文摘

非酒精性脂肪肝病或肝病(非酒精性脂肪肝(NASH)是脂肪肝密切相关,肥胖,糖尿病和血脂异常。吡格列酮,开发成一种抗糖尿病药,改善NALFD而闻名。吡格列酮是由多个细胞色素P450 (CYP)代谢的酶,由异型生物质受体调节本构雄烷受体(汽车)。在这项研究中,我们调查了吡格列酮对非酒精性脂肪肝的影响缺乏汽车活动高脂肪(高频)美联储的条件下。车^{- / -}老鼠都有了明显的改善在NALFD吡格列酮治疗12周后与野生型小鼠相比。这个改善非酒精性脂肪肝坚持汽车^{- / -}老鼠不管血吡格列酮浓度。肝脏中脂肪生成基因的表达,sterol-regulatory元素绑定protein-1c (SREBP-1c)和stearoyl-CoA desaturase (SCD) 1在HF-fed汽车吡格列酮治疗后下降^{- / -}老鼠。此外,过氧物酶体的表达proliferator-activated受体(PPARγ2γ2)减少了吡格列酮在HF-fed车^{- / -}老鼠。SREBP-1c和PPAR的变化γ2保持不变/短期(6 h)吡格列酮和脂质注入。我们的研究结果表明,非酒精性脂肪肝明显改善了吡格列酮在车里删除状态。这些结果可能是有价值的,因为他们认为,与汽车和吡格列酮/ PPAR的交互γ5月2日与非酒精性脂肪肝相关基因表达调控非常重要。

1。介绍

非酒精性脂肪肝病或肝病(非酒精性脂肪肝(NASH)是一种食源性肥胖引起的脂肪肝。最近的流行病学研究报告称,全球非酒精性脂肪肝的患病率是25.24%和7.6%的儿童(1]。肥胖、2型糖尿病、血脂异常与非酒精性脂肪肝密切相关(2),导致疾病进展到肝纤维化和肝硬化3]。胰岛素抵抗是一种公认的危险因素非酒精性脂肪肝(4]。高胰岛素血不仅造成胰岛素抵抗增加脂质合成,而且肝细胞脂肪酸的摄取,因为增加脂肪细胞的脂解作用[2]。生活方式干预(饮食和锻炼)和药物治疗,如维生素E、吡格列酮,和pentoxifylline用于治疗非酒精性脂肪肝(3]。

这些药物中,吡格列酮在一些人类研究显示改善非酒精性脂肪肝(5,6]。吡格列酮也能减少的空腹和餐后血糖水平,提高胰岛素敏感性(2型糖尿病7),目前用作抗糖尿病的药物。吡格列酮行为通过绑定过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγγ核受体超家族的一员,在调节葡萄糖和脂质代谢中发挥着关键作用[8]。吡格列酮广泛代谢由羟基化和氧化在肝脏形成至少四个主要代谢物(m i, M-II M-IV, mv)和两个次级代谢物(M-III和M-VI) (9]。药物活性M-IV和M-III是主要的人类血清代谢物中发现的。

吡格列酮是由多个细胞色素P450 (CYP)代谢的酶,主要CYP2C8 CYP3A4, CYP2C9 [9,10),这是由异型生物质受体本构雄烷受体(汽车)11]。先前的研究表明,汽车会导致药物疗效的差异通过改变药物代谢的程度。例如,acetaminophen-metabolizing酶CYP1A2, CYP3A11,谷胱甘肽年代转移酶被激活以汽车代步的方式治疗后与对乙酰氨基酚在野生型小鼠和诱导的肝毒性作用,但不是在汽车零老鼠(12]。因此,汽车活动可能会影响新陈代谢的吡格列酮和吡格列酮的影响根据代谢的程度可能会有所不同。

此外,汽车的活动影响肝脏脂肪变性。被车车表达式的刺激受体激动剂(TCPOBOP)减少肝病蛋氨酸choline-deficient饮食小鼠(13]。车是NR1亚科的成员;其他几个核受体如孕烷X受体;PPARα,β,γ;肝X受体α,β;和farnesoid X受体α也NR1亚科的成员和非酒精性脂肪肝的发病机制相关14]。因此,个人间的差异的影响吡格列酮对非酒精性脂肪肝可能会影响到汽车活动和多个基因之间的相互作用。

