文摘
过氧物酶体proliferator-activated受体β/δ(PPARß/δ)被认为是代谢紊乱的治疗目标,癌症和心血管疾病。这里,我们开发了一个管道的筛查PPARß/δ受体激动剂,降低了成本、时间和假阳性。第一步是一个优化的为期3天的长细胞transactivation分析基于报告基因技术,支持自动liquid-handlers。这主要筛选是紧随其后的是一个确认transactivation化验和由两个生物物理验证方法(热转移试验(TSA)和(ANS)荧光猝灭),它允许亲和常数的计算,提供更多选择的热门信息。所有的分析都是使用著名的商业竞争者提供值得信赖的数据进行验证。此外,验证和测试这个管道,我们筛选天然提取库(560提取物),我们发现了一个植物提取物可能是有趣的对于PPARß/δ调制。总之,我们的结果表明,我们开发了一个更便宜、更健壮的管道,超越单一激活筛选,因为它还评估PPARß/δ三级结构的稳定性和配体亲和常数,只会选择直接绑定到受体分子。此外,这种方法可以提高筛查的有效性目标PPARß/受体激动剂δ药物开发。
1。介绍
过氧物酶体proliferator-activated受体β/δ(PPARß/δ)是一个lipid-activated转录因子,它是核受体(NR)总科的一员,调节几个目标基因的激活或沉默。PPARß/δ广泛表达于人类,尽管它主要是发现在皮肤上,胎盘,大脑、肝脏、肾脏、脾脏、骨骼肌、脂肪和消化管(1- - - - - -3]。
PPARß/δ参与一些代谢途径,如能量代谢、体内平衡,脂肪形成和脂质代谢4- - - - - -6]。几项研究已经表明,PPARß/δ调制的受体激动剂调节食物摄入量,体重,胰岛素敏感性,肥胖,体重5,7]。它也伴随着多样化physiopathological流程,如炎症、肥胖、血脂异常、糖尿病、癌症和心血管疾病(6,8- - - - - -10]。PPARß/δ也有描述extra-metabolic角色包括神经保护效应对脑部疾病,如多发性硬化、中风、阿尔茨海默氏症、帕金森病,和行为在细胞分化和增殖,免疫调节,氧化应激,和皮肤生物学(2,3,11]。
在PPARß/多样性δ相关函数的能力适应和绑定不同的配体在配体结合域(精神的小黑裙),与多种天然和合成配体。天然配体中,脂肪酸,前列腺素,白细胞三烯(12,13]。几个高亲和力和subtype-specific PPARß/δ受体激动剂开发并提交临床试验治疗代谢疾病(1,14];然而没有配体供临床使用。
由于大量的灾民PPARß/δ有关的疾病,开发特定的配体调节受体活动变得至关重要。这里,我们开发和建立一个合适的,便宜,和健壮的筛选更好的识别PPARß/管道δ受体激动剂。在这个管道的第一步,我们优化细胞transactivation化验是1到2天短,少使用试剂比先前描述,大大减少时间和金钱的成本大检查活动。另外,我们介绍两个验证方法来避免假阳性:热试验(TSA)检查PPARß/转变δ三级结构稳定的热门候选人,说明直接绑定到蛋白质,紧随其后的是一个ANS荧光猝灭实验来确定复合/提取PPARß亲和力δ疏水口袋里。
迄今为止,大部分的筛查方法PPARs只基于transactivation化验,这是最常见的和完善的协议来衡量核受体的活动(15- - - - - -19]。然而,这种方法可能让假阳性化合物的选择可能激活PPARß/δ以一种间接的方式没有兴奋剂性质。为了克服这种差距,我们提出一个管道的transactivation化验是紧随其后的是生物物理分析确认化合物直接绑定到PPARß/δ配体的口袋里。
特别是,主要的差异在我们的管道相比其他提议PPARß/δtransactivation方法测定长度和体积的减少;细胞载体;自动化;以及生物物理验证方法(15- - - - - -18]。此外,这种管道被特定的PPARß/评估δ受体激动剂(GW0742 GW501516, l - 165041)和因素。总之,我们建议这个管道是一个稳定、更便宜、更快,更健壮的工具来识别PPARß/δ受体激动剂,此外,我们测试了天然产物库开发管道。
2。材料和方法
2.1。试剂
细胞培养的材料:杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)从GIBCO购买公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德),胎牛血清(的边后卫)获得CULTILAB(巴西坎皮纳斯,SP), charcoal-stripped的边后卫和青霉素和链霉素是来自GIBCO公司(美国大岛屿,NE)。Lipofectamine 2000®转染试剂从生活中获得了技术(美国印第安纳波利斯,)。双荧光素酶®化验记者从Promega系统获得公司(美国麦迪逊,WI)。GW0742 (ca 317318-84-6), GW501516 (ca 317318-70-0),苯扎贝特(cas41859 - 67 - 0),和l - 165041 (ca 79558-09-1)从σ公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。
