文摘

脓毒症的严重程度可能与过度的炎症,从而导致急性肝损伤。MicroRNA-21肝脏中高度表达的多种炎症相关的疾病,和PPARα也被证明参与调节炎症。在目前的研究中,LPS-induced脓毒症模型成立。我们发现microRNA-21表达式在脓毒症小鼠的肝脏,调节和microRNA-21抑制显著降低肝损伤。肝损伤标记物的表达,炎症细胞因子和PPARα在脓毒性小鼠高于antagomir-21治疗败血症的老鼠。此外,我们还发现,PPARα是microRNA-21的目标基因;PPARα拮抗剂GW6471可以反向antagomir-21的效果。总之,我们的研究表明microRNA-21加剧脓毒症的急性肝损伤小鼠通过抑制PPARα表达式。

1。介绍

脓毒症是一种常见的死亡原因在重症监护病房1]。这是一个全球公共卫生问题,每年大约有1900万人患有脓毒症(2]。脓毒症定义为一个“致命的器官功能障碍引起的管制宿主对感染“Sepsis-3会议(3]。脓毒症的急性肝损伤发生在任何阶段;肝细胞功能的失调可能与细胞激素风暴(4]。肝损伤可以不仅加重疾病的发展,而且导致死亡(5]。尽管迫切需要有效的治疗选择,许多新疗法并没有提高了生存率(6]。因此,了解脓毒症的发病机制对脓毒症的治疗非常重要。

过氧物酶体proliferator-activated受体配体依赖性转录因子(PPARs)属于核激素受体超科(7]。PPARα过氧物酶体的同种型proliferator-activated受体,调节脂肪细胞的分化,脂肪酸氧化,葡萄糖代谢8]。最近,新兴的证据表明PPARα激活能降低炎症反应通过促进NF -κB失活(9]。此外,肝脏PPARα表达式被发现在脓毒症被打扰。在脓毒症小鼠模型,肝脏PPARα表达显著与生存相关(10]。

微RNA是一类非编码RNA, 19 - 22日核苷酸长度(11),调节基因表达在转录后的级别的RNA降解消息或抑制其转录(12]。微阵列分析显示的upregulation microRNA-21在脓毒症患者13]。然而,在sepsis-induced microRNA-21肝损伤的作用尚未完全阐明。

在这项研究中,我们的目标是探索miR-21和PPAR的角色α在sepsis-induced肝损伤的发病机制。为了这个目的,我们使用antagomir-21抑制miR-21表达小鼠脓毒症模型和检测水平的促炎细胞因子(TNF -α,il - 1β和il - 6),肝损伤标记(AST、ALT)和PPARα表达式。

2。材料和方法

2.1。动物模型

所有雄性C57BL / 6小鼠获得湖北省疾病预防控制中心。老鼠被安置在一个无菌设施标准实验室饮食和水。8周时,老鼠收到三个retroorbital antagomir-21的静脉注射(5“-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3”;16毫克/公斤; ),antagomir控制(5“-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGUU-3”;16毫克/公斤; ),antagomir-21 + GW6471(16毫克/公斤;30毫克/公斤; ),磷酸盐水(PBS; )。6接受pbs老鼠被用作控制;收到的其他老鼠的腹腔内注射5毫克/公斤脂多糖引起败血症。在有限合伙人注射后24小时,所有老鼠都牺牲了。

所有的实验都是依照执行实验动物保健和使用指南公布的美国国立卫生研究院(2011)。

2.2。细胞培养

鼠标胆管上皮细胞和293 t细胞获得Newgainbio(无锡、中国)和DM / F12培养基培养或杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫,100 U /毫升青霉素和100年μg / mL链霉素低于5%二氧化碳在37°C。

2.3。荧光素酶报告实验

MiR-21模仿(5 ' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3 ')和NC-mimics (5 -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3)买来Ribobio(广州)。pGL3荧光素酶记者向量包含PPAR (Promega)α太(5“-AAAAAAUCUGUUAGAUAAGCUA-3”)和PPARα傻瓜(5 -AAUUAUAGUCAUACUAUUCGAA-3)序列cotransfected miR-21模仿或NC-mimics (50 nM)到293 t和MBDEC细胞。所有转染进行使用Lipofectamine 3000(美国表达载体)。24小时后的孵化,1×拉钮用来溶解细胞,测定和荧光素酶活动使用Dual-Luciferase记者分析系统(Promega)。