在这项研究中,我们假设的影响吡格列酮对非酒精性脂肪肝是影响汽车的活动。证实这一假设,我们检查的影响汽车删除非酒精性脂肪肝及相关基因表达改变诱导吡格列酮在小鼠肝脏。

2。材料和方法

2.1。动物研究药物

车^{+ / +}(野生型、C57BL / 6 j)小鼠由东方生物,Inc .(凭借、韩国)。野生型老鼠分为两组(控制和汽车激活)。诱导激活,每周3毫克/公斤TCPOBOP腹腔内注射(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)管理。纯合子汽车淘汰赛(车^−−/生成的)老鼠基因打靶如前所述[15)然后backcrossed C57BL / 6 j小鼠十代。他们backcrossed车^{+ / +}C57BL / 6 j小鼠(东方生物)和用于控制。老鼠被安置在环境温度(23±1°C),与12:12-h明暗周期和获得水随意。

在正常饮食(上贴辐照实验室周星驰38057年上贴韩国,首尔,韩国)和高脂肪饮食(60千卡%脂肪饮食,D12492,研究饮食,Inc .)、新布伦瑞克,新泽西州,美国)饲养条件下,8-10-week-old男性车^{+ / +}(控制和TCPOBOP-treated)和汽车^−−/老鼠被分配到车辆或盐酸吡格列酮治疗组根据管理(武田化学工业,大阪,日本)。盐酸吡格列酮在10毫克/公斤/天的口腔路线被混合了12周的饮食。每个实验小鼠组包括至少4,实验重复3次。

在政府不同浓度的盐酸吡格列酮(圣克鲁斯生物技术有限公司、圣克鲁斯、钙、美国)汽车^{+ / +}和汽车^−−/老鼠(1、3、10、20或30毫克/公斤),吡格列酮是管理使用探头为14天每天一次。盐酸吡格列酮是溶解在Solutol HS-15磷酸盐(9%)。当我们发现了类似的血清浓度的吡格列酮注射不同浓度的吡格列酮的车^{+ / +}老鼠(10和20毫克/公斤)和汽车^−−/老鼠(1和3毫克/公斤)。

检测基因表达吡格列酮治疗后的短期变化,我们进行一个短期(6小时)的实验。老鼠被分为4组的汽车^{+ / +}和汽车^−−/老鼠取决于吡格列酮和/或脂质是管理。三个老鼠包含在每组。盐酸吡格列酮(20毫克/公斤)和3 g / kg的20% intralipid(脂肪MCT注入,Dongkook药业有限公司,来自韩国忠北韩)是通过腹腔内注射接种。

所有的动物都在禁食6小时从凌晨06:00时牺牲了。小鼠的腹腔内注射麻醉Zoletil®(Virbac,卡罗,法国)和总脂肪被小动物身体成分分析仪测量,PIXImus(通用电气医疗集团,小都,英国)。肝脏很快被删除,重,在液态氮冷冻RNA提取。白色和棕色脂肪也删除,重,在液态氮冷冻。研究协议是机构批准的动物保健和使用委员会在首尔国立大学盆唐医院,凭借,大韩民国(BA1012-074/068-1)。

2.2。测量体重和葡萄糖耐量

每周体重监测。食物的摄入量每3天测量。血糖水平与试剂条读入一个检查(ACCU-CHEK活跃,罗氏,曼海姆,德国)。后腹腔内进行葡萄糖耐量试验12 h(禁食1克/公斤腹腔注射葡萄糖在12周后实验。从尾静脉血液测定血糖水平之前使用一个和15个,30、60、90和120分钟后葡萄糖注射液。

