动物的准备
这个项目被批准的动物保健和使用委员会上海同济大学和上海第十人民医院(shdsyy - 2021 - 4990),中国。和所有动物实验符合中国国家卫生研究院的指导方针。六个雄性Balb / c小鼠(上海SLAC实验动物、上海、中国)被用于我们的实验。所有的老鼠体重23-28 g和安置在一个标准的环境。所有的努力来减少小鼠的痛苦在这个研究。
动物接受虚假的手术或缺血再灌注(IR)操作。偏暖肝缺血是诱导如前所述20.]。用1.25%的戊巴比妥钠麻醉后(戊巴比妥钠,圣路易斯,密苏里州,美国),左边的血液供应外侧和中间的叶肝脏被打断,导致70%的缺血。肝缺血45分钟后,我们恢复血液供应和启动再灌注。我们在虚假执行相同的操作协议控制老鼠没有血管闭塞。老鼠牺牲后2、6、12和24小时缺血再灌注,收集血液和肝脏进行进一步分析。
雷帕霉素(S1039 Selleck)溶解在二甲亚砜(DMSO)在25毫克/毫升。rapamycin-treated组,动物收到雷帕霉素剂量为1.5毫克/公斤/天受伤前,通过腹腔内注射。
2.2。在活的有机体内转染与PPARγ小核RNA)
首先,siRNA PPARγ(导游:5UCAGCUCCGUGGAUCUCUCCGUAAU ,乘客:5AUUACGGAGAGAUCCACGGAGCUGA )或核控制(GenePharma、苏州、中国)从Genema购买。然后,根据生产指令,siRNA PPARγ小干扰rna控制或溶解在RNase-free水1的浓度μ克/μl .然后,5μL PPARγ核或5μL控制核和5μL体内转染试剂(18668 - 11,Engreen有限公司,北京,中国),分别与5稀释μL 10%的葡萄糖。最后,混合物的尾静脉注入老鼠。
2.3。动物实验设计
根据我们的实验计划,老鼠分成以下组:(1)自然组( ):没有任何治疗的小鼠(2)虚假的集团( ):老鼠接受虚假的手术(3)汽车集团( ):老鼠用甲基纤维素每天口服一次5天没有操作(4)药物组( ):老鼠接受10毫克/公斤罗格列酮口服一天一次5天没有操作(5)Si-control集团( ):老鼠从尾部静脉注射控制siRNA每天一次两周没有操作(6)Si-PPARγ集团( ):老鼠和PPAR从尾静脉注射γsiRNA每天一次两周没有操作(7)IR组( ):老鼠接受红外操作和牺牲,再灌注后6、12、24小时(8)红外+ Rosi组( ):与10毫克/公斤罗格列酮治疗后5天每天口服一次,老鼠接受红外操作和牺牲,再灌注后6、12、24小时(9)红外+ si-PPARγ组( ):注射后PPARγsiRNA每天一次2周,小鼠接受红外操作和牺牲,再灌注后6、12、24小时(10)红外+ si-PPARγ+ Rosi组( ):PPAR后治疗γ核和10毫克/公斤罗格列酮,老鼠接受红外操作和牺牲,再灌注后6、12、24小时(11)红外+拉伯( ):腹腔内注射mTOR抑制剂雷帕霉素后5天,老鼠接受红外操作和牺牲在再灌注后12小时(12)红外+ si-PPARγ+拉伯( ):PPAR后治疗γ核和雷帕霉素,老鼠接受红外操作和牺牲在再灌注后12小时
2.4。血清酶分析
血清被离心分离在1500 g 10分钟并存储在-80°C。血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)是衡量工具从建成有限公司购买(中国南京)。
2.5。组织学、免疫组织化学染色(包含IHC)和末端转移酶的dUTP尼克结束标记(TUNEL)测定
肝组织样本固定和嵌入到下面的标准步骤。肝脏部分被切割和苏木精和伊红染色。对于包含IHC,切片脱蜡、水化;抗原检索过程和阻塞后,切片与初级孵化一夜之间抗体免疫印迹分析部分中描述。TUNEL、片治疗根据指令,然后孵化TUNEL反应混合物在室温下(罗氏,曼海姆,德国)1 h。
2.6。免疫印迹分析
西方墨点法进行标准协议。蛋白质从冷冻中提取肝脏样本。总共80 ng蛋白质加载到6%,10%,和12.5% SDS-polyacrylamide凝胶,被转移到PVDF膜分离蛋白质。一夜之间,细胞膜被孵化在4°C主要抗体其后孵化二级抗体(1:2000)。最后,这些墨迹进行扫描使用奥德赛双色红外激光成像系统(美国东北Li-Cor,林肯)。西方墨迹使用以下抗体进行;PPARγ(细胞信号技术),mTOR(细胞信号技术),p-mTOR(细胞信号技术,Ser2448), AMPKɑ(细胞信号技术),p-AMPKɑ(细胞信号技术,Thr172)、肿瘤坏死因子-ɑ(细胞信号技术),il - 1β(细胞信号技术),伯灵顿(Proteintech)裂解caspase-9 (Proteintech) Beclin1 (Proteintech) LC3 (Proteintech)β肌动蛋白(Abcam)。
