文摘
胆脂瘤的特点是hyperkeratinized鳞状上皮的生长和骨侵蚀。然而,hyperproliferative胆脂瘤的能力的确切机制仍然未知。在这项研究中,我们调查了PPARβ/δ表达在人类胆脂瘤的手术标本和分析其功能作为监管机构的上皮角化细胞增生。我们发现PPAR的表达β/δ在胆脂瘤显著调节,ligand-activated PPAR吗β/δ显著促进胆脂瘤的扩散角化细胞。此外,我们表明,PPARβ/δ激活增加的基因表达和PTEN生成减少,导致增加一种蛋白激酶的磷酸化和GSK3β和增加细胞周期蛋白D1的表达水平。总的来说,我们的数据表明,PPAR的增殖效应β/δ胆脂瘤的角化细胞是由积极的调控基因/ GSK3 PTEN / AKT /β/周期蛋白D1的途径。这些发现的PPAR的进一步调查β/δ作为复发或残留胆脂瘤的治疗目标。
1。介绍
胆脂瘤是一种良性表皮衍生颞骨病变局部破坏性和经常复发。它的特点是hyperkeratinized鳞状上皮的生长和骨侵蚀中耳乳突腔。胆脂瘤引起多种并发症包括,但不限于,听力损失,小骨的侵蚀,迷宫般的瘘,面部的弱点,和颅内感染。不幸的是,控制胆脂瘤形成的分子事件并不完善。如今,越来越多的关注已经支付给hyperproliferative上皮细胞的活动,从而发挥重要作用在胆脂瘤的病理生理的级联1]。
目前,胆脂瘤的手术是唯一有效的干预。尽管手术技术的进步,但整体比例估计与手术后复发10年70%以上(2]。据报道,胆脂瘤的高复发率与细胞增生(3,4]。因此,我们推测,上皮的hyperproliferative能力可能扮演了一个重要的角色在胆脂瘤的发病和复发性模式。
过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs)是核激素受体超家族的成员,包括三个不同的亚型,即PPARα,PPARγ,PPARβ/δ(5]。与特定的配体,绑定后PPARs调节多种细胞过程,如细胞增殖和分化、细胞凋亡、炎症反应和代谢。在过去的十年中,PPAR的表达γ据报道在胆脂瘤上皮和调节与胆脂瘤分化(6]。自从PPARβ/δ是主要的亚型在人类角质细胞(7)和角化细胞的主要成分是胆脂瘤矩阵,它是PPAR逻辑β/δ也会胆脂瘤组织中的表达。然而,据我们所知,PPAR的潜在的表达和分布β/δ在人类胆脂瘤没有被调查。
许多研究表明,PPAR的配体激活β/δ能引起终端分化的角化细胞和上皮细胞8]。与这些研究结果一致,许多研究也表明,PPARβ/δ抑制细胞增殖在上皮细胞和其他细胞类型,包括colonocytes,角质细胞、心肌细胞、成纤维细胞和癌症细胞系(8]。然而,PPAR的角色β/δ在角化细胞增长仍然质疑是有限的报道证明ligand-activated PPARβ/δ可以加强细胞增殖9- - - - - -11]。Di-Poi等人证明了这一机制的阐明,PPAR的增殖效应β/δ是介导通过基因表达的直接压制的磷酸酶和tensin同族体删除10号染色体上(PTEN)和增加3-phosphoinositide-dependent-protein激酶1(基因)的表达,然后激活的磷酸化蛋白激酶B(一种蛋白激酶),导致细胞增殖的角化细胞(12]。因此,这些证据表明,PPAR的角色β/δ是,瀑特异性细胞类型。
以前的研究(13)已经证明PI3K / Akt / PTEN /细胞周期蛋白D1信号通路确实是活跃在胆脂瘤上皮和起着至关重要的作用在胆脂瘤角化细胞增生。自从PPARβ/δ促进细胞增殖的角化细胞调制PTEN基因/亲属/ Akt活动(12),因此,在这项研究中,我们假设激活细胞周期蛋白D1 / PI3K / Akt信号介导的PPARβ/δ可能参与胆脂瘤上皮的异常角化细胞的增生。此外,鉴于PPAR的治疗潜力β/δ在胆脂瘤拮抗剂,进一步研究其功能作用是必要的。为了测试我们的假设,我们调查了PPAR的表达和分布β/δ在中耳胆脂瘤,升高的影响ligand-activated PPARβ/δ,探讨PPAR的机制β/δ介导的细胞增殖培养胆脂瘤角质细胞。
2。材料和方法
2.1。材料
高度选择性PPARβ/δ受体激动剂GW0740和PPARβ/δ拮抗剂GSK0660买来MedChem表达(新泽西州,美国)。所有其他试剂从供应商获得表示,至少分析级。使用的抗体及其来源还表示如下。