2.3。测量的血脂和胰岛素

血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇测定与贝克曼库尔特AU480自动生化分析系统(沥青、钙、美国)试剂盒提供的制造商。脂质提取、组织与冰冷的PBS冲洗以去除多余的血液彻底和小块,均质在100 - 200μL PBS玻璃均质器在冰。由此产生的悬浮是存储在一夜之间−20°C。进一步破坏细胞膜,两个冻融循环进行。在那之后,匀浆在5000 x离心5分钟 。上层清液用于试验。甘油三酸酯酶联免疫试剂盒(英杰华系统生物学、圣地亚哥、钙、美国)和总胆固醇测定设备(BioVision Inc .,苗必达,CA)是用于检测。胰岛素测定使用鼠标胰岛素酶联免疫试剂盒(美国NH ALPCO诊断,温德姆)后,制造商的协议。

2.4。组织学分析

的左叶肝切除,与PBS冲洗,固定在10% formaldehyde-PBS解决方案,在石蜡和嵌入。组织切片在5μ米厚度和苏木精和伊红染色。

2.5。吡格列酮的浓度测量

吡格列酮的浓度的高效液相色谱分析(安捷伦1200系列,安捷伦科技,圣克拉拉,美国)。盐酸吡格列酮在50%乙腈稀释获得100μg / mL工作的解决方案。这工作的解决方案与空白血浆稀释准备的标准解决方案不同浓度(5、10、50、100、500、1000和2000 ng / mL)。本标准溶液(0.2毫升)和10μL (1μL /毫升formoterol和600年μL(乙腈,然后离心5分钟在13226 x 。接下来,100年μ与500年g / mL的上层清液混合μL(5毫米甲酸铵:乙腈(20:80,0.1%三氟乙酸)。这种混合物(0.1μL)受到液体色谱-光谱/质谱分析和图表进行分析。

2.6。RNA分离和定量实时PCR

总RNA从冷冻分离肝细胞使用试剂盒®试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。合成第一链cDNA从1μg的RNA使用Omniscript RT工具包(试剂盒、希尔登,德国)。定量rt - pcr进行使用SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad实验室、Inc .、大力神、钙、美国)和CFX96^TM实时PCR系统(Bio-Rad实验室,Inc .)。序列(5′,3′)引物如下:PPARα正向引物(AATCCTGTGCCAACCAGAAG),反向引物(ATCGCCACTAAGGTGTCAGG);PPARγ1、正向引物(TGCAGCTCAAGCTGAATCAC)、反向引物(ACGTGCTCTGTGACGATCTG);PPARγ2,正向引物(TGCAGCTCAAGCTGAATCAC),反向引物(CACGTGCTCTGTGACGATCT);过氧物酶体proliferator-activated受体γ共激活剂1α(PGC-1α),正向引物(AAGAGCGCCGTGTGATTTAC),反向引物(TGCATTCCTCAATTTCACCA);脂肪酸移位酶,集群的区别36 (CD36),正向引物(AAACCAGTGCTCTCCCTTGA),反向引物(CTGCACCAATAACAGCTCCA);向前sterol-regulatory元素绑定protein-1c (SREBP-1c),底漆(TGACCCGGCTATTCCGTGA),反向引物(CTGGGCTGAGCAATACAGTTC);脂肪酸合酶(FAS),正向引物(CCCTTGATGAAGAGGGATCA),反向引物(CAAGGCGTTAGGGTTGACAT);stearoyl-CoA desaturase (SCD) 1,正向引物(AGGTGCCTCTTAGCCACTGA),反向引物(CCAGGAGTTTCTTGGGTTGA);肉碱palmitoyltransferase 1 (CPT-1)α正向引物(ACAGTGGGACATTCCAGGAG),反向引物(AAGGAATGCAGGTCCACATC);长链酰coa脱氢酶(LCAD),正向引物(TCACCACACAGAATGGGAGA),反向引物(TTTCTCTGCGATGTTGATGC);微粒体甘油三酸酯转运蛋白(MTTP),正向引物(GTATTCCCACCTCAGCCAGA),反向引物(GTCAGGCACGTCAAAGCATA);glyceralehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH),正向引物(TGTGTCCGTCGTGGATCT-GA),反向引物(CCTGCTTCACCACCTTCTTGA)。