2.7。RNA提取和定量实时——(qRT) PCR分析
从组织的总RNA分离根据标准协议。互补脱氧核糖核酸合成第一链使用逆转录工具包(豆类生物技术)和用于分析指标表达式。实时PCR实验根据协议的实时PCR工具包(豆类,大津,志贺,日本)。每个基因的比例相比β肌动蛋白是由标准化计算每个控制单元的比例值。中存在的引物序列见表1。
2.8。统计数据
所有实验三次,使用图垫Prism 5.0软件进行了分析。数据表示为 。前后红外老鼠之间的差异,有或没有si-PPAR注入,有或没有服用tzd管理局与学生的双向方差分析评价 - - - - - -测试两组之间的比较。小于0.05被认为是具有统计学意义的价值。
3所示。结果
3.1。PPAR的表达γ在红外损伤
确认PPAR的激活γ在肝缺血再灌注损伤过程中,我们发现PPAR的表达γ通过免疫印迹和存在。在数据1(一)和1 (b),蛋白质和PPAR的mRNA表达γ增加再灌注后,特别是在6个小时。后,我们做了一个组织病理学分析红外受伤(图1 (c))。6个小时后可以看到明显的坏死,坏死率超过50%后再灌注后12小时。图1 (d)展出PPAR的免疫组织化学染色γ收集肝组织中,阳性细胞的数量变化几乎与上述结果。我们假设这种变化是由于PPAR的保护机制γ在肝细胞受损。和我们比较自然组,虚假的集团车辆组、药物组和siRNA-control团体排除对以下结果(补充图的影响1)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。减轻PPAR的表达γ在红外加重肝脏损害
Si-PPARγ是通过尾静脉注入小鼠表达下调表达,和再灌注后的病理改变与正常小鼠。再灌注后血清ALT和AST水平测量(图2(一个)PPAR的差别),我们发现,对这些基因γ加重肝细胞的损害。然后我们评估损害的炎症和细胞凋亡。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
我们发现炎症水平通过促炎细胞因子肿瘤坏死因子-ɑ和il - 1β。它们的循环水平被PPAR的确调节γdownregulation(图2 (b))。与前者一致,肿瘤坏死因子-ɑ和il - 1的表达β在si-PPAR更高γ集团(数据2 (c)和2 (e))。红外损伤,细胞凋亡是一个突出的特点,参与确认。伯灵顿是一个著名的proapoptotic家庭成员,我们发现其首先mRNA表达。图在图2 (d)与伯灵顿表达的增加表明,红外受伤,PPARγdownregulation增加更明显。然后,我们用免疫印迹测量伯灵顿的蛋白表达和caspase9,其结果(图2 (e)),注入si-PPAR展出γ增加红外损伤中细胞凋亡的发生。因此,PPAR的减轻γ在红外加重肝脏损害。
3.3。Upregulation PPAR的表达γ释放红外的肝损伤
罗格列酮是一个典型的PPARγ受体激动剂,广泛用于诊所。一群老鼠接受10毫克/公斤罗格列酮口服红外前5天,我们还将再灌注后的病理改变与正常小鼠。图3(一个)显示,血清ALT和AST水平,我们发现PPAR的upregulationγ减少肝细胞的损害。然后我们以同样的方式评估损害我们之前使用它。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
我们发现肿瘤坏死因子-ɑ和il - 1的水平β。它们的循环水平被罗格列酮(图表达下调3 (b))。与前者一致,肿瘤坏死因子-ɑ和il - 1的表达β罗格列酮治疗组较低(数据吗3 (c)和3 (e))。在数据图3 (d)和3 (e)显示,增加表达的伯灵顿和caspase9红外受伤被罗格列酮治疗的松了一口气,也就是说,在红外伤害减少细胞凋亡的发生。因此,PPAR的upregulationγ在红外减轻肝损伤。
3.4。PPAR的影响γ在红外可能与AMPK / mTOR /自噬信号通路
