量化和监控PPAR新转录记者γ活动

文摘

peroxisome-proliferator-activated-receptor -γ(PPARγ)是核受体超家族的一员,在不同生物过程中起着至关重要的作用,包括脂肪生成、脂质代谢、胎盘发展。研究PPAR的活动γ,我们建立两个新的报告基因:荧光GFP-tagged histone-2B (PPRE-H2B-eGFP)和分泌nanoluciferase (PPRE-pNL1.3 [secNluc])。此研究表明,它们的使用监控PPARγ活动在不同的细胞类型和PPAR的屏幕γ潜在的配体。

1。介绍

PPARγ是一个同种型PPAR子集的核受体,还包括PPAR吗α和PPARβ。他们都绑定到DNA形成类维生素a X受体(RXR)。激活形成目标基因的表达的绑定过氧物酶体扩散国反应元素(ppr),是由直接串联重复序列的共识间隔由单个核苷酸序列。这样的ppr在基因参与脂质代谢和体内平衡1]。PPARγ配体依赖性转录因子是参与胚胎发育(2,3),脂质代谢4,5],胰岛素抵抗[6),炎症(6),免疫反应,和几个组织的分化,包括胎盘和滋养层的分化2,7]。配体结合域PPAR的小黑裙γ有一个更大的和更容易比许多其他三级结构的核受体,使广泛的具有约束力的配体(8]。

在过去的二十年里,PPARγ已成为关注的焦点作为转录因子与代谢综合征(9]。事实上,PPARγ在病态重要角色,如肥胖(10),心血管疾病(11,12),2型糖尿病10),动脉粥样硬化(13),或脂肪代谢障碍14),因为它具有亲脂性的化合物作为配体:例如,脂肪酸及其衍生物。噻唑烷二酮类)是合成配体(PPAR的有力催化剂γ)已被用于治疗2型糖尿病,但终于撤回由于重要的心血管疾病和膀胱癌的副作用(15]。因此一般感兴趣的新PPAR识别γ调节器较低或没有副作用。

PPARs有相对较高的基底活动(16]。到目前为止,描述了两种方法调查PPAR的活动γ基于(我)细胞转染nonsecreted荧光素酶报告基因(暂时性的感兴趣的细胞中17)或稳定使用细胞系(18)和(2)一个人性化的体内记者模型(非洲爪蟾蜍光滑的(19])。

从历史上看,荧光素酶(Luc)基因已成功用于多年(PPREx3-TK-luc PPRE-Luc,例如,(20.,21]),但衡量Luc表达细胞需要细胞溶解,这样不同的是需要在每个时间点的测定。

最近,绿色荧光蛋白(GFP或eGFP)已成为首选的记者体外时间流逝体内成像和分析(19]。惰性记者由紫外线(395海里)兴奋,发出绿色的光(509海里)使其更容易想象使用荧光显微镜。

鉴于PPAR的重要性γ作为一个关键调节器在几个组织,有必要开发一种新的方法来量化和监控PPAR的活动γ在任何类型的细胞。虽然PPARγ转录nonsecreted荧光素酶记者确实存在(20.,21),nuclear-localized荧光和荧光素酶分泌记者适合实时成像(和细胞排序)或没有细胞溶菌作用缺乏量化。这些工具将优势特别是细胞的数量是有限的(例如,主文化),或执行时间。此外,结束时测定,细胞可以用于额外的实验(RT-qPCR,免疫印迹)。

当前的工作描述的建设和评价两个新颖的记者,一个基于GFP (PPRE-H2B-eGFP)和其他分泌荧光素酶(PPRE-pNL1.3 [secNluc])。从这些记者量化转录反应引起,特征明显,我们使用了兴奋剂(GW1929)和PPAR拮抗剂(GW9662)γ在人类滋养层,PPARγ在分化[被激活22]。交换和内分泌组织人类胎盘的合胞体滋养层(ST)。再次怀孕一直是融合与底层绒毛细胞滋养层(VCT)。这种融合过程可以在体外研究,使用人类VCT的主要文化。圣的功能是由测量评估人类绒毛膜促性腺分泌的上层清液(23]。