2.7。统计分析

统计分析是由非参数分析通过使用Mann-Whitney测试。统计学意义是假定P< 0.05。

3所示。结果

3.1。身体的变化,肝脏和脂肪体重和吡格列酮治疗和葡萄糖和脂类代谢的不同在食源性肥胖老鼠车活动

体重的变化在老鼠喂食高脂肪的饮食(高频)吡格列酮治疗12周不显著的车^{+ / +}和汽车^−−/老鼠(图1(一))。总脂肪的百分比增加pioglitazone-treated车^{+ / +}老鼠,但这种效应被汽车删除(图逆转1 (b))。摄入的食物量相似群体之间(数据如图所示)。肝脏重量没有组间差异(图1 (c))。虽然空腹胰岛素水平无显著差异(图1 (d))、吡格列酮治疗显著地抑制血糖水平的增加在历史的车^−−/老鼠和显著增加血糖在汽车^{+ / +}葡萄糖负荷后小鼠组织除了在120分钟(图1 (e))。血清总和高密度脂蛋白胆固醇水平明显更高的汽车^−−/老鼠比汽车^{+ / +}老鼠。然而,没有明显吡格列酮治疗后血脂水平的变化(图1 (f))。肝脏胆固醇和甘油三酯吡格列酮治疗后(图也没有不同1 (g))。

3.2。改善非酒精性脂肪肝Pioglitazone-Treated车里^−−/老鼠

在组织学检查,肝脂肪变性略加剧了汽车^−−/老鼠(图2 (b))与汽车相比^{+ / +}老鼠(图2(一个)),但几乎完全废除TCPOBOP治疗后,这是一个强烈的车(图活化剂2 (c))。吡格列酮治疗后,脂肪小滴仍然在肝脏的汽车^{+ / +}老鼠(图2 (d))。相比之下,肝脏脂肪变性显著改善了吡格列酮治疗车^−−/老鼠(图2 (e))。然而,在TCPOBOP-treated老鼠,我们观察到没有额外的吡格列酮对非酒精性脂肪肝(图的影响2 (f)强烈的效果),可能是因为TCPOBOP改善脂肪肝(16]。

3.3。改善非酒精性脂肪肝Pioglitazone-Treated汽车- / -小鼠无论吡格列酮的血药浓度

由于吡格列酮是主要由CYP2C8代谢和CYP3A4在体外(17),血清浓度的吡格列酮可能会影响到汽车的活动。因此,我们测量的浓度吡格列酮在三组不同的汽车活动。吡格列酮的平均浓度分别为14.9±11.5,2054.0±1132.9,4109.7±606.2 ng / mL的车^{+ / +}TCPOBOP,车^{+ / +},汽车^−−/老鼠,分别。因为TCPOBOP强烈刺激汽车活动,我们不能恰当地评估TCPOBOP治疗条件下吡格列酮的影响。此外,吡格列酮诱导汽车目标基因的表达(CYP2B10 CYP3A11,补充图1),我们认为汽车基因本身的存在可能干扰的解释吡格列酮对非酒精性脂肪肝的影响。因此,进一步分析的吡格列酮对非酒精性脂肪肝的影响只在汽车汽车执行活动^{+ / +}和汽车^−−/老鼠。确认是否改善肝脂肪变性后吡格列酮在车^−−/小鼠产生更高浓度的吡格列酮或有关缺乏汽车本身的情况下,我们做了类似的血清浓度吡格列酮对两车^{+ / +}和汽车^−−/老鼠。我们接种不同浓度的吡格列酮(10、20和30毫克/公斤)2周与高频饮食的车^{+ / +}和汽车^−−/老鼠和测量血液中吡格列酮浓度(图3(一个))。车^−−/老鼠大约3-10-fold更高浓度的吡格列酮相比,汽车^{+ / +}老鼠在收到相同剂量的吡格列酮。基于这些结果,我们管理10和20毫克/公斤吡格列酮的汽车^{+ / +}老鼠和1和3毫克/公斤吡格列酮的汽车^−−/小鼠2周与高频的饮食。我们在汽车获得类似的血清浓度的吡格列酮^{+ / +}和汽车^−−/老鼠(图3 (b))。接下来,我们比较了肝脂肪变性的汽车^−−/老鼠接受1和3毫克/公斤吡格列酮的汽车^{+ / +}老鼠接受10和20毫克/公斤吡格列酮。尽管类似的血清浓度的吡格列酮之间的车^{+ / +}和汽车^−−/老鼠,显著改善肝脂肪变性是汽车持续观察^−−/老鼠(图3 (d)与3 (g),3 (e)与3 (h))。在汽车^{+ / +}老鼠,吡格列酮治疗没有改善脂肪肝与控制老鼠(数字3 (d),3 (e)对比图3 (c))。另一方面,吡格列酮治疗是有效改善脂肪肝的车^−−/老鼠比控制老鼠(数字3 (g),3 (h)与3 (f))。