2.2。质粒
转染后的细胞培养进行了分析(i) pBIND-PPARß/δ,表达Gal4-DBD和PPARß/δ小黑裙融合蛋白,和(2)pGRE-LUC包含Gal4响应元素随后萤火虫荧光素酶报告基因。PPARß/δ:GAL4蛋白质,当配体激活,可以诱导pGRE-LUC的荧光素酶报告基因的转录。pBIND-PPARß/δ修改后的向量和pGRE-LUC保罗•韦伯博士的礼物(卫理公会医院研究所、休斯顿、欧洲大学协会)(15,17]。转染效率控制向量归一化),我们使用pRL-TK向量,既定的表达Renilla reniformis荧光素酶(20.,21]。为在体外我们使用pET28a-His-LBD-PPAR蛋白质化验δ,其中包含人类PPARß的小黑裙基因/δ171 - 441 (aa)与他融合5]。
2.3。细胞培养
293 t(写明ATCC®crl - 3216™)细胞在DMEM补充10% (v / v)胎牛血清(的边后卫)和抗生素(100单位/毫升青霉素和链霉素100毫克/毫升)。细胞生长在5%的股份有限公司2,95% air-humidified氛围,在37°C。
2.4。PPARß/δTransactivation化验
初级筛查试验的原理图描述1。首先,在70 - 90% 293 t细胞融合是暂时性的cotransfected与质粒pBIND-PPARß/δpGRE-LUC, pRL 100年×20毫米板Lipofectamine 2000®转染试剂,在制造商的协议。6小时的转染细胞孵化有限公司5%237°C, 95% air-humidified气氛。
同时,筛选化合物(植物提取物)被重新格式化一个96孔板(屏蔽板,白色的微型板块,珀金埃尔默)包含50μL的DMEM补充charcoal-stripped的边后卫在最后10浓度为10%μg / mL与热科学™Versette™自动化液体处理程序配备96头。在每个试验板,第一列被设置为负控制(车辆,1%二甲亚砜(DMSO)和列12成立积极控制(1μ0.00047 M GW0742 ~μg / mL)。
转染后细胞被播种在96 -白微型板块(4×104细胞每口井),它已经包含了控制或测试化合物/提取,在100年的最后一卷μL /远的DMEM补充10% charcoal-stripped的边后卫和抗生素(100单位/毫升青霉素和链霉素100毫克/毫升)。实验条件进行调整,以确保在整个测定线性。
24小时后,介质与热科学吸气Versette自动化液体处理程序,并在每个与双荧光素酶活性测定荧光素酶检测系统(Promega)记者。阅读解决方案添加热科学的多点联合试剂分发器如下:首先,溶解的溶液,紧随其后的是板孵化20分钟;然后25μL守护神二世的衬底,紧随其后的是发光测量CLARIOstar®(BMG Labtech)板的读者;最后,25μL (Stop&Glo®基质增加,发光测量。
我们执行向量归一化的原始发光数据控制转染效率样本之间的差异。矢量归一化计算荧光素酶信号/Renilla信号。分析性能评估板统计(signal-to-background比率,因素,变异系数)22)和明显的细胞毒性是一个衡量Renilla荧光素酶参数。为因子的计算,我们认为,向量归一化后,积极的控制(GW0742)信号,和消极的控制(DMSO)作为背景。细胞毒性,井与表达Renilla记者下面五个标准差(5×SD)的平均值控制治疗被认为是细胞毒性,因此被忽视。我们认为是候选人与发光化合物/提取萤火虫/ Renilla比7倍以上的标准差-控制(DMSO)相同的板。最后一个标准需要在账户的内在变化-控制信号板。检查图形,比率萤火虫/ Renilla井是规范化,积极控制意味着显示100%的激活,激活和负控制意味着被认为是0%。确认候选人,选择提取都是测试一式三份。
2.5。MTT细胞毒性试验
此外,我们相关的3 - (4 5-dimethyl-2-thia-zoyl) 2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium溴化(MTT)的结果Renilla记者表达评估当测试化合物/提取细胞可能是有毒的,只有基于Renilla记者表达。然后,4×104293 t细胞被播种在96孔透明微型板块(Sarstedt)的0.1%,1%,3%,5%,10%,和50% DMSO和1μM GW0742和普通细胞的可行性取决于减少MTT甲瓒(23]。DMSO孵化20小时后,手机媒体改变了磷酸缓冲盐(PBS),和10%的肝癌在PBS(5毫克/毫升)被添加到每个。细胞培养在37°C, 3 h, PBS被删除了,100μL DMSO溶液加入溶解甲瓒晶体。吸光度测量在562 nm使用EnSpire®多模板读者(珀金埃尔默)。4个独立的实验进行实验。数据分析了双向方差分析后跟Sidak GraphPad棱镜的多重比较测试软件。
2.6。蛋白表达
