文摘

炎症引起的神经病变导致神经性疼痛(NP)的发展,但确切的机制仍然需要被理解。过氧物酶体proliferator-activated受体α(PPARα),一个重要的炎症调节器,可能在NP参与炎症。探索PPAR的角色α在NP, PPAR的影响α受体激动剂王寅- 14643在慢性收缩损伤(CCI)大鼠进行评估。结果表明,王寅- 14643刺激可以减少炎症和缓解神经性疼痛,这是相对与PPAR的激活α。此外,我们还发现,SIRT1 / NF -κB通路参与了王寅在NP - 14643诱导抗炎,和PPAR的激活αSIRT1的表达增加,从而减少促炎NF -的函数κb。这些数据表明,王寅- 14643可能作为炎症介质,这可能是一个潜在的治疗选择NP。

1。介绍

神经性疼痛(NP),一个复杂的躯体感觉神经系统的疾病,影响全球总人口的-10% 7% (1]。患者被诊断为NP将伴随着射击和灼痛,刺痛的感觉,这样他们的生活质量下降2]。目前,NP的致病因素是低估和NP的管理挑战1]。许多研究表明,在NP存在免疫系统功能障碍,导致过敏性炎症的过程中,作为一种促炎细胞因子和抗炎细胞因子降低升高的3- - - - - -7]。然而,在NP炎症的分子机制仍然需要完善。

过氧物酶体proliferator-activated受体α(PPARα),属于PPAR家庭配体依赖性转录因子调节脂质代谢,是神经元生存,心脏病理生理学,细胞周期,和炎症8,9]。据报道,PPARα展品inflammation-suppressing影响肥胖、动脉粥样硬化、常染色体显性遗传多囊肾疾病,急性肾损伤(10- - - - - -13),但PPAR的角色α在炎症NP仍然不清楚。王寅- 14643,PPARα受体激动剂,已被证明是减少炎症在一些病理过程(14]。然而,王寅- 14643是否能抑制炎症在NP不是阐述。

Sirtuin蛋白1 (SIRT1),烟酰胺腺dinucleotide-dependent第三类组蛋白/蛋白脱乙酰酶,参与许多细胞过程包括老化、细胞周期、分化、凋亡、代谢和炎症(15,16]。人们普遍认为SIRT1充当核factor-kappa (NF - B的抑制剂κB)信号和p65乙酰化作用被认为是起搏器的NF -κB通路(17]。后来越来越多的证据表明,SIRT1有能力抑制炎症的NF -κB抑制(18,19]。

在这项研究中,我们假设王寅- 14643可以缓解炎症通过SIRT1 / NF - NPκB信号。验证假设,慢性收缩损伤(CCI)大鼠模型成立。疼痛测试进行检查是否王寅- 14643可以缓解NP CCI老鼠,和促炎细胞因子的表达检测评估CCI大鼠的炎症。

2。材料和方法

2.1。动物

成年男性Sprague-Dawley老鼠(200 - 250克,8周)被用于这项研究,从浙江省人民医院购买。所有的老鼠被随机分为10组( )。动物实验是通过人民医院杭州医学院和依照执行实验动物保健和使用指南公布的美国国立卫生研究院(2011)。

2.2。CCI模型

慢性收缩损伤(CCI)手术根据班尼特描述的过程和谢20.]。老鼠与戊巴比妥钠麻醉(40毫克/公斤,i.p)。下了一个口子髋骨和并行坐骨神经。CCI鼠组、双边坐骨神经的两条腿被4 - 0铬暴露和结扎松散肠道缝合线约1毫米间距,而没有结扎虚假的组。手术是由相同的研究人员。手术后,CCI老鼠逐渐显示出典型的自发的痛觉过敏的迹象,但是虚假的行为表现组手术前是一样的。

手术后,CCI老鼠对待王寅- 14643(10毫克/公斤)21];GW6471(30毫克/公斤)22];和si-SIRT1 (250 nm /公斤);鞘内注射的药物。注入两个小时后,疼痛进行测试。

2.3。疼痛测试

2.3.1。机械痛觉过敏

爪子撤军机械阈值(PWMT) (23)是决定应用电子·冯·弗雷灯丝。把老鼠放进有机玻璃盒( 厘米)与金属网层。灯丝按足底表面直到老鼠收回爪子。记录所显示的值电子·冯·弗雷灯丝。在5分钟的时间间隔重复每个测量3次。