3.4。基因表达的变化与肝脂肪变性在高频饮食喂养12周的车^−−/吡格列酮治疗后小鼠

调查是否该机制在那些有关脂肪肝的发展与改善肝脂肪变性HF-fed中观察到的车^−−/小鼠与吡格列酮治疗,我们分析了几个著名的基因的mRNA表达的变化与脂肪生成,肝脂质吸收,根据饮食和脂肪酸氧化,吡格列酮,汽车状态(图4)。表达SREBP1c参与脂肪生成降低吡格列酮治疗后周润发和HF-fed车^−−/老鼠(图4(一))。这些降低了吡格列酮HF-fed均未观测到的车^{+ / +}老鼠。特别是SCD-1表达增加pioglitazone-treated车^{+ / +}老鼠,但显著降低HF-fed pioglitazone-treated车^−−/老鼠。此外,CD36的表达,这是重要的脂肪酸的摄入,增加chow吡格列酮治疗后的饮食,但增加HF-fed车里没有被观察到^−−/老鼠(图4(一))。因为SCD-1和CD36被PPAR监管γ,PPAR的表达γ1,PPARγ2,PGC1α评估;有趣的是,PPAR的表达γ2和PGC1α是只有在减少HF-fed pioglitazone-treated车吗^−−/老鼠(图4 (b))。脂肪酸oxidation-related基因的表达没有差别在HF-fed车^{+ / +}和汽车^−−/老鼠,除了PPARα;PPAR的表达α降低了吡格列酮或汽车删除HF-fed条件下(图4 (b))。

3.5。急性吡格列酮治疗车后基因表达的变化^−−/老鼠

决定基因表达的变化是主要或次要反应经过长期的治疗心力衰竭饮食或吡格列酮,我们分析了SREBP-1c的表达,SCD-1, CD36, PPARγ2,PCG1α吡格列酮治疗后6 h结合车辆或脂质注入(图5)。SREBP-1c增加汽车的表达^−−/老鼠和显著减少了吡格列酮结合脂质注入。这种变化就像观察12周HF-fed老鼠。SCD-1和CD36的表达减少pioglitazone-treated车^−−/与车辆注入老鼠,但这种变化没有观察到车^−−/小鼠脂质注入。PPARγ2表达显著减少了吡格列酮在两个车^{+ / +}和汽车^−−/小鼠脂质注入。PGC1的表达α是减少汽车^−−/老鼠,不管脂质注入。

4所示。讨论

在这项研究中,我们评估了吡格列酮对非酒精性脂肪肝的影响由汽车删除老鼠肝脏。我们的研究结果表明,非酒精性脂肪肝明显提高了吡格列酮在车里删除状态。这种效果并不是由于升高血清浓度吡格列酮的降解减少汽车带来的删除。

车激动已被证明改善脂肪肝与胰岛素抵抗18]。相反,在没有车的情况下,没有改善脂肪肝,如图2 (d),这些研究结果证实在另一项研究[16]。因此,很可能改善脂肪肝在pioglitazone-treated CARKO老鼠不是由于汽车删除本身,而是因为多个基因之间的相互作用参与脂肪肝没有车。