人类PPARß/δ配体结合域(hPPARß/δ小黑裙)cDNA氨基酸(171 - 441)插入pET28a向量(美国Novagen)是不同的表达大肠杆菌BL21 (DE3)压力。蛋白质纯化的缓冲区(20毫米消息灵通的pH值7.5,300毫米氯化钠,5%甘油)到一个爪Superflow金属亲和树脂(BD生物科学Clontech,帕洛阿尔托,CA),根据前面描述的协议(5]。
2.7。热转移试验(TSA)
这个试验后进行定性和定量的方法。定性TSA使用10μM hPPARß/δ小黑裙),5 x SYPRO®橙色(西格玛奥德里奇)缓冲区包含20毫米消息灵通的pH值7.5,200毫米氯化钠,甘油和5%,30岁μ米(~ 0.01μg / mL)的商业受体激动剂(1蛋白质:3配体)或140年μg / mL的提取测试库中添加微安96孔板(应用生物系统公司)。执行定量TSA在相同条件下,不同配体/提取浓度(配体浓度分别为0.3,0.5,1,3,5,10,30岁和50岁μM;提取浓度5、10、30、50、100、300和500μg / mL)。实验是在7500年执行实时PCR系统(应用生物系统公司),和测量来自9°C到89°C,梯度的每分钟1°C,总计80测量23]。执行的试验是在OriginPro8.1一式三份和数据进行了分析。安装了Kd确定数据使用Hill1模型(OriginPro 8.1)。
2.8。ANS荧光猝灭
8-anilinonaphthalene-1-sulfonic酸(ANS)测定的条件优化的蛋白质和ANS浓度(补充材料图1),为了定义如果ANS淬火真的被PPARß/δ配体结合。在96 -黑色微型板块(他一一Bio-One), 2μM hPPARß/δ小黑裙和20μM ANS孵化在20毫米消息灵通的pH值7.5,200毫米氯化钠和5%的甘油,在4°C。1小时后,或提取的化合物添加到混合物中。对于商业兴奋剂测试,0.3μ0.0001米(μ0.5 g / mL)μ0.0002米(μg / mL), 1μ0.0004米(μg / mL) 3μ0.001米(μ5 g / mL)μ0.002米(μ10 g / mL)μ0.004米(μ30 g / mL)μ0.01米(μ50 g / mL),μ0.02米(μ使用g / mL)浓度;提取,5μ10 g / mL,μg / mL, 30岁μ50 g / mL,μg / mL, 100μg / mL, 300μg / mL, 500μ克/毫升,1毫克/毫升浓度。分析阅读在EnSpire多模板读者(珀金埃尔默)和380海里激发和发射扫描400至600海里,25°C。最大荧光发射强度(480海里)的亲和力与每个化合物/提取浓度恒定计算,8.0 OriginPro通过Hill1 s形调整。
2.9。天然提取的图书馆
PPARß/δ主要检查是对560年执行hydroalcoholic提取物Phytobios库。Phytobios图书馆请提供了天然产物化学库(LQPN)从巴西国家生物科学实验室(LNBio / CNPEM)与Phytobios Ltda,计划和组装的图书馆。Phytobios / LNBio图书馆定期从亚马逊森林植物样品中提取,大西洋森林,塞拉多,Caatinga。每个样品都是伴随着精确的收集由GPS位置;由一个合格的植物分类学者植物鉴别;和存款的证词使干燥认证的标本。每个集合得到至少5公斤的叶子(和/或根部,或叫)。处理后,每个样本都能约20克干提取,足以让许多测试重复和9(9)中的每个样本是分离色谱分数并立即镀384年井板块和冷冻进一步化验。因此分数10(十)样品= 9 +粗提物可用于测试。这个处理允许访问低浓度和未知生物活性物质多数主义通常是隐藏的物质。 All samples were submitted to analysis by mass spectrometry + molecular networking technique (data not shown). The tested library contained 560 hydroalcoholic extracts from Brazilian plants assembled in two 384 microplates. The compounds were preplated in 384 well microplates at the stock concentration of 10 mg/mL, in 100% DMSO. Before screening, compounds were transferred to daughter plates and diluted to 1 mg/mL, in 100% DMSO. Columns 1, 2, 23, and 24 from daughter plates were empty, and the positive and negative controls were filled in the screening plates.