以确保PPAR的效果γ在红外受伤,这些老鼠,注射si-PPARγRosi处理。我们发现这些老鼠的细胞凋亡和炎症指数再灌注12小时后,在数字展出4(一)- - - - - -4 (d)。这些结果表明,在红外损伤肝损伤,包括肝细胞凋亡和炎症反应,绝对是PPAR的表达有关γ。除此之外,我们还发现pyroptosis的变化在我们的研究中,在补充图2。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
作为一种重要的激酶在能源止血,AMPK mTOR的上游目标和消极的监管机构,这是一个自噬的主要负监管机构。自噬在各种肝损伤起着至关重要的作用。结合之前的报道,我们推测,PPAR的影响γ在红外损伤可能与AMPK / mTOR /自噬信号通路。因此,我们测量p-AMPK的蛋白表达,p-mTOR, autophagy-related蛋白质,LC3, P62,和Beclin1的表情随着PPAR发生了变化γ(数据4 (e)和4 (f))。治疗Rosi明显提升AMPK磷酸化和减少mTOR的磷酸化形式,这导致了抑制自噬的老鼠的肝脏。和si-PPARγ会导致相反的效果。此外,我们发现上述变化小鼠si-PPAR处理γRosi,与上述结果一致。因此,PPAR的影响γ在红外损伤与AMPK / mTOR /自噬信号通路。
为了确保我们的结论,我们对待老鼠发现雷帕霉素抑制mTOR的功能和炎症反应和细胞凋亡的变化,其结果如图5。我们测量TNF的表达α伯灵顿,Beclin1,我们发现si-PPAR造成的影响γ被雷帕霉素。因此,我们证实了PPAR之间的关系γ和AMPK / mTOR。
(一)
(b)
4所示。讨论
在肝脏、红外损伤可能发生在一些临床情况,例如,肝脏创伤,切除和移植。红外的发病机制与氧化应激密切相关,能量代谢障碍、炎症反应、细胞凋亡和自噬(21]。众所周知,PPARγ展示了重要的功能在组织保护和修复22- - - - - -24]。和进步PPAR配体和受体激动剂更新药物开发的机会25]。在这里,在我们目前的研究中,我们发现PPAR的激活γ可以授予王亚南效应对肝红外受伤,也调查了PPAR的治疗潜力吗γ受体激动剂保护肝损伤。本研究的主要发现包括(1)PPAR的表达γ再灌注后增加,暗示PPAR的保护作用吗γ在肝红外损伤;(2)减轻PPAR的表达γ在红外光谱可以加重肝损伤;否则,upregulation发布肝损伤;(3)PPAR的保护作用γ可能涉及作为证明体内抗炎和antiapoptosis活动;(4)PPAR的底层机制γ在红外损伤可能与AMPK / mTOR /自噬信号通路。
PPARγ核激素受体的配体依赖性转录因子是总科已知调节目标基因参与调控各种炎症反应、细胞生长、细胞凋亡、代谢、纤维化和组织修复26,27]。几项研究已经表明,PPAR的激活γ是急性肝红外损伤的治疗目标(7,15,28]。此外,PPAR的受体激动剂γ表现出抗炎和antiapoptosis属性在体外和体内,可以从红外传授保护小鼠模型(29日,30.]。在目前的实验中,我们的研究结果表明,PPAR的表达γ再灌注期间增加。结合前面的研究,我们假设这种变化是由于PPAR的自发的保护机制γ在肝细胞受损。
澄清我们的假设,我们监管PPAR的表达γ通过注入si-PPARγ罗格列酮或管理,一个典型的PPARγ受体激动剂。上述治疗后,血清肝酶ALT和AST显示同样的变化。然后我们发现肝损伤的炎症和细胞凋亡。过度的炎症反应和肝细胞凋亡被认为是肝红外损伤的主要机制。我们发现炎症水平通过促炎细胞因子肿瘤坏死因子-ɑ和il - 1β。它们的循环水平被si-PPAR明显调节γ罗格列酮和表达下调。结果中存在和免疫印迹展出与IR组相比,肿瘤坏死因子-ɑ和il - 1的表达β在si-PPAR更高γ组和罗格列酮组低。红外损伤,细胞凋亡是一个突出的特点,参与确认。伯灵顿和caspase9著名proapoptotic指标,我们发现他们的mRNA和蛋白表达。伯灵顿和caspase9表达的增加红外受伤期间,PPARγdownregulation加剧了这个增加;不过,罗格列酮治疗的松了一口气。因此,PPAR的减轻γ在红外加重肝脏损害;同时,PPAR的upregulationγ减轻肝脏损害。此外,据报道,罗格列酮是保护在各种各样的伤害,包括红外许多器官损伤。我们的研究结果表明,罗格列酮可以减少,尽管不切除,肝损伤后红外受伤。
