文摘
吡格列酮(Pio)是一个thiazolidinedione (TZD) insulin-sensitizing药物的影响结果主要从其调制的过氧物酶体的转录活动proliferator-activated-receptor-gamma (PPARγ)。Pio用于治疗人类胰岛素抵抗糖尿病也经常被认为是治疗非酒精性脂肪肝(NASH)。在这两个设置,Pio的有利影响被认为结果主要来自脂肪PPAR其行动γ活动,可以改善胰岛素敏感性,降低脂肪酸对肝脏的交付。然而,最近的一项临床试验显示变量在人类纳什Pio的功效。肝细胞也表达PPARγ等表达增加胰岛素抵抗与非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。此外,小鼠肝细胞过表达PPARγ并与肝外PPAR Pio-treated老鼠γ非酒精性脂肪肝的基因中断发展特征。因此,Pio的直接影响肝细胞基因表达也可能是一个行列式的这种药物对胰岛素抵抗与非酒精性脂肪肝的最终影响。先前的研究已经Pio的PPAR特点γ端依赖影响肝的表达特定的脂肪形成的,脂肪生成的,和其他代谢基因。然而,这样的转录调控尚未全面评估。这里的研究报道地址,考虑Pio的全基因组比较肝脏转录在野生型(WT)和肝脏特异性PPAR的影响γ击倒(KO)老鼠控制或高脂肪的饮食(HFD)。结果发现大量的肝Pio的肝脏PPAR的基因γ端依赖转录效应整合其影响RXR-DNA绑定在WT老鼠。这些数据还表明,HFD修改Pio的影响转录调控等的一个子集。最后,我们的研究结果揭示了PPAR Pio的更广泛的影响γ端依赖肝核基因编码线粒体蛋白质的表达比先前承认。综上所述,这些研究提供新的见解对Pio影响肝基因表达的组织机制和广泛的这种药物对这种监管的影响的范围。
1。介绍
吡格列酮(Pio)是一个thiazolidinedione (TZD)核激素受体的激动剂(NHR)过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγγ)。Pio-bound PPARγ形成一个异质二聚体类维生素a X受体(RXR [1]),PPARγrxr复杂与特定过氧物酶体扩散国的反应元素(ppr)的DNA来调节代谢和其他基因表达在脂肪和其他组织(2]。Pio有利影响胰岛素敏感性和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)在实验动物模型3- - - - - -7),而这种药物被批准用于治疗胰岛素抵抗糖尿病在人类8]。Pio人类非酒精性脂肪肝(NASH)的疗效,与胰岛素抵抗密切相关,最近调查”πoglitazone与V维生素E与安慰剂治疗的非糖尿病患者Nonalcoholic年代teatohepatitis”(即。佩文)临床试验9]。结果显示良好Pio-induced纳什活动在一些研究对象的变化。然而,大多数Pio-treated佩文主题没有表现出从治疗中受益。这些观察结果表明仍然未知基因和/或环境因素作为修饰符Pio的生理效应在小鼠和人类。其他的研究已经显示组织PPAR的影响γ规范化的目标Pio,非酒精性脂肪肝的实验模型。例如,肝细胞PPARγ超表达诱发肝脂肪变性(10),而肝脏特异性PPARγ破坏防止肝脂肪堆积在鼠非酒精性脂肪肝模型11- - - - - -13]。相反,肌肉- [14]或adipocyte-specific PPARγ删除促进肝脂肪变性(15),这是与PPAR的想法一致γ活动在脂肪,或许肌肉,介导Pio的功效对非酒精性脂肪肝(16]。其他的研究表明,肝PPARγ表情,尽管低于肝PPARα表情,仍然是显著诱导实验和人类非酒精性脂肪肝(17- - - - - -19]。综上所述,这些因素引发了有趣的可能性,Pio的变量影响人类的非酒精性脂肪肝佩文试验(9)可能导致至少部分从遗传或环境的影响在肝PPAR修饰符γ表达和/或转录活动。
PPARγ独立Pio的影响也被牵连的候选人介质Pio的有利影响肝脂肪变性的实验模型。例如,这种药物的直接影响线粒体丙酮酸载体蛋白(MPC)最近被确认为一个可能的贡献者在非酒精性脂肪肝(Pio的有利影响20.,21]。的确,考虑发展中PPAR刺激了新的兴趣γ服用tzd保留作为小说药理方法人类非酒精性脂肪肝避免TZD-associated副作用。其他的研究已经确定了Pio和PPAR有益的影响γ在实验模型中对线粒体功能的非酒精性脂肪肝(22和其他疾病23]。尽管Pio的PPARγ端依赖对肝的影响特定的脂肪形成的和其他基因的表达研究[10,12,13,24),这种监管的全面评估、特别是肝线粒体基因表达没有被报道。此外,遗传或环境修饰符是否影响这样的控制仍然是未知的。这里的研究报道解决这些问题通过测试的假设饮食改变Pio-induced liver-PPARγ端依赖监管肝基因表达和全面描述这种监管在老鼠身上。我们的研究结果提供了新的见解Pio和肝细胞PPAR的组织机制γ交互影响肝基因表达和产生影响的变量功效Pio的佩文审判。
2。实验方法
2.1。小鼠饲养
