文摘
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是与胰岛素抵抗密切相关。的过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR)活化剂,thiazolidinediones,噻唑烷二酮类),胰岛素增敏剂用于治疗非酒精性脂肪肝。然而,服用tzd治疗非酒精性脂肪肝是一个争议,因为冲突的结果关于肝脂肪变性和纤维化。评估可能的有效的药物治疗非酒精性脂肪肝,我们调查的影响,新开发的TZD, lobeglitazone,强调肝脂质代谢。Lobeglitazone高脂肪饮食治疗4周——(HFD)诱导肥胖老鼠(HL组)相比,改善胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良HFD-induced肥胖老鼠(胡锦涛集团)。相关的基因水平治疗后肝脏糖质新生也减少lobeglitazone。HL组小鼠的肝脏组织学上减少显示的脂质积累,降低血浆总胆固醇和甘油三酸酯水平。此外,HL组显著降低肝与脂质合成相关的基因的表达,胆固醇生物合成和脂滴发展和增加了肝与脂肪酸相关的基因的表达β氧化,从而表明lobeglitazone降低肝脂肪变性和逆转肝脂质失调。肝脏与肝病包含增加PPAR的水平γ和磷酸化PPARγ的差别在273年丝氨酸,导致对这些基因的表达与胰岛素敏感性有关。值得注意的是,治疗lobeglitazone PPAR的蛋白质含量增加α和减少的PPAR水平γ磷酸化丝氨酸273,增加了HFD,表明PPAR的感应α和PPAR转译后的修改γ在肝脏lobeglitazone可能是一个潜在的机制,改善非酒精性脂肪肝。综上所述,我们的数据表明,lobeglitazone可能是一种有效的治疗非酒精性脂肪肝。
1。介绍
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)正成为一个严重的临床问题,因为肥胖和超重的患者数量的增加(1]。虽然非酒精性脂肪肝患者的数量正在迅速增长,没有最佳的治疗这种疾病(2]。非酒精性脂肪肝与肥胖、糖尿病、高脂血症和高脂肪饮食(HFD),这是与胰岛素抵抗有关条件(3]。胰岛素抵抗导致无法控制释放游离脂肪酸从脂肪组织和脂肪代谢的多种变化在肝脏4]。非酒精性脂肪肝可能因此引起的不平衡加剧造成的肝脂质积累和改善脂质积聚。
的过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR)是核受体超家族的成员ligand-inducible转录因子,PPAR组成α,PPARβ/δ,PPARγ。PPARγ,这是一个主调节器代谢基因表达的炎症和其他途径(5),提高胰岛素敏感性通过upregulation葡萄糖/脂质吸收和储存,主要在脂肪组织(6]。噻唑烷二酮类)是PPAR的合成催化剂γ诱导胰岛素敏感用于治疗2型糖尿病(T2DM)病人体内。罗格列酮和吡格列酮是TZD家族的成员,研究了非酒精性脂肪肝的药物治疗。许多研究表明罗格列酮和吡格列酮间接地通过提高改善非酒精性脂肪肝脂肪酸吸收和脂联素分泌的脂肪组织,表达PPAR的主要器官γ(7,8]。目前还不清楚是否肝PPARγTZD激活的主要机制,直接提高肝脂肪变性。
Lobeglitazone, PPAR的双重激活α和PPARγ最近被批准在大韩民国和用于治疗2型糖尿病临床试验完成后(9]。动物研究显示,通过监管lobeglitazone抑制肾纤维化的TGF -β/ Smad3途径[10和改善白色脂肪细胞炎症11]。2型糖尿病患者lobeglitazone显示改善肝脂肪变性,高血糖和胰岛素抵抗2,12]。一项研究报道,lobeglitazone主要是局部肝脏(13),这表明它可以有效的改善胰岛素敏感性和脂质代谢的影响肝脏服用tzd与其他。然而,并没有明确的证据表明,通过直接作用于肝脏lobeglitazone改善非酒精性脂肪肝。
在目前的研究中,我们因此为特征的影响lobeglitazone肥胖相关的动物模型肝性脂肪肝,专注于肝脏中脂质代谢。
2。材料和方法
2.1。动物
雄性C57BL / 6 j小鼠买来哈伦(美国印第安纳波利斯,)。HFD (D12492)由60%脂肪从研究购买饮食(美国新泽西州新不伦瑞克)。动物是维持在一个可控的环境光(12小时/ 12小时的黑暗)的湿度为50% -60%和22±2°C的环境温度。6雄性老鼠被喂食正常食物的饮食(非传染性疾病)或连续8周HFD然后将随机分成三组:一群老鼠非传染性疾病没有治疗(ν组),一群老鼠HFD没有untreatment胡(组),和一群老鼠HFD lobeglitazone治疗(Duvie 5毫克/公斤/天;口服填喂法)最后4周(HL组)。所有实验程序依法进行了机构的动物保健和使用委员会的指导方针,忠南国立大学医学院的大田,韩国。