2.4。RNA隔离和存在

总RNA提取快速冷冻小鼠肝脏样本使用试剂盒试剂(美国表达载体)。MiR-21和mRNA水平被存在量化分析。microrna U6内生控制应用。对mRNA, GAPDH是作为内生控制。所有反应都是运行在ABI 7500实时PCR系统(美国生活技术)。使用2相对表达式计算- - - - - -ΔΔCT方法。在这项研究中使用的所有引物如下。

茎环结构RT MiR-21(底漆):5“-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA-3”

MiR-21-F: 5“-GTGCAGGGTCCGAGGT-3”

MiR-21-R: 5“-GCCGCTAGCTTATCAGACTGATGT-3”

U6-F: 5“-AGCCCGCACTCAGAACATC-3”

U6-R: R: 5“-GCCACCAAGACAATCATCC-3”

GAPDH-F: 5 ' -CGTCCCGTAGACAAA ATGGTGAA-3”

GAPDH-R: 5 ' -GCCGTGAGTGGAGTCATACTGGAA CA-3”

PPARα- f: 5“-AACCTGAGGAAGCCGTTCTGTGACAT-3”

PPARα- r: 5“-GACCAGCTGCCGAAGGTCCACCAT-3”。

2.5。ELISA

肿瘤坏死因子-α,il - 1β,肝脏或培养的上清液中的il - 6水平量化使用鼠标TNF -α预镀酶联免疫试剂盒,鼠标il - 1β预镀酶联免疫试剂盒,和鼠标il - 6预镀酶联免疫试剂盒,分别。

2.6。代谢分析

血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平测定使用VITROS350化学系统(美国强生(Johnson & Johnson)。

2.7。肝脏组织学分析

小鼠肝脏样本在4%多聚甲醛固定,然后与苏木精和伊红染色。肝损伤照片光学显微镜下观察和记录。

2.8。免疫印迹

肝脏样本提取使用的核内蛋白NE-PER™核提取试剂(美国热费希尔)。蛋白质是使用BCA量化分析(热费希尔,美国)。总蛋白(50μg)是由钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国微孔)。膜是孵化与主抗体(1:1000)在一夜之间在4°C。后HRP-conjugated二级抗体(1:5000)孵化;蛋白质乐队可视化使用西方发射极耦合逻辑清晰衬底(美国Bio-Rad)。

2.9。统计分析

学生的 测试和单向方差分析是用来分析组织之间的意义。 被认为是具有统计学意义。数据分析使用SPSS 22.0(美国芝加哥IBM),并使用GraphPad棱镜8.3.0数据设计。

3所示。结果

3.1。表达miR-21增加在脓毒症小鼠的肝脏

根据动物实验进行设计(图1(一))。这些老鼠被牺牲后,我们收集小鼠的血清和肝脏孤立。随后,miR-21的表达在肝脏被发现使用中存在(图1 (b))。结果表明,脓毒性小鼠miR-21表达显著调节;然而,注入antagomir-21完全封锁了upregulation miR-21,这表明脓毒症小鼠模型与miR-21抑制被成功建立。

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图1
MiR-21表达提高脓毒症小鼠的肝脏。(一)老鼠研究设计。(b) miR-21表达式在广式小鼠肝脏处理PBS (WT)和LPS-induced老鼠接受PBS, antagomir-21控制(数控),antagomir-21 (A21) antagomir-21, PPARα拮抗剂GW6471 (A21 + G)。存在分析被用来检测miR-21的表达。 。
3.2。Antagomir-21降低脓毒症小鼠肝损伤和炎症

进一步研究函数的miR-21 sepsis-induced肝损伤,我们下一个评估的病理损害肝脏和促炎细胞因子的水平。如数据所示2(一个)和2 (b),脓毒性小鼠的肝脏损伤程度显著增加。Antagomir-21政府减轻肝损伤;然而,在antagomir-21 GW6471共同服用组,肝损伤的程度没有变化。如预期在这些小鼠脓毒症,肝损伤标志物的表达(血清血清AST和ALT;数据2 (c)和2 (d))和促炎细胞因子(TNF -α,il - 1β和il - 6;数据2 (e)- - - - - -2 (j))被antagomir-21明显减少。然而,GW6471恢复这些细胞因子的水平。总结以上结果,它表明,miR-21抑制强烈降低脓毒性小鼠的肝损伤和炎症。但miR-21抑制产生的影响被PPAR逆转α拮抗剂GW6471。

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Antagomir-21减少肝损伤和炎症。(a, b)肝脏的组织学分析。组织损害在0 - 4的规模,与0,1,2,3,4对应于0%,< 25%,26% -50%,51% -75%,≥76%的肝损伤,分别。(c, d)血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)水平。(eg) ELISA试验是用来确定肿瘤坏死因子的水平α,il - 1β,il - 6在肝脏。(设定h) ELISA试验是用来确定肿瘤坏死因子的水平α,il - 1β和血清中il - 6。 , 。
3.3。MiR-21直接与PPAR交互α