肝脏特异性PPARγ敲除小鼠(KO)被繁殖PPAR生成γ-loxP老鼠(杰克逊实验室,巴尔港,我)转基因Alb-Cre (B6。Cg-Tg (Alb-Cre) 21内侧膝状核/ J,杰克逊实验室)老鼠如前所述25]。两个月大的雄性KO或控制(即。野生型(WT) C57BL6 / J;杰克逊实验室)自由进入无菌小鼠接受广告,辐照低脂(S4031 BioServ,弗兰,NJ)或高脂肪(S3282 BioServ;千卡60%来自脂肪)饮食,有或没有0.01% ( )盐酸吡格列酮(Pio Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)3个月( )。每周体重测量和身体成分分析实验端点通过回波核磁共振光谱(26];之后,小鼠安乐死组织获取和分析。血糖、血清胰岛素和游离脂肪酸水平,和肝脏组织学和甘油三酸酯含量测定(如前所述)(25- - - - - -27]。华盛顿大学机构批准的所有实验动物保健和使用委员会(IACUC),和所有的动物获得了人道关怀根据机构的指导方针和标准的“指导护理和使用实验动物”(8th2011年版,https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf)。
2.2。肝脏转录组分析(RNA-Seq和RT-qPCR)
总肝RNA纯化采用试剂盒法(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。图书馆是由多聚腺苷酸的选择10μ克肝RNA表达载体使用信使RNA直接™工具。信使rna是支离破碎的互补脱氧核糖核酸的合成,通过使用表达载体上标三世和随机五个一。互补脱氧核糖核酸是修理结束,和结扎A-tailed,标准Illumina公司适配器。图书馆是放大与引物在每个样本中加入一个唯一索引。RNA-seq读取对齐到运用释放76 GRCm38 2.0.4b组装与明星版本。基因数量来源于独特的数量一致明确的读取Subread: 1.4.5 featureCount版本。
所有能够计数然后导入3.4.1 R版本,和TMM标准化规模因素计算调整样本库的差异大小与Bioconductor 3.20.2包磨边机版本。基因表达小于1计数每百万在不到5样品,和核糖体基因被排除在进一步分析。TMM大小因素和矩阵的计数然后导入到R / Bioconductor包Limma版本3.34.4 [28,29日),并根据观察到的均值-方差加权可能关系每一个基因被计算为所有样本voomWithQualityWeights函数。然后评估样品的性能与斯皮尔曼相关矩阵多维标度图和主成分分析。基因表现评估块剩余标准差的每一个基因与平均log-count强劲的拟合残差的趋势线。与鲁棒分散估计广义线性模型被创建测试基因/转录水平微分表达式。差异表达基因和转录被过滤为罗斯福调整的值 (30.,31日]。提高生物的解释大量的记录,被讯问群体中筛选基因列表使用超几何特征基因集测试可以通过Broad研究所的分子签名数据库(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/annotate.jsp(32,33),)。扰动在表达这些基因集和背景信号与R包规版2.28.0评估。
肝表达模式的差异表达的基因识别RNA-Seq被证实使用实时半定量rt - pcr (RT-qPCR)分析如前所述27补充表中列出)的寡核苷酸引物S1。
2.3。RXR染色质免疫沉淀反应(芯片)和高通量DNA测序(Seq)
RXR ChIP-Seq之前进行使用方法类似于一个用于acetyl-histone ChIP-Seq [27,34]。短暂,冷冻肝脏碎,1%甲醛交联,均质,和悬浮在核裂解缓冲的蛋白酶抑制剂,然后离心染色质中恢复过来,在一个Bioruptor剪切超声发生器(Diagenode Denville,新泽西)生成统一的100 - 500碱基对(bp)碎片。相等数量的染色质(基于蛋白质含量)免疫沉淀反应使用ChIP-grade anti-RXRα/β/γ抗体(sc - 774;圣克鲁斯生物技术公司,贝弗利,MA)之前验证和用于RXR ChIP-Seq肝组织的研究(35,36]。这里的研究报道坚持准则和实践建议ChIP-Seq分析和质量控制的数据(即DNA百科全书的元素。、编码和modENCODE)财团指南(37]。这些包括建议验证目标转录因子芯片的特异性抗体的免疫印迹(补充图S1),并评估每个复制的染色质免疫沉淀反应质量指标包括NSC, RSC, Qtag分数,不能复制的发现率(IDR)数据。中描述的补充材料,评估这些指标在这里遇到编码指南的标准(如详细描述支持信息)。值得注意的是,这里的复制肝脏研究来自不同动物而不是独立的细胞培养,胚胎池,或组织抽样占大多数编码实验的基质。根据,我们预期增加的可能性变化时考虑到实验设计,这促使我们使用肝脏样本每个5鼠标复制/集团保留所有复制这些分析,应用下面描述的额外的保守派数据分析。