2.2。组织学分析
在所有的组织,组织样本取自18-week-old老鼠。样品的光学显微镜在4%多聚甲醛固定为1小时。石蜡包埋,切片,苏木精和伊红()),油红O染色根据标准协议进行。油红O染色部分也由数字图像量化分析(DIA)使用image-dedicated软件(ImageJ) [14]。
2.3。血清生化测量
收集从心脏的血液在全身麻醉下。样品在5000转离心5分钟和上层的收集。血清胰岛素测定使用酶联免疫试剂盒(美国NH Alpco诊断,萨勒姆)。生化分析,包括测定游离脂肪酸和总胆固醇,进行使用日立7180自动分析仪(日本东京)和试剂(Wako纯化学工业,大阪,日本)。
2.4。腹腔内葡萄糖耐量试验(IPGTT)和胰岛素耐量试验(ITT)
IPGTT,小鼠禁食16小时,然后2 g / kg葡萄糖注入腹腔内腔。测量血糖水平(0)15、30、60、90和120分钟使用一个Accu-Chek;罗氏公司、瑞士巴塞尔)。ITT是由测量血糖禁食6小时后,紧随其后的是0.75 U /公斤的腹腔内注射胰岛素(优泌林;美国礼来公司,印第安纳波利斯)。
2.5。免疫印迹分析
小鼠的肝脏细胞溶解在里帕缓冲区(30毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5,150毫米氯化钠,1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,1毫米原钒酸钠,1%诺乃清洁剂p 40, 10%的甘油,包含磷酸酶、蛋白酶抑制剂)。免疫印迹分析30 - 50μg蛋白使用商用从组织匀浆抗体:antisterol响应基本结合蛋白(如)1和Srebp2 (BD生物科学,圣何塞、钙、美国),脂肪酸合成酶(Fasn), PPARα和PPARγ(细胞信号技术,丹弗斯、马、美国),酸绑定盒式A1 (ABCA1)(美国微孔,海沃德,CA)和phosphoPPARγ(S273) (bios、纪念、有限公司、美国)。二次抗体(山羊anti-mouse和山羊anti-rabbit)从细胞信号技术获得。
2.6。隔离的RNA和实时PCR分析
总RNA分离使用试剂盒试剂(热费希尔科学,Scotts山谷、钙、美国),和总RNA的互补脱氧核糖核酸制备使用M-MLV逆转录和oligo-dT引物(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。结果cDNA放大使用Rotor-Gene™6000实时旋转分析软件(版本。1.7;Corbett生命科学,莫特,澳大利亚)。实时PCR进行了一式三份,个人time-matched vehicle-treated或控制老鼠使用QuantiTect™SYBR®绿色PCR反应混合液(试剂盒、圣地亚哥、钙、美国)。所有使用ΔΔCT方法进行定量计算。
2.7。统计分析
统计分析使用图5棱镜(美国GraphPad拉霍亚,CA)。数据报告为±SEM手段。所有数据从动物研究分析双向重复测量方差分析为多个比较,其次是Bonferroni调整单向方差分析之后,图基的事后测试,或双尾学生的t -测试。被认为具有统计显著性p值< 0.05。
3所示。结果
3.1。Lobeglitazone HFD-Induced肥胖小鼠的治疗改善胰岛素抵抗
HFD的喂养12周后,C57BL / 6 j小鼠有显著提高体重与老鼠的非传染性疾病(数据没有显示)。我们确认的影响HFD通过胡组显示,葡萄糖耐受不良在IPGTT(图1(一)ITT(图)和胰岛素抵抗1 (b)与ν组相比)。HL组显著改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性与胡集团(数字1(一)和1 (b))。空腹血糖和胰岛素水平也显著降低在HL组相比,胡锦涛集团(数字1 (c)和1 (d)),导致一种改进的内稳态模型评估胰岛素抵抗(HOMA-IR)指数在HL集团(图1 (e))。此外,glucose-regulating酶在肝脏,如PEPCK和G6Pase,更好的抑制基因的转录水平HL组相比,胡组(图1 (f))。这些发现表明lobeglitazone有效改善肝HFD-induced肥胖小鼠的胰岛素敏感性。
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3.2。Lobeglitazone治疗防止HFD-Induced肥胖老鼠的肝脂肪变性