2.3.2。热痛觉过敏

爪子撤军热延迟(PWTL) [23使用热辐射)决定。把老鼠放进有机玻璃盒超过30分钟来适应环境。热源被指着的足底表面后爪子,和老鼠的时候显示爪子撤退被记录。热刺激在5分钟间隔重复了3次,平均价值被认为是PWTL。行为测试都是由同一个人。

2.4。RNA提取和存在

所有疼痛测试完成时,老鼠立即斩首。收集血清并存放于冰箱-80°C。L4-6脊髓被液态氮冷冻。冷冻脊髓的总RNA提取使用试剂盒试剂(英杰公司、美国),和核糖核酸的浓度测量使用NanoDrop 2000。然后,逆转录PCR进行混合使用PrimeScript RT大师(豆类、日本)。执行中存在使用SYBR预混料Taq交货(豆类、日本)和运行7500年ABI实时PCR系统(美国生活技术)。GAPDH是作为内部控制。2相对表达式计算^{- - - - - -ΔΔCT}算法。

2.5。ELISA

肿瘤坏死因子-α,il - 1β,血清il - 6水平和使用大鼠肿瘤坏死因子-脊髓被检测到α,il - 1β及il - 6及膜板(Dakewe,中国)。

2.6。免疫印迹

冷冻样本细胞溶解使用T-PER组织蛋白质提取试剂(美国热科学)。蛋白质浓度由BCA测量试验设备(Leagene,中国)。30μg蛋白是由钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚偏二氟乙烯膜。细胞膜是孵化主要抗体(anti-SIRT1, 1: 1000;anti-acetyl-NF -κB p65, 1: 1000)在一夜之间在4°C和二级抗体(1:5000)在室温下1 h。美国西方ECL衬底(Bio-Rad)被用来可视化蛋白质乐队。ImageJ用于分析蛋白质的灰度值。

2.7。统计分析

这样的结果 。两组之间的差异的重要性是由学生的 - - - - - -测试;以上三组之间的差异被单向方差分析分析。美国IBM SPSS 23.0()和GraphPad棱镜6。墨水(加州GraphPad)主要用于分析。 被认为具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。急性王寅暂时缓解NP - 14643治疗

王寅- 14643是一种合成PPARα受体激动剂;当前的研究表明,PPARαNP的发展中扮演了重要的角色。因此,确定antinociceptive王寅在NP - 14643的影响,CCI老鼠对待王寅- 14643。机械痛觉过敏和热异常性疼痛被PWMT和PWTL评估。与虚假的组相比,PWMT和PWTL CCI组显著降低。然而,PWMT之间增加2和3 h后王寅(图- 14643管理1(一))。PMTL也改善2和4 h之间王寅(图- 14643治疗1 (b))。这些结果表明,急性王寅- 14643政府暂时松了一口气NP。

3.2。重复王寅- 14643政府减轻NP CCI老鼠通过激活PPARα

鉴于上述研究结果,我们下一个测试重复王寅- 14643治疗是否能促进经济复苏的NP CCI老鼠。老鼠接受王寅- 14643一天一次手术后11天。此外,据报道,SIRT1参与炎症和PPAR监管和交互。因此,PPARα拮抗剂GW6471(美国MedChemExpress)和体内si-SIRT1 (RiboBio,中国)也用于探索王寅- 14643治疗NP的机制。机械痛觉过敏在王寅- 14643组显著降低,但GW6471 si-SIRT1(图再次加剧疼痛2(一个))。热痛觉过敏也减少了王寅- 14643管理;然而,GW6471 si-SIRT1逆转的antinociceptive效果王寅- 14643(图2 (b))。这些数据表明王寅充当PPAR - 14643宽慰NPα受体激动剂,SIRT1抑制了王寅在NP - 14643的功能。

3.3。重申王寅- 14643政府减少CCI老鼠通过激活PPAR的炎症α

最近的研究表明,PPAR的激活α增加了SIRT1的表达和活性,从而导致p65 NF -脱乙酰作用κB,从而抑制炎性细胞因子的表达(24,25]。炎症以来参与报道神经性疼痛的发病机制,促炎细胞因子包括il - 1的表达β、il - 6和TNF -α确定使用ELISA。血清和脊髓样本收集后立即完成所有行为测试。CCI老鼠,il - 1β、il - 6和TNF -α血清中水平显著增加(图3(一个))。重复王寅- 14643治疗减少促炎细胞因子的水平。然而,PPARα拮抗剂(GW6471)和si-SIRT1增加il - 1β、il - 6和TNF -α血清中水平(图3(一个))。我们还发现il - 1的表达β、il - 6和TNF -α在脊髓。王寅- 14643显著抑制炎症的CCI老鼠,而GW6471和si-SIRT1逆转抗炎效应引起的王寅- 14643(图3 (b))。总的来说,结果表明,王寅- 14643减少了炎症通过PPAR NPα/ SIRT1的途径。