2.2。组织准备和免疫荧光
标本来自10个病人获得初级胆脂瘤患者(5和5健康的外耳道皮肤)和用于免疫荧光。每个标本在4%多聚甲醛固定24小时,然后嵌入石蜡。然后,五5毫米部分被用于免疫荧光(如前所述14]。1 h在10%的部分被封锁后正常山羊血清deparaffinization和补液分级酒精。简单冲洗后,用兔多克隆anti-PPAR一夜之间,部分被孵化β/δ抗体(Genetex、剑桥、马、美国)250倍稀释。随后,Alexa 555 -标记的部分是孵化山羊anti-rabbit抗体室温1小时然后使用蓝色荧光染色4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。最后,以Axioskop显微镜检查的部分(从卡尔蔡司,德国)。本研究研究伦理委员会批准的眼睛和复旦大学耳鼻喉医院。知情同意是获得所有胆脂瘤患者纳入本研究。
2.3。细胞培养和刺激
胆脂瘤角质细胞分离和特征如前所述14]。总之,胆脂瘤组织获得手术切除后和手带到实验室。组织被切成小块用剪刀和胶原酶消化与200 U /毫升IV (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在一夜之间在4°C。消化细胞与哈佛商学院洗两次,然后在1500转离心5分钟。颗粒被删除,添加到10毫升角化细胞无血清培养基(KSFM;表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国)与青霉素500单位/毫升/链霉素(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和培养公司5%2调湿大气在37°C。KSFM媒体和抗生素是改变每3天。细胞培养之间的第三和第四章节被用于这项研究。
2.4。EdU染色扩散分析
细胞增殖,以应对不同的治疗方法被证实使用EdU成像设备(表达载体,卡尔斯巴德,CA)和分析是根据制造商的指示。胆脂瘤角化细胞( )镀是在一个实验室里的技术员室幻灯片(Nalge Nunc国际剑桥,妈,美国)和增长到70 - 80%融合KSFM介质,然后处理控制(DMSO) GW0742(100海里),或GSK0660 (5μ米)24 h。Edu (10μ米)添加8 h每个测量周期结束之前。以4%的多聚甲醛固定后15分钟,0.3%的细胞被permeabilized triton x - 100在PBS 15分钟。然后,细胞被孵化的点击反应鸡尾酒包含点击反应缓冲区,CuSO4,Alexa萤石®555叠氮化反应缓冲添加剂30分钟而免受光。接下来,这些细胞被孵化与5μg / ml赫斯特33342年10分钟进行DNA染色。最后,细胞成像和荧光显微镜、EdU-positive细胞的百分比计算。
2.5。免疫印迹分析
胆脂瘤角化细胞培养在35毫米文化菜肴。细胞增长到70 - 80%汇合,然后放在KSFM与控制(DMSO) GW0742(100海里),或GSK0660 (5μ米)。治疗24小时后,这些细胞被洗和孤立使用细胞裂解缓冲(Beyotime生物技术研究所、中国)含有蛋白酶抑制剂。等量的总蛋白8% sds - page分离和转移到PVDF膜(100 V 60分钟)。细胞膜主要抗体孵育过夜在4°C,紧随其后的是二级peroxidase-conjugated抗体1 h。乐队是可视化增强化学发光和暴露于ECL Hyperfilm(通用电气医疗集团)。乐队的微NIH图像1.63软件进行量化。蛋白表达的规范化是beta-actin的数量。以下主要抗体被用于:anti-phospho-PDK1 anti-protein激酶B(一种蛋白激酶),anti-phospho-AKT anti-phospho-GSK3β和anti-phospho-PTEN(所有从细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国)。抗体β肌动蛋白、细胞周期蛋白D1和PPARβ/δ来自Genetex, Inc . (Genetex、钙、美国)。
2.6。统计分析