我们的研究结果证实这两个记者的好处在评估不同的PPARγ特异性配体考虑不同的细胞。

2。材料和方法

2.1。道德的声明

这项研究是根据执行《赫尔辛基宣言》。胎盘获得患者的书面知情同意。协议是经当地伦理委员会批准(CPP 2015 - mai - 13909)。胎盘组织得到简单的怀孕女性的经历正常剖腹产科钦皇家港口,安东尼和Montsouris产科单位(法国巴黎)。

2.2。细胞培养

绒毛细胞滋养层(VCT)隔绝人类术语胎盘如前所述[24- - - - - -26]。简单,几个立方毫米的基板表面急剧被移除。绒毛组织轻轻刮免费使用钳从血管和结缔组织。后彻底清洗两次在1 x Ca2 + DMEM和一次,无Mg2 +哈佛商学院,组织切成小块。约15克的剁碎组织消化一次在50毫升的消化酵素过滤介质(含500毫克的胰蛋白酶粉(Difco), 17.5毫升的脱脂牛奶,250μl DNase我(50 U /毫升),250年μl 0.1 MgCl2,和250年μl 0.1氯化钙温暖1 x Ca2 + 250毫升、Mg2 +无hbs)在37°C为30分钟的第一个周期抖动孵化器(70 rpm)。然后组织孵化了30毫升的消化中10分钟5周期相同的条件。酶促降解监测在光学显微镜下,停止过滤到50毫升管含有5%的边后卫。混合过滤是40μm过滤器(热费希尔科学)去除污染的组织碎片。收集细胞悬浊液和离心机在室温下1200 rpm 10分钟。细胞颗粒悬浮在3毫升的DMEM,分层的预制Percoll梯度(60%,50%,45%,35%,30%,20%,和10%)和离心机2500 rpm在室温下没有刹车了20分钟。Percoll的45%和35%之间的层含有滋养层细胞收集,悬浮在DMEM和离心机1200 rpm在室温下10分钟。由此产生的细胞颗粒悬浮在完成DMEM (PS 1%谷氨酰胺,1%,和10% FCS)和细胞数使用TC20™自动细胞计数(Biorad)。细胞被播种在三胞胎在无菌24-well板(250.000 /嗯,康宁)nanoluciferase荧光素酶测定(PPRE-pNL1.3转染)或无菌12-well细胞culture-treated塑料幻灯片(40.000 / Ibidi)荧光实验(免疫荧光和PPRE-H2B-eGFP转染)。

2.3。质粒结构

PPRE-H2B-eGFP和PPRE-pNL1.3由pcr方法使用适当的引物(表1)。过氧物酶体扩散国的反应元素(PPRE)序列PCR扩大了使用PPRE ApoCIII -pGL3构造作为模板。扩增片段subcloned入KpnI / BglII网站分泌NanoLuc®荧光素酶记者向量,pNL1.3 secNluc (Promega公司)和H2B-eGFP AseI / NheI网站的质粒(Addgene # 1168027])。质粒的一般结构如图1。记者证实了质粒序列的完整性DNA测序。质粒DNA是准备使用试剂盒质粒转染迷你和Midi包。

2.4。治疗和PPRE-H2B-eGFP PPRE-pNL1.3 secNluc转染

细胞治疗1μM GW1929(受体激动剂,# ab142213 Abcam)或1μM GW9662(拮抗剂,# ab141125 Abcam)稀释培养基中含有1%的谷氨酰胺和10% FCS(没有PS) 2 h。转染前细胞被洗,然后用Opti-MEM孵化我没有血清培养基(Gibco;200年μl / 12-well幻灯片或500年μl / 24-well板)。对于PPRE-H2B-eGFP的瞬时转染,VCT在12-well转染细胞culture-treated塑料幻灯片(Ibidi)使用Lipofectamine 3000(表达载体)后,制造商的协议。短暂,质粒DNA和Lipofectamine分别稀释在Opti-MEM我没有血清培养基(Gibco)。然后,DNA结合Lipofectamine混合物在室温下和孵化5分钟。最后,DNA-Lipofectamine复合物添加一滴一滴地每个(25μ信用证)。瞬时转染的PPRE-pNL1.3或pNL1.3基本荧光素酶分泌记者控制,VCT转染在24-well板块(康宁)使用Lipofectamine 3000(表达载体)后,制造商的协议。短暂,质粒DNA和Lipofectamine分别稀释在Opti-MEM我没有血清培养基(Gibco)。然后,DNA结合Lipofectamine混合物在室温下和孵化5分钟。最后DNA-Lipofectamine复合物添加一滴一滴地每个(50μ信用证)。四个小时后,转染细胞再次清洗和治疗1μM GW1929或1μM GW9662 48 h。