胡组小鼠肝脏是较大的规模和较轻的颜色,相比的相对健康的红色小鼠肝脏HL组(图2(一个))。胡组肝脏的重量大大增加了与ν组(图2 (b))。HL组肝脏的重量相比也明显减少了胡组和HL组表现出明显降低肝脂质积累,作为评估)和油红O染色(数字2 (c)和2 (d))。这些结果表明,lobeglitazone减轻HFD引起的肝脂肪变性。
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3.3。Lobeglitazone治疗降低了HFD-Induced肥胖小鼠的血清脂质水平
确定是否lobeglitazone改善血清血脂在组织学缓解肝脂肪变性,我们测量了血清甘油三酯(TGs)和胆固醇的水平。虽然没有明显的变化水平的低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白)(图3 (c))、道达尔和高密度脂蛋白胆固醇(hdl - c)和HL组TG含量低于胡组(数字3(一个),3 (b),3 (d))。确认是否提高了lobeglitazone HFD引起肝病,我们测量的血清谷丙转氨酶(GPT (ALT)和天冬氨酸转氨酶(共和党/ AST),肝脏损伤标记。ALT水平,但不是AST水平明显高于胡组比ν集团(数字3 (e)和3 (f)),这表明HFD导致肝炎与肝脂质积累。然而,ALT并没有显著降低HL组与胡组,尽管在HL集团(ALT减少数据3 (e)和3 (f))表明lobeglitazone治疗4周不能完全恢复HFD引起的肝脏损伤。综上所述,这些结果表明,lobeglitazone HFD恢复血清脂质水平改变。
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3.4。在老鼠HFD-Fed Lobeglitazone调节肝脏脂质代谢
因为lobeglitazone改善脂质积累在肝脏和血清血脂恢复,我们评估肝蛋白质和基因表达的水平与脂质代谢有关。利用免疫印迹,HL集团Srebp1的蛋白质含量,减少Srebp2, ABCA肝脂肪生成和PPAR的蛋白质含量增加α,主要包括脂肪酸β氧化和各种肝脏的脂质代谢,而胡组(图4(一))。转录水平的脂肪从头合成的关键基因,如乙酰辅酶a羧化酶1 (Acc1),Srebp1,Srebp2,和stearoyl-CoA desaturase 1 (Scd1),明显减少了在HL组相比,胡锦涛组(图4 (b))。转录水平的胆固醇生物合成的基因,如β-还原酶(Hmgcr),角鲨烯环氧酶(Sqle),甲羟戊酸脱羧酶(diphospho)(Mvd),和羊毛甾醇合酶(Lss),显著降低了HL组相比,胡锦涛集团(图4 (c))。脂滴发展基因的表达水平,如mannosyl (alpha - 3)糖蛋白beta 1, 2-N-acetylglucosaminyltransferase (Mgat)1,Mgat 2,diacylglycerol-o-acyltransferase 2 (Dgat 2),也减少了在HL组相比,胡锦涛集团(图4 (d))。然而,转录水平的酰coa氧化酶1 (Acox1),称为脂肪酸的关键基因β氧化,提高HL组相比,胡锦涛集团(图4 (e))。这些结果表明lobeglitazone在肝脂肪变性的有利影响与降低肝脂质合成和脂肪酸的增加β氧化。
(一)
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最近的研究表明,TZD扮演了一个角色在转译后的修改,PPAR激动,γ(15]。因此,我们评估PPAR的蛋白质含量γ和PPARγ磷酸化在S273 (pPPARγ(S273))在脂肪和肝组织使用西方墨点法。尽管PPAR的绝对蛋白质水平γ和pPPARγ(S273)无法比较的肝组织脂肪组织,pPPAR的比率γPPAR (S273)γν组非常高在肝脏脂肪组织(图4 (f)和补充图1)。PPAR的蛋白质水平γ在肝脏和脂肪组织中非常高的胡锦涛和HL组比ν组和没有显示的区别胡锦涛和HL组(图4 (f)和补充图1)。然而,pPPAR的蛋白质水平γ(S273)在肝脏和脂肪组织中显著降低HL组比胡组(图4 (f)和补充图1)。这些结果表明,lobeglitazone扮演了一个角色在PPAR的转译后的修改γ不仅在脂肪组织,而且在肝脏。
4所示。讨论