执行统计分析使用统计软件SPSS(11.5版)。所有的数据提出的 和分析的 - - - - - -测试。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。Immunolocalization PPAR的β/δ
PPARβ/δ在细胞的细胞核明显表达,主要在基底和parabasal细胞层(数据吗1 (d)- - - - - -1 (f))。然而,通常表达的强度削弱颗粒层和棘细胞层(数据1 (d)- - - - - -1 (f))。在控制皮肤,PPAR染色β/δ被发现(图1(一)- - - - - -1 (c))。为PPAR Immunofluorescent染色β/δ在胆脂瘤上皮组织一直比在控制皮肤。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2。胆脂瘤扩散角化细胞促进PPAR的存在β/δ选择性受体激动剂
以确定的影响ligand-activated PPARβ/δ胆脂瘤的角化细胞,我们24小时的细胞治疗GW0742 (PPAR高亲和力β/δPPAR激动剂)或GSK0660(高亲和力β/δ拮抗剂)和量化处理后的扩散细胞数量。因为EdU胸苷类似物,并纳入新合成的DNA在S期,EdU-positive细胞通常是新生儿和增殖细胞。作为显示在图2,显著增加24小时后观察胆脂瘤的100 nM GW0742治疗角化细胞(数字2(一个)和2 (b))。同时,一个antiproliferated效应观察胆脂瘤与GSK0660角化细胞治疗,在EdU-positive 5后细胞率显著降低μM GSK0660治疗(数字2 (c)和2 (d))。这些结果表明,ligand-activated PPARβ/δ能促进人类胆脂瘤的扩散角化细胞。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。激活PPARβ/δ由特定配体增加的基因的表达
胆脂瘤角化细胞是一种具有独特生物行为转换角化细胞的细胞类型区别与健康的角化细胞(15]。PPARβ/δ是皮肤和角化细胞中高度表达。确定胆脂瘤角质细胞表达功能PPARβ/δ,细胞治疗与100 nM GW0742或5μM GSK0660。免疫印迹分析表明,胆脂瘤PPAR角质细胞持续表达β/δGW0742或PPAR GSK0660没有影响β/δ表达式(数据3(一个)- - - - - -3 (d))。验证GW0742的增殖促进效应与特定配体激活的PPAR相关联β/δ,已知的和公认的PPAR的表达β/δ端依赖目标基因检查。假定的PPAR的表达β/δ目标基因的基因(13]被GW0742显著诱导(数字3 (e)- - - - - -3 (f))。此外,GSK0660治疗,PPAR的拮抗剂β/δ,也显著逆转GW0742的影响基因的表达(数字3 (g)- - - - - -3 (h))。这些数据表明,胆脂瘤PPAR角质化细胞反应β/δ配体,可以由一个已知的PPAR的感应β/δ端依赖目标基因治疗后24小时内。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.4。激活PPARβ/δ促进胆脂瘤的扩散角化细胞通过基因/ AKT / GSK-3β/周期蛋白D1的途径
先前的研究表明,PPAR的配体激活β/δ在初选鼠标引起的角质细胞凋亡信号由PTEN表达和抑制癌基因的表达增加的基因和ILK1导致增加一种蛋白激酶的磷酸化(12]。确定这个路径函数类似于胆脂瘤角质细胞,我们分析了PTEN的表达,一种蛋白激酶磷酸化通过定量免疫印迹分析。100海里GW0742治疗后,胆脂瘤角质细胞增加一种蛋白激酶的磷酸化和PTEN的表达降低(图4(一))。充分描述信号通路,我们检查了PTEN的表达,基因,一种蛋白激酶,其下游目标。免疫印迹(图4(一))表明,GW0742治疗增加了P-AKT (ser473)及其下游效应器细胞周期蛋白D1和抑制PTEN的水平,改变GSK3磷酸化的活动β胆脂瘤的角质细胞。确定这是PPARβ/δ介导作用,PPAR的具体对手β/δGSK0660,使用。如图4 (b),GSK0660有反向影响基底这些激酶的磷酸化。这些结果表明ligand-activated PPARβ/δ通过upregulation促进胆脂瘤的扩散角化细胞的基因/ AKT GSK3 PTEN /β/周期蛋白D1的信号通路。