免疫沉淀反应dna和相应的输入样本提交给吴做冲结束,适配器结扎,大小选择和放大根据建立协议,如前所述27,34]。图书馆使用Illumina公司测序hiseq - 3000单50个基点。原始数据去复用,对齐参考基因组组装(如最近的老鼠。使用Novoalign mm10) (Novocraft;雪兰莪州,马来西亚)。序列峰值被确定通过比较数据anti-RXR抗体免疫沉淀反应为每个复制使用MACS2[对应输入样本38]。峰值有关使用峰值基因注释和可视化(PAVIS)软件(39]。实验团体之间的显著差异相关的基因序列峰值丰度测定使用DiffBind,一个开源Bioconductor方案,利用磨边机软件复制序列计数数据的统计分析(30.,31日]。这些分析使用Benjamini业务和错误发现率(罗斯福)的阈值 (40,41]。我们还应用以下额外的保守派:(i)≥2倍的变化RXR liver-DNA DiffBind定义的绑定实验组之间,(2)识别相关的基因RXR-bound mac的峰值至少3(4 - 5)复制在每个实验组增加绑定。基因集合群体分析是进行基因差异受RXR RNA-Seq数据描述使用方法分析。
努力开展PPARγChIP-Seq分析肝脏样品也试图在这里,但这些努力成功基于PPAR无法识别γ抗体会议编码指南当测试老鼠肝脏(如上总结和详细描述了支持信息;j . s . Kulkarni黄,D.A.鲁德尼克,未发表的观察)。因此,为了评估肝脏PPARγ依赖RXR肝DNA结合的研究样本,从WT RXR-ChIP-Seq研究进行了肝脏,肝脏特异性PPARγKO小鼠和结果比较。
2.4。维恩图解分析和绑定和表达目标分析(β)
Interactivenn [42])是用来确定和说明之间的重叠基因识别差异表达或不同RXR-bound团体之间。相比RXR ChIP-Seq和RNA-Seq数据集也使用“绑定和表达目标分析”(β)软件(43]。β是一个公开可用的软件包集成芯片和RNA-Seq的数据来推断cis-acting调节器的功能(在本例中RXR-DNA ChIP-Seq定义的绑定数据)在gene-specific模式表达式(RNA-Seq所定义的数据)。这里,RXR-ChIP-Seq-defined峰值识别为不同RXR-bound之间组( )进入测试算法(作为床使用的格式文件:染色体数目,染色体开始轨迹,和染色体末端轨迹)。差异基因表达数据,提取RNA-Seq数据分析,提供软件(作为一个文本文件一样使用格式:ID、基因表达变化,和罗斯福)。β算法分配一个等级和rank-product基因,与更高的排名和更低的将产品相应基因的表达变化更可能是由转录factor-DNA绑定事件。推断Pio的影响,肝PPARγ表达式和HFD暴露RXR-dependent肝脏基因表达是基于对比实验组。
2.5。统计分析
芯片和RNA-Seq数据集进行了分析如上所述。所有其他数据分析使用SigmaPlot 13.0 (Systat软件公司,圣何塞,CA)。数值数据对比组用未配对的双尾的学生 - - - - - -为多个组测试成对比较和方差分析。二次事后比较使用Holm-Sidak进行正态分布数据或图基不是正态分布的数据。卡方分析是用来比较利率和团体之间的比例。意义(α)被设定为0.05。数据报告 错误。
3所示。结果
3.1。Pio有截然不同的效果在WT与肝脏特异性PPAR老鼠的新陈代谢γ和HFD KO小鼠给予控制
Unsupplemented——或者Pio-supplemented-control(即。“控制”或“Pio”)或高脂肪(即。,“HFD” or “HFD-Pio”) diets were given to male WT and liver-specific PPARγKO小鼠从2岁到5个月。初始治疗组(即之间身体重量可比。,±Pio, ±HFD) but significantly greater in 2-month-old WT versus age-matched KO mice (Supplementary FigureS2)。由实验端点,5个月大的孩子WT老鼠暴露在Pio, HFD或HFD-Pio显示明显更大的体重和脂肪质量分数相对于控件(数字1(一)- - - - - -1 (d))。相比之下,KO小鼠显示有限的变化体重和体脂百分比质量没有变化反应要么干预。与这些结果一致,质量精益,脂肪,脂肪量百分比也明显高于HFD和HFD-Pio-treated WT老鼠相比,相应的科斯。Nonfasting点血清胰岛素和血糖水平可比所有实验(数字1 (e)- - - - - -1 (f))。HFD-exposed WT老鼠显示增加血清脂肪酸(FFA)相比,控制和Pio-treated WT老鼠,而控制和Pio-treated KO小鼠血清FFA的增加而相应的WT展出动物(图1 (g))。最后,Pio和饮食的影响肝脏甘油三酯含量和肝细胞肝脂肪变性取决于PPARγ表达式:Pio增加肝脏脂肪含量在WT老鼠控制饮食,但这些措施在减少相应的KO小鼠和HFD-exposed KO小鼠显示降低肝脂肪变性肝甘油三酯和低于相应的WT老鼠(数字1 (h)和2)。综上所述,这些数据显示明显的肝代谢反应和系统性Pio没有和HFD和定义肝细胞PPAR的存在γ依赖的影响。