肝脂肪变性,非酒精性脂肪肝的第一阶段,始于TG在肝细胞的细胞质的积累,会进步到非酒精性脂肪肝炎(纳什),纤维化,肝细胞癌(16,17]。虽然与炎症相关的致病途径,细胞凋亡和纤维化研究人员一直在研究可能的治疗靶点[18),大多数药物都不用于治疗纳什,要么因为力量不足抑制纳什的恶化,或者因为保留了纳什表型的替代途径。当前治疗非酒精性脂肪肝的意图强调纠正胰岛素抵抗,这是一个几乎恒定的发现在非酒精性脂肪肝19]。PPARγ活化剂TZD,充当有效的胰岛素敏化剂用于治疗2型糖尿病,试图为治疗非酒精性脂肪肝。许多研究表明,罗格列酮和吡格列酮显著提高肝脂肪变性(20.,21),这些药物的效果很大程度上是因为二次改善脂肪组织胰岛素敏感性的影响,PPAR的地方γ水平主要是高(7,8]。最近的研究表明,服用tzd结构性差异不仅会导致PPAR增加γ表达,但也导致ligand-dependent PPAR的转译后的修改γ(15,22]。Lobeglitazone包含一个常见TZD一半,但具有不同侧链与罗格列酮和吡格列酮(9,13]。因此,我们假设小说TZD lobeglitazone,可以作为一种有效的药物治疗非酒精性脂肪肝HFD-induced肥胖小鼠模型。
最近,2型糖尿病患者lobeglitazone不仅改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐受不良,但也显示出纳什的改善(12]。与先前的研究一致(9,11),我们确认了HL组空腹血糖水平和增强胰岛素敏感性下降相比,胡组(图1)。此外,老鼠在HL集团有效地增加重量的脂肪组织相比,胡锦涛集团(数据未显示)。它可以表明lobeglitazone PPAR适当地工作γ激活促进脂肪细胞的增殖和分化23]。因此,lobeglitazone的影响在脂肪组织将扮演一个角色在改善胰岛素敏感性的HL组。HL组小鼠肝脏重量减少,但没有显著降低肝酶水平。肥胖包括招募巨噬细胞根据肝脏的脂质积累(24等)和肝酶水平增加GPT / ALT和共和党/ AST的进展期间(即炎症反应。纳什)。在这项研究中,尽管短期lobeglitazone治疗4周未能扭转HL组的炎症反应,HL集团不仅显示改善脂质积累在肝脏(图2),但也会大大降低总胆固醇和TG水平(图3)。因为lobeglitazone是肝脏的主要目标站点13),lobeglitazone可能首先改变脂质代谢而不是在肝脏炎症通路。
非酒精性脂肪肝可以通过改变诱导肝脏脂质代谢,通过增强肝脂质积累和衰减的增加血清血脂水平(25]。因为PPARα主要表现在肝组织和扮演重要角色在肝组织脂质吸收和储存,肝PPAR的监管α对于非酒精性脂肪肝的治疗是必要的。PPARα扮演着一个很重要的角色,通过诱导线粒体脂肪酸脂质分解代谢β氧化在肝组织(26]。最近的一项研究报道,肝PPARα中发挥了核心作用游离脂肪酸从脂肪细胞释放的间隙,在非酒精性脂肪肝(脂肪的主要来源27]。在这项研究中,PPARα水平HL集团增加肝脏转录诱导基因涉及脂肪酸β氧化,以及基因的转录抑制脂质合成,胆固醇生物合成和脂滴发展(图4)。因此,lobeglitazone对非酒精性脂肪肝的影响可能是由于对PPAR的影响α比罗格列酮和吡格列酮。
PPARγ通常是低水平在脂肪组织和肝脏组织比PPAR可能不那么重要的角色吗α对肝脏的脂质代谢。然而,在这项研究中,诱发小鼠HFD PPAR的蛋白质含量γ和磷酸化PPARγS273 (pPPARγ(S273)),不仅在脂肪组织也在肝组织(图4 (f)和补充图1)。治疗lobeglitazone降低了pPPARγ(S273)在脂肪和肝组织(图4和补充图1)。Cdk5-mediated PPAR的磷酸化γ在S273 HFD一直与胰岛素抵抗引起的(15]。一项研究也报道了抑制pPPARγ(S273)改善肝脂肪变性28]。因此,改善肝脂肪变性HL组可能是与减少这种磷酸化虽然我们不确认是否pPPARγ(S273)在肝脏基因表达改变。
总之,我们表明,lobeglitazone授予可能有益影响胰岛素敏感性和肝脂肪变性通过改善脂质代谢,通过改变靶基因的表达参与了这些途径。基因表达的变化可能是由于PPAR的感应α和抑制pPPARγ在S273磷酸化。因此,这项研究表明lobeglitazone在调节肝脂肪变性的重要作用,以及这小说是一个治疗非酒精性脂肪肝的治疗。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Sorim Choung和金敬姬惠Joung贡献同样这项工作。
确认
这项工作是由韩国国家研究基金会(NRF)授予由韩国政府(NRF - 2016 r1d1a1a09916900) (Bon宋Ku),由庄Kun Dang制药)的资助下,韩国(2015-2083-01)(Bon宋Ku),并从韩国的拨款糖尿病协会(金敬姬Hye Joung, 2013)。
补充材料
补充图1:pPPAR的蛋白表达γ(S273)和PPARγ在脂肪组织。ß-ACTIN是包括加载控制。(补充材料)