众所周知,microrna参与各种生理活动的调节基因表达的转录后的水平。调查miR-21在脓毒症的分子机制,我们使用TargetScan来识别潜在的基因,和PPARα被发现脓毒症最相关的基因之一。母星(http://starbase.sysu.edu.cn)是用来预测PPAR之间的假定的结合位点α和miR-21(图3(一个))。荧光素酶报告实验进行测试是否miR-21可以直接绑定到PPARα。如图3 (b),在293 t和PPAR cotransfected MBDEC细胞αWT miR-21模仿,荧光素酶活性显著降低,但没有PPAR的变化α无足轻重的人。结果表明,PPARα是miR-21的目标基因。

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图3
MiR-21直接与PPAR交互α。(一)之间的假定的结合位点PPARA WT miR-21。(b)的荧光素酶活性检测荧光素酶记者向量窝藏PPARA WT /狗序列和miR-21模仿cotransfected 293 t和MBDEC细胞。 。
3.4。通过恢复PPAR Antagomir-21减少肝损伤和炎症α表达式

为了进一步验证是否miR-21调节PPAR的表达α在肝脏。我们发现了PPARα五组的肝脏中表达;三个肝脏样本是随机选择从每个组(数字4(一)和4 (b))。从肝组织的总RNA提取,从原子核中提取的蛋白质。结果表明,PPARα表达在PBS和AC组与WT组相比明显减少。此外,增加了PPAR antagomir-21治疗α肝脏中表达,但GW6471抑制PPAR的水平α核蛋白质。聚集所有的结果,我们发现antagomir-21减轻肝损伤和炎症的恢复PPARα表达式。

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图4
通过恢复PPAR Antagomir-21减少肝损伤和炎症α表达式。(一)PPAR的表达α信使rna在肝脏中存在探测到。(b) PPAR的表达α核蛋白质肝脏利用免疫印迹检测。 。

4所示。讨论

本研究表明miR-21抑制衰减LPS-induced脓毒症小鼠肝损伤,增效PPARα表达式,它提出了一个的贡献miR-21 sepsis-induced肝损伤的发病机制。此外,antagomiR-21和PPARα代表在脓毒性小鼠抗炎活动。这些发现表明,miR-21 / PPARα途径可能在脓毒症治疗作为一个潜在的目标。

促炎状态是脓毒症的关键特性,和肝脏炎症中起着重要的作用14]。据报道,miR-21调节各炎性疾病,包括心肌损伤(15),非酒精性脂肪肝炎16),和骨关节炎17]。然而,miR-21在脓毒症中的作用尚未完全阐明。首先,我们确认miR-21表达升高LPS-induced脓毒症小鼠的肝脏。然后,调查miR-21在脓毒症的分子机制,我们筛选了一些基因miR-21结合位点。先前的报道表明,PPARαNASH患者的肝脏表达减少,和PPARα激活抑制肝纤维化小鼠(18,19]。这些研究推动我们验证miR-21和PPAR之间的联系α。随后,我们发现在肝脏脓毒症小鼠模型中,PPARα表达时减少miR-21表达增加。此外,PPAR antagomir-21恢复α表达和减毒sepsis-induced肝损伤,而PPARα拮抗剂GW6471阻塞antagomir-21在肝损伤的抑制作用。总之,我们的研究表明,通过PPAR miR-21调节肝脏炎症α抑制。

然而,我们的研究有一些局限性。最近的研究报道,miR-21主要是表现在胆道炎症细胞在肝脏,而非肝细胞。在这项研究中,细胞的来源miR-21不是阐明;miR-21 / PPAR的功能α轴需要进一步探讨。

此外,miR-21和PPAR激动剂被认为是制药目标(20.,21]。本研究表明,mir-21 / PPARα通路可能是一个有趣的脓毒症治疗的新策略。然而,一些PPAR激动剂有副作用,使他们停止(22],mir-21对抗治疗也可能有副作用。因此,严格的研究设计和安全监测是必不可少的。

总之,在LPS-induced脓毒症小鼠模型,我们表明,miR-21贡献sepsis-induced肝损伤和炎症通过抑制PPARα表达式。因此,这项研究可能为脓毒症的治疗提供一个有吸引力的潜在目标。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者证实不存在利益冲突。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81601670)和湖北省自然科学基金(2014 cfb302)。我们衷心感谢所有实验室成员。