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3.2。饮食修改一些Pio在肝基因表达的影响
接下来,Pio的影响在WT小鼠全基因组的肝基因表达模式控制或HFD决心,与结果相比,肝脏特异性PPAR的相应分析γKO小鼠。首先,建立该方法的有效性,这些转录组数据首次检查模式Pio-induced, PPARγ端依赖改变肝PPAR的规范化脂肪形成的和脂肪生成的基因的表达γ调节肝脏表达曾被报道(10,12,13,24]。符合这样的公布的数据,这里的转录组数据报告显示Pio-induced肝1(窖蛋白的表达Cav1),Cd36,补充因子D (计算流体动力学也称为脂肪酶),Cidec(也称为Fsp27),Fabp4(也称为Ap2),Mogat1,Plin4(也称为S3-12)在WT但不是KO小鼠控制饮食(图3(一个))。进一步的分析还表明,Pio诱发Cd36,计算流体动力学,Cidec,Mogat1,Plin4但不是Cav1或Fabp4在HFD WT老鼠。至于老鼠在控制饮食,Pio也没有显著影响这些基因的表达HFD-treated KO小鼠(图3 (b))。最后,为了进一步验证我们的转录组数据,基于RNA-Seq结果图中描述3比较基于RT-qPCR分析各组在这些范例基因的差异表达,后者研究的结果(补充图吗S3)高度整合与前(图3)。这些数据与以前公布的PPAR的分析一致γ端依赖肝转录的影响,表明饮食作为一种特定的修饰符的效果。
(一)
(b)
接下来,这些转录组数据进行主成分分析(PCA)。结果显示良好的隔离复制的WT小鼠暴露于药物(±Pio)和饮食(±HFD)(图4(一))。相比之下,相应的KO复制显示可怜的分离(图4 (b))。同样,热图分析Pio-induced肝基因表达的变化也显示更多的忠实的隔离WT与KO实验复制(数字4 (c)和4 (d))。与图中的范例基因表达数据一致3,维恩图解分析模式重叠的这些数据确定的基因子集Pio-induced肝表达式是认识提高监管在控制或HFD WT老鼠,和其他人的Pio-induced监管被HFD改变(图4 (e))。这种分析还显示之间缺乏一致性Pio KO小鼠的肝脏转录效应控制和HFD,此外,Pio没有显著影响肝基因表达在KO小鼠HFD(图4 (f))。交谈的结果分析,比较饮食对小鼠的影响有或没有Pio曝光,提供进一步支持的修改影响饮食对Pio-induced肝基因表达的变化(数据4 (g)和4 (h))。综上所述,这些数据显示饮食和肝细胞PPAR之间的相互作用γ表达影响Pio-induced肝基因表达的变化。
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进一步探讨膳食影响Pio-regulated肝基因表达的变化,那些标示为差异表达的基因的研究总结在图4受到基因群体分析使用标志基因集合数据库,Broad研究所平台(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/annotate.jsp(32,33),),以及最严格的罗斯福阈值截止在该平台上(例如, )。这个评估识别重要的浓缩Pio WT小鼠的肝脏引起的基因在控制饮食对于那些与代谢和其他功能类别(表1(a))。高纯度的分组,脂肪酸代谢、脂肪形成,和胆汁酸代谢,也认定为丰富的基因诱导Pio WT老鼠HFD(表1(b))。然而,这个分析也显示不同的肝Pio转录的影响在控制和HFD WT老鼠,包括特定的浓缩与肝脏中胆固醇体内平衡相关的基因控制而不是HFD饮食的老鼠,老鼠和糖酵解HFD但不控制饮食(表1(a)和(b))。这些转录组数据也受到规分析基因表达水平变化,和独立的评估结果这些数据是高度整合与基因集群体研究(补充表S3)。例如,计检查还发现了浓缩Pio-induced与脂肪酸代谢相关的基因,脂肪形成,和胆汁酸代谢在老鼠的饮食,但具体富集胆固醇体内平衡的基因在小鼠控制饮食和糖酵解HFD基因在小鼠体内。基因的肝脏表达抑制Pio的WT老鼠类似的评估和控制和HFD-treated老鼠还显示明显差异。例如,抑制的Pio WT老鼠控制饮食丰富在许多不同的类别,包括紫外线和血红素代谢反应,而抑制Pio的老鼠HFD没有显著富集对任何基因类别以这种方式分析(表1C和D)。至于Pio-induced基因,结果GAGE-based调查这些数据也很和谐的基因传播的分析(补充表S3)。类似的肝脏特异性PPAR肝脏转录组的调查γKO小鼠,使用基因组代表GAGE-based分析,确定不同的饮食影响Pio-induced模式和Pio-suppressed基因在这些WT老鼠相比(表2与表1和补充表S3)。在这种情况下,基因分析表明,传播Pio的抑制效应在KO小鼠肝基因表达控制饮食和归纳和抑制效应在KO小鼠HFD几乎检测不到(表2罪犯)。逆向分析,饮食的影响没有或Pio的存在,显示更大范围的饮食影响Pio-treated比未经处理的WT老鼠和明显减少饮食KO小鼠(数据的影响4 (g)和4 (h)和补充表S4和S5)。综上所述,这些数据提供了饮食对PPAR的修改影响的证据γ端依赖,Pio-induced肝基因表达的变化。