遗传分析表明,CD36和SCD-1表达显著减少了吡格列酮在12周HF-fed车^−−/老鼠和这些变化可能导致肝脏脂肪的清除。最近的研究结果表明,增加肝CD36活动的发展是至关重要的脂肪变性在病理条件下,如高频饮食,肥胖和糖尿病(19,20.]。相比之下,CD36删除时,肝脏保护从非酒精性脂肪肝发展21]。SCD-1的内质网酶催化不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的生物合成(22]。在非酒精性脂肪肝(肝SCD-1活动增加23]。小鼠肝脏特异性敲除的SCD1免受carbohydrate-induced肥胖和肝脂肪变性24]。这些结果表明,死者CD36的表达和SCD-1预防肝脂肪变性。然而,SCD-1的反应和CD36不同在12周(长期)和6小时(短期)政府吡格列酮的汽车^−−/老鼠。因此,SCD-1和CD36的变化可能是一个二级反应。

相比之下,SREBP-1c汽车的表达^−−/老鼠高频的饮食一直下降了吡格列酮在12周和6小时实验,表明减少表达SREBP-1c主要影响减少肝脂肪变性。此外,PPAR的模式的变化γ2是类似于SREBP-1c,表明这些基因密切相关,以前已经证明(25]。我们还发现,高频饮食本身增加SREBP1c和PPAR的表达γ2在肝脏(补充图2)。因此,减少SREBP-1c和PPAR的表情γ2吡格列酮在HF-fed车^−−/老鼠发挥了重大作用,改善肝脂肪变性。

几项研究检查PPAR的影响γ在非酒精性脂肪肝了增强脂肪生成的基因的表达和增加PPAR的表达式γ在动物模型的肝脏脂肪变性(26- - - - - -28]。此外,PPAR的角色γ已经建立的维护在肝脏脂肪变性表型(27]。在一项研究使用肝细胞系表达PPAR稳定γ2,PPARγ2表达诱导脂质积累在肝细胞移植脂肪形成的和脂肪生成的基因表达29日]。培养的PPARγ2-expressing肝细胞在无血清(外源性脂质)导致脂质积累,这表明新创脂质合成是一个重要的机制导致肝细胞脂肪变性(29日]。

有趣的是,吡格列酮没有改善脂肪肝HF-fed车^{+ / +}老鼠,尽管改善血糖水平。这种效应也在其他小鼠研究证明。C57BL6小鼠ob / ob用罗格列酮治疗12周(1毫克/公斤)显示显著增加肝脂肪变性和非酒精性脂肪肝活动得分明显高于rosiglitazone-treated老鼠比未经处理的ob / ob老鼠[30.]。口服吡格列酮的28天还在KKAy小鼠肝脂肪变性恶化[31日]。此外,PPARγ1过度PPAR的肝脏α^−−/老鼠增加脂肪堆积在肝脏28]。这些结果表明,PPAR的影响γ受体激动剂在人类和小鼠脂肪肝可能不同。

本研究的一个限制是,我们无法确定的确切分子机制PPAR之间的互动γ2、汽车。摘要图的结果提出了补充图3。还需要进一步的研究来揭示出其潜在的机制。然而,我们的研究结果可能是有价值的,因为他们认为,与汽车和吡格列酮/ PPAR的交互γ5月2日与非酒精性脂肪肝相关基因表达调控非常重要。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

我们非常感谢所以Yeon公园帮助石蜡块和幻灯片。这项工作是支持格兰特(年轻的安月,2011)从朝鲜糖尿病协会和国家研究基金会的资助教育部,韩国科技(2010 - 0023068)。

补充材料

补充图1:CYP2B10的表达和CYP3A11的吡格列酮治疗12周后车^{+ / +}小鼠与高频饮食。p < 0.05。补充图2:差异表达基因(SREBP1c, SCD-1 CD36, PPARγ2)通过高频饮食在车^{+ / +}老鼠。p < 0.05。补充图3:总结图改善脂肪肝的PPAR的交互γ2、SREBP1c和汽车。(补充材料)