3.4。SIRT1 / NF -κB通路介导王寅- 14643诱导抑制NP

NF -κB是一个关键的炎性介质,参与炎症反应的调节。烟酰胺腺嘌呤dinucleotide-dependent脱乙酰酶SIRT1,可以抑制NF -κB信号通过脱去乙酰基p65 NF -亚基κB复杂(24]。为了进一步探索NP的分子机制,我们发现SIRT1的表达和乙酰化NF -κB p65 (Ac-NF -κB p65)。CCI减少SIRT1表达式(图4(一)),而Ac-NF -κB p65表达显著增加(图4 (b))。王寅- 14643治疗增加了SIRT1的表达式,从而脱去乙酰基NF -κB p65。但GW6471 si-SIRT1抑制SIRT1的表达和恢复Ac-NF -κB p65表达式(数字4(一)和4 (b))。这些结果表明,王寅通过PPAR - 14643缓解NPα介导SIRT1 / NF -κB通路CCI老鼠。

4所示。讨论

NP的根本基础是慢性异位疼痛的神经元的电活动。细胞位于损伤部位释放促炎细胞因子,导致促炎的环境(7]。因此,深入了解如何减少炎症是NP的紧急治疗。PPARα已获得的重视在许多疾病模型的抗炎作用。然而,PPAR之间的分子机制α激活和炎症在CCI模型中尚未完全阐明。在这项研究中,我们首先使用PPARα受体激动剂王寅- 14643探索PPAR之间的信号通路α在NP激活和炎症。

首先,我们发现的PWMT和PWTL CCI老鼠明显低于那些虚假的集团,而PPARα受体激动剂王寅- 14643治疗会增加PWMT PWTL。随后,我们比较王寅- 14643和PPAR的影响α拮抗剂GW6471 CCI老鼠。机械和热痛觉过敏的显著减少观察王寅- 14643治疗组;然而,GW6471政府屏蔽了这些影响。上述结果表明,王寅为NP - 14643拥有潜在的治疗价值。这是第一次,王寅在NP - 14643的功能进行了研究。

以前的证据表明,PPARα可以激活SIRT1在许多生物过程中发挥作用。奥卡河等人报道,PPARα/ SIRT1通路参与了心衰的进展促进线粒体功能障碍(26]。小川等人发现小胶质激活的镇压与SIRT1-dependent PPARα信号(27]。Sandoval-Rodriguez等人表明,PPARα改善非酒精性脂肪肝炎通过作用于SIRT1 [28]。然而,PPAR是否α/ SIRT1通路参与了NP发展还不清楚。CCI的老鼠,我们发现机械和热痛觉过敏是王寅- 14643组中表达下调,而共同服用si-SIRT1的和王寅- 14643将再次恢复损伤的老鼠。这些发现证明了PPARα/ SIRT1途径可能参与NP的发病机制。

探索PPAR的影响α炎症/ SIRT1的信号,我们发现炎性细胞因子的表达,发现CCI的炎性细胞因子明显增加了老鼠,但王寅- 14643治疗抑制了炎症。进一步治疗与si-SIRT1反向王寅- 14643的抗炎效应刺激。它表明,PPARα/ SIRT1的信号可能是相对于NP的炎症过程。结果符合PPAR的线索α参与了炎症通过调节SIRT1 [28]。此外,由于SIRT1能够抑制炎症抑制NF -κB (15,17),我们也决定SIRT1的水平和乙酰化NF -κB p65 CCI老鼠。王寅- 14643可以让SIRT1激活和脱去乙酰基NF -κB p65,但是GW6471 si-SIRT1会减少SIRT1的表达和移植Ac-NF——的表达κB p65。调节通路图所示5。

然而,仍然有限制在我们的研究中。目前,足够的证据支持的临床应用王寅缺乏为NP - 14643,和王寅的副作用- 14643是不确定的。因此,王寅- 14643的安全应该进一步考虑。我们还将进一步探索王寅- 14643在未来的安全。

总之,我们的研究表明,PPARα受体激动剂王寅- 14643减轻炎症通过SIRT1 / NF - NPκB通路。

数据可用性

所有的数据是可用的。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Wanshun温家宝和锦王做了实验,分析数据,并写了手稿。碧玉张和小君王设计实验和修订后的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。Wanshun温家宝和锦王co-first作者。

确认

作者感谢浙江省人民医院,武汉儿童医院,怀安第二人民医院的支持。