3.3。PPARγ端依赖Pio和HFD对肝脏的影响RXR-DNA绑定是高度整合与相应的对肝基因表达的影响
进一步描述Pio的直接作用于肝脏转录调节、Pio的后果和HFD gene-specific RXR-binding肝DNA WT和KO小鼠相比,RXR-chromatin-immunoprecipitation结合下一代DNA测序(ChIP-Seq)。结果发现特定RXR-DNA结合位点在治疗和Pio-treated WT在控制或HFD老鼠。他们还透露Pio-induced这样绑定的差异在一些网站。在大多数情况下,Pio增加RXR-DNA约束力,但网站的RXR-DNA绑定抑制Pio也确认(数字5(一个)- - - - - -5 (c))。这种分析还表明,Pio对gene-specific有着更广泛的影响RXR-liver DNA结合在控制和HFD WT小鼠,与大多数结合位点中确定HFD-treated老鼠老鼠在控制饮食中还发现了但是很多结合位点在小鼠中发现控制饮食没有发现那些在HFD(图5 (d))。因此,这些数据进一步证明修改影响饮食Pio-induced肝脏转录监管,他们暗示食源性Pio的差异直接影响肝脏RXR-DNA绑定作为一个影响机制。超过一半的Pio-induced RXR-liver DNA结合位点WT老鼠在饮食中检测到发生在特定基因的外显子和内含子,绑定到5或3未翻译区(utr),上游、下游,或其他网站占其余的绑定(图5 (e))。而并行分析KO小鼠还发现了RXR-liver DNA结合位点(图5 (f)),在这种情况下,只有极少数网站重要的(例如, )Pio-induced RXR绑定被确定(图的变化5 (g))。此外,大多数的网站显示Pio-inhibited绑定(图5 (g)),没有经受住了额外的保守派的分析方法(图5 (h)和实验方法)。HFD进一步分析影响这种监管发现少量的不同绑定在WT老鼠基因缺乏Pio,没有在WT老鼠Pio的存在或KO小鼠有或没有Pio(数据没有显示)。在一起,这些数据定义Pio的PPARγ端依赖影响诱导gene-specific RXR-liver DNA结合在老鼠的饮食。他们还透露,HFD暴露减弱Pio等转录调节的影响。
(一)
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接下来,基因设置超几何测试进行基因表现出Pio-induced RXR-liver DNA结合在WT老鼠控制(表3一)或HFD(表3B)。结果显示,许多相同的类别被浓缩Pio-induced分析(表1A和B)或Pio-suppressed(表1C和D)肝基因表达。这些观察暗示Pio-induced变化RXR-liver DNA结合transcription-inducing在某些情况下,transcription-suppressing他人。然而,一些种类丰富的基因表达诱导(即。,在表1)并不是同样被这些分析RXR-liver DNA结合(即。,在表3A和B),包括胆汁酸代谢和胆固醇体内平衡。据推测,这一发现的结果transcription-altering Pio在肝基因表达的影响(表1A和B)是肝细胞PPAR的独立γ表达,肝RXR活动,或两者兼而有之。例如,最近描述直接影响线粒体丙酮酸载体蛋白Pio的活动(20.,21]可能间接转录的后果。相反,其他类别确定为丰富RXR-bound基因表3A和B没有确定的基因集RNA-Seq数据分析表1展开,包括糖酵解和蛋白质反应,RXR-binding这些基因的意义网站对转录监管是不确定的。最后,这些研究没有确定任何分类基因集富集在基因与RXR-liver Pio-mediated抑制DNA绑定(表3C和D),他们也没有展示任何Pio -或HFD-induced差异在这样绑定KO小鼠(表3情况)。综上所述,这些数据显示整体PPAR之间的一致性程度高γ端依赖和Pio-induced影响RXR-liver DNA结合和微分肝的特定基因的表达,和他们进一步表明饮食作为修饰符的监管。
3.4。整合Pio的影响肝脏RXR-DNA绑定和肝脏转录