3所示。结果
3.1。优化筛选条件
我们测量了PPARß/δ活动transactivation化验在不同情况下的目标确定最好的筛选条件。这种筛选设置包括荧光素酶底物的评估卷,drug-incubation媒介,手机号/(图2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
首先,我们测试了不同量的双荧光素酶检测记者系统组件定义最好的信噪比,而不损害试验质量。解决方案制造商推荐的卷是100μL的荧光素酶底物。然而,我们证实25μL的衬底足以提供一个高信号具有良好的歧视之间的激活和未激活的PPARß/δ(图2(一个))。这样,我们和试剂的使用成本减少了75%,而不丢失信号的信息。这代表一个重大减少高成本的减少和medium-throughput化验,这些活动通常屏幕同时成千上万的化合物。
另一个重要的验证有关的定义中使用的最佳培养基成分测定,提高了数据质量。自天然脂肪酸PPARß/工作δ天然配体和的边后卫包含许多这样的天然脂肪酸,10% FBS-supplemented DMEM可能不是适合PPARß/δ受体激动剂筛选[15,16,18]。为了克服这个限制,我们测试了不同培养基成分在复合/提取孵化。我们的研究结果表明,血清DMEM被认为是自GW0742激活低,不足和计算可靠性因素的测试板低于限制(系数= 0.21)(22)(图2 (b))。另一方面,分析执行10%的边后卫charcoal-stripped-supplemented DMEM显示更高的agonist-activation褶皱和更好的因素(0.56)。由于这些结果,10%的边后卫charcoal-stripped-supplemented DMEM被选为孵化中PPARß/δ受体激动剂筛选化验。
而不是海拉或Cos-1,有趣的是,我们选择了293 t细胞谱系,这还没有被描述为PPARß/δ筛选化验。这个血统很容易培养,生长,使转染作为最工业相关的细胞系之一因为它是符合cGMP [24]。此外,我们检查不同浓度的细胞每在以前描述的范围(10000 - 40000)为其他类型的细胞(15,17,19]。我们的结果显示PPARß/δ激活时的199倍(图40000细胞被播种2 (c))。因此,本文选取这个量因其更高的激活和小偏差。
总之,我们运行我们的PPAR标准化的最佳条件β/δ筛选试验使用40000转染细胞每口井和孵化在10%的边后卫charcoal-stripped-supplemented DMEM和荧光素酶底物的减少75% (25μL的荧光素酶底物守护神二世和Stop &如果®)。
3.2。敏感性分析对已知的受体激动剂
验证试验的敏感性,我们测量了PPARß/δ激活在其商业受体激动剂治疗GW0742, GW501516, l - 165041剂量反应曲线(10−11-10年−6米)(图2 (d))。这些配体纯化合物诱导细胞transactivation PPARß/高δ(5,7,25]。通过我们的研究结果,我们下面的计算对于每个测试化合物:= 0.71海里,= 10.87 nM,= 26.40 nM规模相同的摩尔发现文献中(= 1.8 nM (7),= 1 - 3.5 nM (5),而= 125 nM (25])。这些结果证实,该transactivation化验足够健壮的歧视低激活信号从可能的候选人,因为它能够从商业标识信号受体激动剂的浓度低于1海里。
3.3。Renilla记者表达式作为细胞毒性的指标
Renilla记者表达式是常用的作为转染效率的控制(20.,21]。在这里,我们建议使用Renilla记者表达式作为参数间接细胞毒性。自细胞转染筛选在电镀前一批板,Renilla记者表达在井井中应在同一数量级,减少在这个信号应显示细胞毒性21]。的浓度GW0742 (1μ米,1% DMSO作为车辆),作为一个积极的控制检查,没有统计学差异相比,0.1%或1% DMSO溶液(浓度用于我们的负控制),表明GW0742没有细胞毒性。使用有毒的DMSO浓度(3 - 50%),我们证明了分析的Renilla记者表达了同样的结果MTT细胞毒性实验(图3);也就是说,我们可以暗示,有统计学意义( ),化合物或提取,导致低Renilla记者表情也导致高细胞毒性。因此,我们定义低Renilla记者表达作为间接细胞毒性参数的测定,进一步检查,化合物/提取,导致低转染信号被忽视。通过这种方式,在一个transactivation分析,我们得到了两种不同的结果:主萤火虫的记者,这说明PPARß/δ激活,第二个控制Renilla荧光素酶检测细胞毒性。