当进一步阐明的潜在机制PPAR在红外光谱的影响,我们集中在通路,AMPK / mTOR介导的自噬。AMPK存在于所有真核细胞作为一个高度保守的蛋白激酶。它是一个主要的监管机构的能量平衡,平衡能源供应和需求,最终调节细胞和器官增长31日,32]。可以激活AMPK各种压力,包括有毒代谢物和病理前兆如饥饿、缺血和缺氧33]。mTOR 289 kDa丝氨酸/苏氨酸激酶,是自噬主负监管机构,调节细胞生长、细胞增殖、细胞周期、细胞运动性(16]。自噬起着关键作用的调制炎症、细胞内稳态失调,细胞死亡或生存。已经证明与各种肝脏疾病有关,包括肝炎、肝纤维化、脂肪肝,急性红外损伤(34- - - - - -37]。被接受,AMPK抑制mTORC1通过磷酸化作用,因此,诱导自噬细胞压力信号的反应。
PPAR之间的关系γ和AMPK / mTOR通路之前讨论(17,38]。Jimenez-Flores et al。39和钟等。40)报道,p-AMPK和PPAR -γ表达水平显著降低糖尿病小鼠肝脏和减轻肝损伤的表达的增加。钟等。41)发现db / db老鼠明显降低PPAR -γp-AMPK表达水平和增加p-mTOR表达式,表达式Atg7, Beclin-1, LC3也降低了。Micheliolide逆转这些影响,减轻炎症反应和lipotoxicity肝细胞。此外,PPAR的链接γ和AMPK / mTOR /自噬途径探讨了在其他疾病模型42- - - - - -48]。确保机制,老鼠接受至少si-PPAR之一γ和Rosi。PPAR的表达减弱γ由于si-PPARγ会导致明显的抑制AMPK磷酸化,从而促进了mTOR的磷酸化,诱导自噬在小鼠肝脏。Rosi的治疗会导致相反的效果。此外,我们对待老鼠与si-PPARγ罗格列酮和得到了相同的结果。此外,我们使用雷帕霉素确认mTOR的参与,发现雷帕霉素引起的炎症反应和细胞凋亡在红外损伤改变si-PPAR对面γ。因此,我们认为,PPAR的激活γ不仅可以减轻炎症反应和肝细胞凋亡也发挥王亚南通过AMPK / mTOR /自噬通路(图6)。
5。结论
总之,我们发现PPARγ不断激活肝细胞在肝脏红外受伤。小鼠显著减少PPAR的表情γ有更多严重肝损伤后肝缺血再灌注损伤。相反,PPAR的激活γ罗格列酮导致减毒引起的肝损伤。通过使用si-PPARγ罗格列酮,我们证实,PPAR的一个可能的机制γ激活导致保护IR-related肝损伤是通过AMPK / mTOR-mediated自噬。这些结果表明PPARγ可能是一个至关重要的监管机构和潜在的治疗目标在肝脏缺血性损伤。和我们的结果为PPAR的后续发展提供了信心γ相关药物的红外受伤。
缩写
| AST: | 天冬氨酸转氨酶 |
| ALT: | 丙氨酸转氨酶 |
| 包含IHC: | 组织学,免疫组织化学染色 |
| TUNEL: | 末端转移酶的dUTP尼克标签试验结束 |
| 存在: | 定量实时聚合酶链反应分析 |
| 红外光谱: | 缺血再灌注 |
| PPARγ: | 过氧物酶体proliferator-activated受体-γ |
| AMPK: | 腺苷单磷酸盐激活蛋白激酶 |
| mTOR: | 哺乳动物雷帕霉素靶 |
| Rosi: | 罗格列酮。 |
数据可用性
在生成的数据集和/或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(批准号:81670472),等肝脏病学研究中国肝炎防治基金会基金(批准号:CFHPC2019031)、上海市自然科学基金(批准号:19 zr1447700),上海科委Yangfan计划(批准号:20 yf1443300),卫生系统创新项目上海普陀科技委员会(格兰特数字:PTKWWS201801和PTKWWS201903),和医院的基础在闵行区(授予数量:2018 mhjc08)。
补充材料
补充材料1:对照组比较。我们比较自然,虚假的集团车辆组、药物组和siRNA-control团体排除对结果的影响。我们检测到血清ALT和AST水平组和观察肝组织病理变化。结果展示如下。我们发现这些组之间没有显著差异,这意味着他们不会造成明显的影响在我们的研究中。2:PPARγ可能影响pyroptosis IR的伤害。nod样受体蛋白3 (NLRP3) inflammasome pyroptosis发展中扮演着重要的角色,并可能导致caspase1的激活。在补充的实验中,我们测量的循环水平的地震(a)和caspase1 mRNA和蛋白表达和NLRP3在不同组的老鼠(b和c)和红外光谱之间的关系,发现PPARγ,pyroptosis。我们发现pyroptosis增加红外,和PPAR的减轻γ加重pyroptosis,但upregulation PPARγ发布它。(补充材料)