最后,进一步描述和阐明Pio-induced饮食的影响,PPARγ端依赖肝转录调控,RNA和ChIP-Seq相互生成数据集相比,这些研究都使用“绑定和表达目标分析”(β(43),)算法。这个分析工具被开发来推断在特定的转录因子基因调控目标。结果发现760基因受RXR Pio和1066 RXR-bound基因抑制Pio WT老鼠在控制饮食,和420年诱导基因的目标和531年镇压RXR-bound Pio HFD WT老鼠(图所示6(一))。大多数基因被分析为诱导或抑制Pio的老鼠在控制饮食并没有类似的发现在老鼠在HFD(图6(一))。然而,基因集代表分析并证明之间的高度一致性分类术语标识为丰富RXR-bound基因控制或HFD Pio引起的。这些类别包括氧化磷酸化、脂肪酸代谢,Myc目标(表4A和B)。具体Pio-regulated基因丰富的进一步检验这些集显示大量的核基因编码线粒体蛋白质参与氧化磷酸化。这些基因包括组件的复合物I-IV,线粒体ATP合酶,以及转运蛋白、离子通道、酶参与三羧酸循环,和其他外膜,膜间隙,内膜,矩阵线粒体蛋白质(图6 (b))。此外,几乎所有的特定的线粒体蛋白质编码基因识别以这种方式控制饮食诱导的小鼠没有诱导小鼠HFD,,相反,大多数在HFD-treated诱导的小鼠没有老鼠同样调节控制饮食。因此,这种分析还表明,饮食诱发独特Pio的具体变化对核基因编码线粒体蛋白质转录的影响。基因集合代表分析RXR-bound基因抑制WT Pio的老鼠也进行,结果显示功能类别丰富之间没有重叠压制来自老鼠的基因控制和HFD。例如,与展开的蛋白质反应相关的基因被浓缩在镇压的Pio WT老鼠在控制饮食而不是HFD(表4C和D)。这些结果提供进一步证据的修改影响饮食对Pio的肝脏转录的影响。最后,差异RXR肝DNA结合KO小鼠中发现不足,允许相应的β分析这些数据(图5 (g)和5 (h))。
(一)
(b)
4所示。讨论
PPAR先前发表的研究报道γ端依赖服用tzd对肝的影响个人的利益目标基因的表达通过比较肝在WT与PPAR这些特定基因的表达γ-overexpressing或肝脏特异性PPARγKO小鼠(10,12,13,24]。最近这样的研究,回顾了(44),表明肝PPARγ表达调节肝脏中脂肪形成的基因的表达和调节肝外脂质积累和胰岛素敏感性。然而,这里的研究报告是第一个全面描述这样的转录调节(通过RNA-Seq),比较结果PPAR的全基因组评估γ端依赖,Pio-induced影响肝脏RXR-DNA绑定(ChIP-Seq),和整合这些数据集(β)。结果显示(i) Pio liver-PPARγ端依赖肝转录作用高度整合的影响肝脏RXR-DNA绑定在WT老鼠的饮食。(2)HFD修改Pio等转录调节的影响。(3)对PPAR Pio有着更广泛的影响γ端依赖肝核基因编码线粒体蛋白质的表达比此前的报道。这些数据提供新的见解Pio的分子和细胞机制和肝细胞PPARγ交互影响肝基因表达。他们还提出了这样的可能性,那就是饮食是一个修饰词Pio的人类非酒精性脂肪肝疗效。这种功效是变量在受试者参加佩文试验(9]。符合先前发表的工作(10- - - - - -13),我们的数据也表明,肝细胞PPAR(我)γ超表达诱发肝脂肪变性。(2)肝脏特异性PPARγ中断保护小鼠免受HFD-induced非酒精性脂肪肝。(3)TZD管理局(Pio)刺激肝脏脂肪堆积在WT但不是肝脏特异性PPARγko小鼠。其他研究也表明,肝外组织(即肌肉,14)或脂肪细胞(15])PPARγ删除促进NAFLD和TZD-treatment加重脂肪肝在阳性PPARγKO小鼠(14]。综上所述,我们的数据和这些因素也符合变量响应Pio人类非酒精性脂肪肝的可能性可能会决定,至少部分由之间的平衡对肝和肝外(即TZD的影响。,脂肪或者PPAR骨骼肌)γ活动。
这里的研究是第一个比较肝脏RXR cistrome Pio-induced变化和肝肝细胞PPAR转录组γ依赖的这些变化。然而,类似的分析其他RXR-binding metabolic-sensing核激素受体(NHRs)已报告。例如,的影响farnesoid X受体(FXR)受体激动剂obeticholic酸FXR-DNA绑定和基因表达在人类和小鼠肝组织最近报道(45]。公布的数据允许我们的可用性比较和对比基因的表达显著诱导或抑制obeticholic酸研究那些认为这里是受Pio WT老鼠肝脏。结果显示不同的肝脏转录FXR受体激动剂(obeticholic酸)的影响研究和PPAR的γ受体激动剂(Pio)研究(图7(一))。另一个最近的研究报道RXR-liver DNA结合的影响肝X受体(LXR)受体激动剂(即。,T0901317 [35])。我们也公布的数据进行对比描述Pio-induced gene-specific RXR-liver DNA结合。分析还显示很少重叠T0901317和Pio-induced RXR-DNA绑定签名(图7 (b))。这些结果是一致的,特定药物受体激动剂的不同metabolic-sensing NHRs(例如,Pio / PPARγobeticholic酸/ FXR和T0901317 / LXR)诱导不同对RXR-liver DNA结合和肝脏转录调节的影响。这一结论提出了一种可能性,也涉及其他研究[35,46- - - - - -48),“相声”RXR-binding不同NHRs NHR-ligand影响基因表达模式的一个重要因素。这些因素也一致认为药物有明显NHR-binding活动互相竞争和内源性NHR配体对RXR-dependent转录调控起到独特的作用。这一概念,假设模型如图所示7 (c),增加了额外的考虑的特定组合不同NHR兴奋剂药物添加剂有益的(或者,相反,有害的)对实验的影响(也许人类)非酒精性脂肪肝会被发现使用本文描述的方法(49]。例如,obeticholic酸Pio一样,也是最近报道在人类非酒精性脂肪肝疗效[50]。因此,未来对Pio的组合效应的评估和obeticholic酸在转录调控和肝脏疾病在实验非酒精性脂肪肝模型可能通知考虑新的NHR-agonist组合干预试验越来越普遍的疾病。