3.4。Transactivation筛选与一个真正的图书馆
优化后的细胞transactivation化验与知名商业受体激动剂,我们提交这个化验一个自然提取库(Phytobios库)。我们的结果显示,大部分的提取/分数和消极的控制提出了低萤火虫荧光素酶的表达,因此,低萤火虫/ Renilla比例(图4(一))。另一方面,积极的治疗控制提出了很高的萤火虫荧光素酶的表达和高萤火虫/ Renilla比例,如预期。
(一)
(b)
我们的数据分析后,我们发现31可能达到PPARß/候选人δ受体激动剂(提取)日至31日,显示激活率从1.3 - 2.1倍。然而,获得的信号是远低于获得的积极控制治疗。这些结果可以解释的事实GW0742是一个商业PPARß/受体激动剂具有高特异性和亲和力δ(5]。这意味着这个配体已经提交优化步骤通过领先一代,而Phytobios图书馆是由原始植物提取物,不同化合物的混合物在不同浓度,需要进一步分离和改进。对于所有筛选盘子,我们获得一个合适的因素高于0.5限制(0.53 - -0.64)26),这表明我们的试验是足够可靠,适合PPARß/δ受体激动剂筛选(图4 (b))。的可变性PPARß/δ激活通过积极的控制(GW0742),即使同一批次的转染细胞培养基,受体激动剂能整除,和阅读解决方案,不干涉因素评估和被认为是固有的实验。
接下来,确认所选择的候选人,我们执行一个二级transactivation筛查。确认筛选之后,我们的研究结果提出了10个可能的冲击候选人(提取,提取2,提取3、提取,提取,提取19日提取,提取29日提取30,并提取31),与激活率从1.2——2.4倍(图4 (b))。相比GW0742 PPARß/δ激活(五六折),所有分数显示更低信号,但信号仍高于我们的选择标准基于标准差的负面的控制。此外,正如上面提到的,库包含原始植物提取物、多样的化合物在不同的浓度,可能,化合物激活PPARß/δ出现在非常低。在这种情况下,低PPARß/δ激活率发现与提取应该被认为是非常重要的。
3.5。定性TSA作为PPARß/确认试验工作δ结构稳定的候选人
定性TSA是一个额外的验证我们筛选的方法,测量的三级结构稳定PPARß/δ之前和之后的配体结合。据报道,NR配体提高NR结构稳定性主要是因为他们的小黑裙口袋里的配体结合组织特定的交互,从而使溶剂保护的程度,因此,使其结构更加严格的(27- - - - - -30.]。
在这里,我们第一次测试商业受体激动剂;我们的结果表明,该技术能够区分在特定的受体激动剂,并非特定受体激动剂和apo-PPARß/δ(数据5(一个)- - - - - -5 (b))。特定的受体激动剂(GW0742 GW501516, l - 165041)导致蛋白质融化温度的增加()相比,apo-PPARß/δ ,指示三级结构稳定(图5(一个))。特别是,GW0742受体激动剂稳定PPARß/的三级结构δ,就像之前报道(5),增加其9.3±0.1°C。其他特定的受体激动剂,GW501516和l - 165041,也增加了PPARß/的值δ14.3±1°C和7.3±0.7°C,分别。苯扎贝特,PPAR pan-agonist PPARß/非常低的特异性δ提供低激活(31日),提出了一个只增加了2.9±0.1°C,这表明试验评估low-specificity敏感期间可能出现的化合物筛选候选人。
(一)
(b)
(c)
(d)
并行,TSA的结果显示2分数选择候选人(提取1和提取9)没有显示预期的熔化曲线,表明这些提取物在某种程度上可能会破坏PPARß/的三级结构δ甚至没有直接绑定到这种受体。另一方面,2分数(提取2和提取19)增加了PPARß/δ 3.5±0.3°C和2.5±0.3°C,分别与比较apo-PPARß/δ(图5(一个))。这个结果表明,身体这些提取物可能组件绑定到受体,促进蛋白质的稳定结构。
3.6。ANS荧光猝灭的亲和力决定PPARß/配体结合口袋的δ
第三个实验的管道是ANS荧光猝灭实验,这决定了所选的亲和力候选人PPARß/δ疏水结合位点。在这个试验,俺们探针结合疏水配体结合口袋(LBP) PPARß/δ,它可以取代PPARß/δ配体,导致荧光猝灭(补充图1)。随着受体激动剂浓度的增加,荧光猝灭变得更高。几个测试进行评估最好的调查:蛋白质比最好的试验性能(补充图1)。我们还通过PPARß/δ配体/提取绑定曲线1:1(探针:蛋白质)化学计量学,这表明这些分子/提取比率是有效地分离ANS PPARß/δ结合位点,即使在不饱和浓度ANS(补充图2)。