(一)
(b)
4所示。讨论
在目前的研究中,我们首次展示了定位和高表达的核抗原PPARβ/δ蛋白质在人类中耳胆脂瘤上皮细胞。PPARβ/δ主要是出现在角化细胞(7),起着重要的作用在调节炎症,免疫反应,细胞增殖,细胞分化,细胞凋亡。此外,胆脂瘤角化细胞是一个转换与增殖增加角化细胞的细胞类型的能力。这些结果表明PPAR的潜在作用β/δ超表达在胆脂瘤的发病机制。
以前,PI3K / Akt /细胞周期蛋白D1signaling途径是发挥着至关重要的作用在胆脂瘤上皮增生13]。活化的PI3K可以产生第二信使PIP3 PIP3新兵的基因和PDK2细胞膜,然后基因/ PDK2合作完全激活一种蛋白激酶(13]。在我们的研究中,我们发现PPARβ/δ受体激动剂可以诱导基因的表达,这是作为假定的PPARβ/δ端依赖目标基因(11),显著影响一种蛋白激酶/细胞周期蛋白D1的途径。此外,PPARβ/δ激活与高选择性合成配体有明显的胆脂瘤增殖影响角质细胞。以及治疗PPAR的细胞β/δ拮抗剂可以扭转这种效果。这些结果让我们假设基因PTEN / AKT GSK3 /β/细胞周期蛋白D1通路参与的过程ligand-activated PPARβ/δ全身的细胞增殖胆脂瘤的角质细胞。我们的工作提供了一个关于PPAR关键线索β/δ作为一个潜在的目标为胆脂瘤治疗抑制表皮角化细胞增殖。
另一个表明PPAR机制β/δ通过促进细胞存活和增殖PTEN-AKT通路的调控。作为负调节的PI3K / AKT信号通路,肿瘤抑制基因PTEN可以调节细胞生长、增殖和生存16]。先前的研究表明,PTEN表达显著低于胆脂瘤上皮和PTEN之间显著负相关,p-Akt表达式被发现在胆脂瘤17,18]。我们的研究显示减少胆脂瘤中PTEN的表达与PPAR角质细胞治疗β/δ受体激动剂GW0742。虽然我们没有直接确定激活PPAR的影响β/δPI3K活动,我们做了检测磷酸化的基因和AKT,增加一个已知的下游PI3K的目标。这些结果表明,PPAR激活β/δ减少PTEN表达和移植的一种蛋白激酶信号通路促进胆脂瘤扩散角化细胞。
糖原合成酶激酶3β(GSK3β)被发现在各种各样的细胞过程,如新陈代谢、分化和细胞凋亡19]。GSK3 Akt衬底,β可以被磷酸化和灭活Akt的所有三个亚型和负受Akt活动(20.,21]。在我们的研究中,GW0742治疗增强一种蛋白激酶的磷酸化GSK3 (Ser473)和β(Ser9)通过激活的基因/ AKT / GSK3β信号通路。一旦GSK3β磷酸化,退化引起的细胞周期蛋白D1 GSK3吗β会抑制。由于抑制PTEN和AKT激活,细胞周期蛋白D1也会诱导及其表达水平增加。在一起,这些结果可以部分解释PPAR的机制β/δ选择性受体激动剂导致胆脂瘤扩散角化细胞。
基于上述研究结果,我们提出一个模型PPAR的角色β/δ在调节细胞增殖在胆脂瘤角质细胞。PPAR激活后β/δ,增加的基因表达和PTEN减少代GSK3导致增加一种蛋白激酶的磷酸化和β。这些变化增加细胞周期蛋白D1的表达水平,这反过来,促进从G1 S期细胞周期转变。综上所述,我们的研究结果表明PPARβ/δ激活促进细胞增殖在胆脂瘤角质细胞通过调节基因/ AKT / GSK3 PTEN /β/周期蛋白D1的途径。
总之,我们表明,配体激活的PPARβ/δ调节细胞增殖在胆脂瘤角质细胞和upregulation基因和调制的一种蛋白激酶/ PTEN / GSK3β/周期蛋白D1的途径可能参与其中。这些发现具有重要意义不仅对理解PPAR的分子机制β/δ在胆脂瘤复发的治疗提供了新颖的见解或残留胆脂瘤。
数据可用性
使用的数据或分析在当前研究可从相应的作者在一个合理的请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Zhangcai气设计研究,收集和组织数据,写的手稿。陈Yang-Wenyi刘和张收集和组织数据。Bing陈设计研究和撰写并回顾了手稿。
确认
这项工作是由上海市卫生局的科学项目支持(排名20174 y0062)。