(一)
(b)
(c)
Pio此前报道提高体内肝线粒体功能障碍的非酒精性脂肪肝小鼠模型(22]。虽然对肝线粒体蛋白表达的影响没有进行研究,其他调查显示Pio刺激线粒体移植特定PGC1生源论α监管目标基因表达在肝外组织(51- - - - - -53]。观察,连同这里的数据报告显示,Pio广泛诱发肝脏PPARγ端依赖RXR绑定和肝的表达许多核基因编码线粒体蛋白质(图6 (b)),表明这种监管作为一个合理的机制Pio发挥其有益的代谢影响。然而,老研究矛盾的报道,服用tzd Pio和其他体外抑制肝细胞线粒体功能的影响[54- - - - - -56]。因此,需要进一步的调查。
研究报告的一个限制是,这里的HFD方案采用(60%的热量来自脂肪)相对温和代谢的影响。虽然肝脂肪变性没有明显增加了这个方案,HFD-fed老鼠在试验研究并获得更多的重量,timecourse和显示更高的肥胖和血清FFA水平实验端点,而控制饮食的老鼠(数据1和2)。报告在文献中描述这个模型结果与报告的数据是一致的,还要注意duration-of-HFD-exposure之间的相关性和脂肪变性的发展。尽管有这样的限制,不过我们的数据证明PPARγ端依赖修改这个减肥法对Pio-regulated肝基因表达的变化,包括Pio对线粒体基因表达(图的影响6 (b))。此外,我们的数据也表明,这里使用的HFD方案没有明显改变肝脏RXR-DNA绑定模式,这表明HFD Pio-regulated肝基因表达的影响报道这里有这样的RXR-DNA绑定独立或依赖于肝外HFD、Pio,或两者兼而有之(如下另外考虑)。未来的分析比较Pio的转录的影响与老鼠“西方”或者“methionine-choline缺陷”的饮食,导致更严重的非酒精性脂肪肝表型,每个人可能对这些考虑提供额外的洞察力。第二个限制是只雄性老鼠进行了研究。这种策略从可行性约束而优化这些实验所需的实验和分析方法。值得注意的是,最近的一项研究报道性二态的RXR-liver DNA结合和肝特定代谢基因的表达36]。因此,与现在使用的方法建立的可行性,对Pio-induced未来的调查应该调查性别的影响,PPARγ端依赖肝转录调控和饮食等控制的影响。结果可能对未来人类有重要含义Pio或其他NHR-binding药物临床试验测试。第三个警告与注意事项,这些研究仅限于检查肝脏转录调控,尽管众所周知extra-hepatic PPARγ端依赖(独立)转录Pio的影响。可行性的考虑也影响了这种方法。然而,包含评估肝RXR-DNA绑定和肝脏特异性PPAR的分析γKO小鼠,在这里,有小说影响考虑的直接与间接肝Pio的影响。例如,我们观察到Pio不会改变肝脏在肝脏特异性PPAR RXR-DNA绑定γKO小鼠不仅使我们得出结论,Pio-induced RXR-liver DNA结合肝细胞PPAR依赖的变化γ表达而且Pio-induced KO小鼠肝脏转录的影响结果,至少部分由肝外信号调节。然而,未来的研究可以查询之间的关系和组织依赖Pio的肝和肝外转录效应相似的分析从肝脏特异性PPAR收集的肌肉和脂肪γKO小鼠研究这里的老鼠extra-hepatic PPARγ破坏。肝线粒体活动也可以评估评估线粒体基因转录调控和功能之间的关系在这些模型。
总之,这些分析定义Pio的直接和间接影响肝脏转录调控和影响饮食作为修饰符的效果。他们也表明Pio广泛诱发肝脏PPARγ端依赖肝核基因编码线粒体蛋白质的表达和饮食也影响监管。值得注意的是,只有c.a一半的受试者在佩文试验显示药物改善非酒精性脂肪肝(9]。我们的数据提高挑衅的可能性对Pio-induced饮食的影响,肝脏PPARγ端依赖肝核基因编码线粒体蛋白质的表达可能与甚至调解变量功效Pio的审判。这种考虑是很重要的,因为目前流行的非酒精性脂肪肝与fda批准的药物治疗的不足的状况。事实上,基于这种情况下,美国肝病研究协会(肝病)和欧洲肝脏研究协会(EASL)已建议Pio biopsy-proven纳什考虑患者被认为是风险(57]。最后,线粒体基因表达和功能也在其他人类疾病特异表达58- - - - - -60]。因此,这里的数据报告最终可能有更广泛的相关性为未来努力研发NHR-based治疗人类疾病的方法。
缩写
| ChIP-Seq: | 染色质免疫沉淀反应与下一代测序; |
| 编码: | 百科全书的DNA元素 |
| FXR: | Farnesoid X受体 |
| GSEA: | 基因集富集分析 |
| HFD: | 高脂肪饮食 |
| 柯: | 基因敲除 |
| LXR: | 肝X受体 |
| 非酒精性脂肪肝: | 非酒精性脂肪肝病 |