最后,执行所有的测试后,我们5倍超额的标准化实验ANS(数字5 (c)- - - - - -5 (d)保证所有PPARß/δ由ANS饱和,所有的构象修改造成的配体/受体的枸杞多糖的提取将引发ANS探针位移。在那之后,我们测量和计算了明显的离解常数PPARß/δ绑定到商业受体激动剂GW0742 (1.2±0.3米),GW501516 (1.8±0.1米),l - 165041 (1.09±0.08μ米)(图5 (c))。苯扎贝特并没有打乱俺们探针,行为类似于负控制(车辆,DMSO)(补充图2),这是由它的低特异性和亲和力PPARß/δ(31日]。这个结果意味着我们管道足够敏感的评估low-specificity候选人。然而,它是不可能确定Kd这种类型的候选人。最后,我们的结果显示一个明显的离解常数()0.022±0.008毫克/毫升的热门候选人提取2(图5 (d)),这是非常接近细胞transactivation试验中使用的浓度(0.01毫克/毫升)。
3.7。定量TSA还允许离解常数的计算
确认明显离解常数计算了俺们淬火试验,我们进行了定量测定热转变使用浓度增加GW0742(积极控制)和提取2。据我们所知,这是第一次,ANS淬火试验进行了描述绑定PPARß/之间的亲和力δ绑定口袋,配体。因此,我们提交了提取和商业配体更成熟的协议计算的离解常数(32]。通过我们的研究结果,我们获得了20±3.7μ为提取2 g / mL2.6±0.2GW0742 M,关系非常密切,在同一数量级的俺们淬火试验获得的。通过这种方式,我们确认俺们淬火试验和TSA可用于PPARß/δ离解常数评价,提供了可靠的结果(图6)。
(一)
(b)
4所示。讨论
我们研究的目的是描述一个管道搜索和描述PPARß/δ受体激动剂通过更快、更便宜transactivation初级筛选,紧随其后的是两种生物物理的方法,旨在排除假阳性并选择分子或提取,直接绑定并激活PPARß/δ。
细胞的选择transactivation报告基因检测作为第一步在这个管道允许筛选开始从更多的生理的角度33,34]。在这种情况下,所选择的分子或提取必须渗透细胞膜,找到并与受体结合,促进其激活。尽管其他方法,如TSA, ANS,和烦恼,提出了评估NR配体结合(35- - - - - -37),我们认为transactivation试验生产定量和功能信息在很短的时间内,这使得它的一个最相关和重要的化验化合物筛选和药物发现应用评分量表(33,34]。与此同时,虽然在体外烦恼是最简单的建立与商业套件,它不与细胞条件(37,38]。ANS荧光猝灭也便宜;然而,这对高温超导筛查是费力而要求的,这是一个超出了事实在体外方法(36,39]。此外,尽管TSA是设计为应用于配体筛选35,40),它不考虑自然提取的固有荧光或高疏水性的PPARß/δ小黑裙,这可能会干扰荧光信号。总之,TSA, ANS,烦恼分享生物物理分析的缺点,因为他们并不总是关联与体内研究[34]。
总之,我们建议transactivation报告基因在细胞培养是最逼真的化验,化验,因为他们利用自然信号通路的关系;当配体被添加到系统时,受体被激活,随之而来的记者蛋白质的生产,可以测量(33]。因此,生物物理方法可以和应该作为额外的步骤检查管道,等他们给重要的信息表征直接绑定确认(TSA)和离解常数评价(ANS和TSA)。与烦恼和Lantha-Screen相比,这可能被认为是低于商业套件,这些选择验证方法存在的缺点提供间接测量结果与共激活剂(41- - - - - -43]。
经过广泛调查,我们建立了一个为期3天的transactivation试验,这是减少1到2天的长度相比与其他暂时性的转染细胞化验(15- - - - - -17]。我们也优化孵化介质(10% charcoal-stripped FBS-supplemented DMEM)和细胞浓度(40000细胞/)为我们的实验。主要的改进是荧光素酶底物的体积减少75%,代表设备的使用以及减少75%成本,和它带来创新和优势相比其他transactivation化验在96孔板15- - - - - -17,19]。
几个报告基因筛查NRs一般被描述为有效和快速获取方法NR生理反应在高通量筛选18,44- - - - - -47]。关于PPARß/δ化验,其中大部分是使用瞬时转染采取一个或两天的时间比我们的方法(15- - - - - -17),只有一个例外,这是基于永久性基因转染细胞(记者19]。我们减少测定长度代表筛查活动降低成本。此外,我们发现在一些报告在每个单独做转染的微型板块16),我们认为这种方法不能确认是否所有的井都是同样转染和接收相同的DNA。后其他高温超导筛选化验15,17,18),我们选择在一个批处理中执行转染细胞电镀之前,我们认为更同质的转染细胞,与所有的细胞都包含在提交相同的待遇。
另一个特殊的细节在我们的筛选试验是我们选择1μM浓度进行积极的控制。虽然电子商务50最受体激动剂使用的值(GW0742 GW501516, l - 165041)摩尔范围,大多数transactivation PPARß/化验和检查δ使用一个介于0.1和40之间μ米商业受体激动剂作为一个积极的控制(16,17,19,48]。此外,我们表明,该transactivation化验足够敏感检测PPARß/δ受体激动剂在不同浓度10−11到10−6米,我们获得以下EC50值商业受体激动剂:= 0.71海里,= 10.87 nM,= 26.40海里。通过这种方式,我们的结果表明,我们可以用来探测试验,在低水平,这一受体激动剂激活PPARß/δ。
管道的序列后,两个生物物理方法(TSA和ANS荧光猝灭)是用来描述PPARß/δ配体结合以及Kd评估。几项研究表明,一个ligand-NR复杂结构稳定性相比,其增加apo形式(27- - - - - -30.]。定性提供测量PPARß/ TSA结果δ小黑裙结构稳定性没有或存在商业配体,结果是能够区分高亲和力(GW0742 GW501516, l - 165041)和低亲和力(pan-PPAR受体激动剂苯扎贝特)PPARß/δ配体(5,7,25,31日]。此外,俺们淬火试验和定量TSA评价所选化合物/提取必将hPPARß/δ小黑裙),提供离解常数的值。一些研究表明亲和常数之间的关系,及其配体,和他们中的大多数都是基于细胞剂量反应分析,这间接不变亲和力计算(7,25]。在这里,我们表明配体结合特性的改善方法,使用一个ANS荧光猝灭实验和定量TSA,能够评价化合物的亲和力/提取结合PPARß/δ小黑裙的口袋里。这些方法对于PPARß/δ配体特征比较,明显的离解常数中发现两种方法在相同的范围内,增加我们的Kd的数据可靠性评估。最后,应用这些方法还利用测量的相对活性化合物(或物质的混合物)没有先验信息的要求配体的化学结构(36]。因此,我们建议,这些方法很有用,因为额外的步骤在自然提取的筛选库。
已被广泛报道,天然提取物是好的起点选择的化合物可能扮演了一个重要的角色在人类代谢治疗或预防疾病或调节生理功能(49]。此外,天然植物提取物能显著改善化合物的化学多样性,增加发现具有生物活性的新分子的选择(50),特别是在库的情况下探索特定的巴西生物群落的多样性。研究表明,一个新的集中在代谢综合症的治疗寻找新的PPARs受体激动剂从天然产物,目前低毒性和效率高49,50]。然而,重要的是要提到自然提取的筛选库可能导致低活动信号因为每个测试分数/提取由不同的化合物,其中只有一个可能呈现活动对一个特定的目标。在这种情况下,测量活动往往是小于的获得积极的控制,它通常是由一个孤立的化合物(15,17]。
开发管道测试和最好的描述,我们进行了验证筛选与560年天然提取物Phytobios图书馆,发现31个可能的候选人(图7)。所有的屏蔽板提出了统计参数因子值高于0.5限制(0.53 - -0.64)22),表明这个检测的鲁棒性和可靠性。观察到的变化的积极控制激活不同板块之间的褶皱被认为是细胞分析的内在变化,据报道之前(5,15,17,19,48]。
确认后10候选人次要transactivation化验,我们开始选择这些提取物通过TSA和ANS化验,避免可能的间接和变构相互作用。从定性TSA的结果,两个提取增加了受体熔化温度,这意味着它们含有化学成分,绑定和稳定的三级结构的受体(27,28]。然而,定性TSA允许提取的选择与其他疏水网站交互的组件在蛋白质结构(除了精神的小黑裙)40]。为了克服这个限制,俺们荧光猝灭实验应用于确认之间的物理相互作用化合物/提取和PPARß/δ小黑裙,它允许明显的离解常数的评价()。我们选择最好的提取从图书馆(提取2),结合PPARß/δ与一个的 μ克/毫升。此外,我们执行一个额外的评价,采用定量TSA。通过使用这种技术,我们获得了的 提取2,显示我们的Kd的可靠性评估。
此外,重要的是要提到发现明显的亲和常数()提取2是接近细胞试验中使用的浓度(0.01毫克/毫升),这或许可以解释的低次激活(1.31倍)transactivation试验中发现的。自提取2是多样的化合物的混合物,我们建议至少一个组件提供PPARß/δ激活,绑定与高亲和力的受体。因此,使用更高的提取浓度可能会增加的程度PPARß/δ激活。然而,我们观察到更高的提取浓度2细胞毒性细胞(数据未显示),因此,这将是有趣的分离提取浓缩和分离其生物活性化合物,以减少细胞毒性,并可能增加PPARß/δ激活。