| NHR: | 核激素受体 |
| ns: | 不重要 |
| 主成分分析: | 主成分分析 |
| PIO: | 吡格列酮 |
| 佩文: | 吡格列酮与维生素E与安慰剂治疗的非糖尿病患者非酒精性脂肪肝炎 |
| PPAR: | 过氧物酶体扩散国受体 |
| PPRE: | 过氧物酶体扩散国受体反应元素 |
| RNA-Seq: | RNA序列与下一代测序 |
| RXR: | 类维生素a X受体 |
| TZD: | Thiazolidinedione |
| UPR: | 展开的蛋白质反应 |
| UTR: | 翻译区 |
| WT: | 野生型。 |
数据可用性
芯片和RNA-Seq数据用于支持这些发现的研究报道已经沉积在NCBI的基因表达综合(GEO [34]),将对公众开放地理系列记录GSE137820 (ChIP-Seq数据)和GSE140607 (RNA-Seq数据)当时这个手稿被接受发表。此外,excel电子表格总结的结果RNA-Seq, RXR-ChIP和测试数据分析(即。RNA-Seq,列出与褶皱变化的差异表达基因,置信区间,和价值;ChIP-Seq, RXR-bound不同基因的列表,褶皱的区别,价值,基因组的绑定;β基因名称、等级和等级产品)提供了补充表S2。
信息披露
报告的内容是完全的责任。协会提供的资金是NASPGHAN儿童基金会DAR消化健康和营养;一个无限制的捐赠Karsyn DAR因为基金会;华盛顿大学医学院的儿科(DAR);WUSM消化疾病研究核心中心(DDRCC)设施(由NIH-NIDDK P30-DK52574);和WUSM基因组技术访问中心(做)的基因。做的部分支持的NCI癌症中心支持格兰特(P30CA91842)斯特曼癌症中心和ict / CTSA目前格兰特(UL1TR000448)国家研究资源中心(NCRR)的一个组成部分,国家卫生研究院(NIH)和国家卫生研究院的医学研究路线图。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者感谢安德鲁Schriefer协助ChIP-Seq数据的初步分析报告,布莱恩Finck和菲尔·塔尔这个手稿的评论。
补充材料
anti-RXR补充图S1:免疫印迹分析α/β/γ(圣克鲁斯sc - 774)抗体,用于ChIP-Seq研究报道。主要检测带肝脏样本(即。,from control, Pio-treated, HFD-treated, and HFD-Pio-treated mice) is ~53 kDa band, which is the molecular weight of RXR, and accounts for >50% of the total detected signal in each lane (average 81% across all samples, as assessed using Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.0.21, Licor Biosciences), which is consistent with the ENCODE and modENCODE guidelines [37,61年]。补充图S2:左边的面板显示了初始的身体重量(克)WT KO小鼠(指定),随后被分配到指定的实验组(组)之间没有显著差异。右边的面板显示了初始的身体重量的摘要WT与所有KO小鼠( )。补充图S3:总结基于RT-qPCR范例的分析基因的RNA-Seq描绘在图的模式表达式3。补充表S1: gene-specific RT-qPCR寡核苷酸引物。补充表S2: RNA-Seq、ChIP-Seq和β分析Results-see excel表S2。这个excel电子表格包含(A)的实验组列表,(B)的合并汇总RNA-Seq微分表达式的分析,总结不同RXR-bound山峰被ChIP-Seq野生型(C) Pio的肝脏样本的分析与控制或(D) HFD-Pio-treated与HFD-treated老鼠,和(E)汇总列表从β分析RNA, ChIP-Seq Pio的比较数据与控制和HFD-Pio和HFD(包括排名,基因名称和等级的产品)。补充表S3:计results-see excel表S3:这个excel电子表格包含计组基因表达微扰测试结果对所有由Limma对比组。日志2褶皱变化的基因在特定基因集相比,所有这些以外使用学生的集合 - - - - - -测试。结果报告为意味着日志2叠化,价值,Benjamini-Hochberg罗斯福调整价值。补充表S4:基因设置从HFD RNA-Seq数据分析与控制diet-treated WT老鼠:这些表生成使用Broad研究所平台设置了标志基因平台确定的十大类别 其他详细信息(请参阅文本)。补充表S5:基因分析从HFD RNA-Seq数据与控制diet-treated KO小鼠:这些表生成使用Broad研究所平台设置了标志基因平台确定的十大类别 其他详细信息(请参阅文本)。(补充材料)