5。结论
总之,我们开发和验证筛查新PPARß/管道δ受体激动剂在图书馆或自然提取的化合物。第一个活细胞筛选提供信息的能力达到候选人激活PPARß/δ。我们优化分析的长度(3天)和阅读试剂的体积(减少75%),代表一个真正的降低成本筛查活动。我们还获得的信息化合物的细胞毒性,增加改善从初级筛选获得的信息。排除间接活化剂PPARß/δ,我们加入了两个在体外生物物理学分析,创建一个管道,搜索化合物/提取,可以激活,稳定三级结构,结合的疏水口袋PPARß/δ,允许计算明显亲和常数。我们筛选560 -自然提取库来测试我们的管道,发现31可能触及主细胞transactivation筛选候选人;从这些,10打候选人选择确认细胞transactivation 2被定性TSA选择,但只有一个被选为打击,因为它提出了一个真正的绑定并激活PPARß/能力δ相对较高的亲和力。到目前为止,我们提出管道礼物只是一个细胞激活筛选的更多信息,因为它涵盖了从细胞到生物物理的角度来看,允许明显的亲和常数的计算除了传统的电子商务50计算。此外,我们减少了试剂的使用和时间的测定,这是相关的大检查活动。最后,这种方法可以提高针对PPARß受体激动剂/筛查的有效性δ药物开发,显著减少transactivation试验的时间和成本。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。
确认
作者承认LNBio设施,垂直距离,LEC,和LDEE蛋白质纯化、光谱学和筛选设备。他们承认LQPN和Phytobios尽管如此,Desenvolvimento e Inovacao Ltda请提供Phytobios库。这项工作是支持Fundacao德帕罗尽管做Estado de圣保罗(FAPESP)必须占州政府(批准号。2013/22648-3和2016/16476-2)和慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq)(批准号403433/2016-9)。
补充材料
补充1。补充图1:测试探针:ANS荧光猝灭测定蛋白质浓度。ANS淬火测试探针和蛋白质的浓度。hPPARβ/δ小黑裙不同浓度从0.25到2μM;从5到20 ANS浓度不同μm . Protein-ANS混合物在4°C孵化1小时。之后,GW0742添加为0.3μ0.5米,μM, 1μ米,3μ5米,μm . DMSO作为车辆。EnSpire多模盘上的试验是读读者(珀金埃尔默)和380海里激发和发射扫描400至600海里,25°C。每个组合的荧光发射强度被绘制的蛋白质和探针9 10 11 12 13 14 15 16浓度在所有发射波长(400 - 600 nm)。选择蛋白和ANS浓度2嗯和10嗯,它提出了最佳signal-to-ratio噪音没有试剂的使用。在图1 - 4 hPPARβ/δ不同浓度的5μ米答;5 - 8,hPPARβ/δ不同浓度的10μ米答;9 - 12,hPPARβ/δ不同浓度的15μ米答;和hPPAR 13 - 16β/δ不同浓度的20倍μ答。
补充2。补充图2:ANS淬火曲线PPARß/δ提交给GW0742(左)或提取02(右)滴定。10μM hPPARß/δ小黑裙和10μ米的答。发现Kds (6.3±1.3μfo GW0742和113.9±75μ提取2 g / mL)很可能高估了,因为可能有多个ANS hPPARß/结合位点δ小黑裙,没有必要到枸杞多糖,但仍然可以观察到GW0742和提取从PPARß/ 02 ANS脱臼δ枸杞多糖。数据均值±SD 独立的复制)。
补充3。补充图3:ANS荧光猝灭为PPAR化验δ商业受体激动剂和候选人。2μM hPPARß/δ小黑裙和20μM ANS孵化1小时在4°C。之后,化合物或混合物提取物添加到0.3μ0.5米,μM, 1μ米,3μ5米,μ10米,μ米,30μ50米,μ米(商业化合物),或者在0.005毫克/毫升,0.01毫克/毫升,0.03毫克/毫升,0.05毫克/毫升,0.1毫克/毫升,0.3毫克/毫升,0.5毫克/毫升,1毫克/毫升(提取)。DMSO作为车辆(负控制)。EnSpire多模盘上的试验是读读者(珀金埃尔默)和380海里激发和发射扫描400至600海里,25°C。每个化合物的荧光发射强度是策划/提取浓度在所有发射波长(400 - 600 nm)。GW0742, GW501516、l - 165041和热门候选人提取2显示,俺们荧光猝灭。苯扎贝特已经相同的模式(DMSO)和没有显示荧光猝灭,这意味着化合物不能打乱俺们从PPARß/δ绑定的口袋里。