2.5。免疫荧光和图像分析

文化72 h后,细胞被固定在4% PFA在室温下20分钟,洗在PBS, permeabilized 0.5% Triton x - 100在PBS 30分钟。然后,细胞被封锁在5% BSA免疫球蛋白自由和PBS Tween-20 0.1% 1 h在室温和PPAR (i)γ表达,细胞与初级PPAR孵化γ抗体(E-8从圣克鲁斯,1 - 100)阻碍解决方案;(2)PPRE-H2B-eGFP转染细胞,只有Alexa萤石®555 Phalloidin和DAPI标记进行。第二天,细胞被冲洗三次,0.1% Tween-20 PBS (PBST),然后染色显示了VectaFluor™Excel R.T.U.抗体工具包,DyLight®488, Anti-Mouse免疫球蛋白(dk - 2488、向量实验室)根据制造商的指示。与PBST三洗后,细胞被孵化Alexa萤石555 Phalloidin (PBST分子探针,1/200)1 h,在黑暗中在室温下,然后在PBST洗了三次,在室温下与DAPI复染色10分钟。最后幻灯片与Fluoromount-G安装(分子探针)和储存在4°C。共焦显微镜图像(用徕卡时不时显微镜获得配备计划Apo 63 x / 1.4石油客观和CoolSnap HQ2 CCD相机)是处理ImageJ(国家卫生研究院https://imagej.nih.gov/ij/)或冰(巴斯德研究所,http://icy.bioimageanalysis.org/)。

2.6。西方墨点法

文化72 h后,总细胞提取准备使用NP40细胞裂解缓冲(表达载体)。通过sds - page及免疫印迹蛋白质样本解决GFP抗体(1μg / ml,σ)和肌动蛋白(0.2μg / ml, Sigma-Aldrich)。与适当的Alexa Fluor-conjugated孵化后二次抗体(680或800共轭分子探针)的屁股被显示通过使用奥德赛红外荧光系统(Li-Cor)。

2.7。Nanoluciferase化验

VCT转染PPRE-pNL1.3或基本pNL1.3在24-well板培养72小时37°C下48 h后治疗方法:1μM GW1929或1μM GW9662。经过24小时的治疗,50或100μl(每个细胞上清液被分发到96孔板的井(# 3610,康宁公司),然后冻结在−20°C。经过48小时的治疗,96孔板在室温下解冻,50或100μl(每个细胞上清液被分发到井相同的96孔板。的分泌量NanoLuc荧光素酶活性测定使用Nano-Glo®荧光素酶测定(Promega公司)根据制造商的指示。发光在每个被使用EnSpire然后测量多模板读者(珀金埃尔默)。

2.8。统计数据

每个试验(三个独立的实验 )。PPRE-H2B-eGFP实验,分析了最少100核/条件。量化,荧光信号集成在整个原子核。PPRE-pNL1.3 [secNluc]实验,每个条件运行一式三份。每个发光读数归一化到相应nontransfected细胞控制。数据表示为均值±SD数量表示。统计分析(配对以及软件)都使用了GraphPad棱镜6。结果被认为是重要的如果值< 0.05。

3所示。结果

3.1。PPARγ表示在绒毛细胞滋养层(VCT)和高度表达的合胞体滋养层(ST)和在滋养层细胞分化过程中发挥作用

疣状,PPARγ抗体在初级滋养层细胞,表明PPARγ表示在VCT和圣,更高的表达式在圣(参见图S1补充(a)在网上补充材料吗https://doi.org/10.1155/2017/6139107)。此外,治疗1μM GW1929 (PPARγ受体激动剂)显著增加融合指数而VCT治疗1μM GW9662 (PPARγ拮抗剂)明显降低细胞融合。这表明PPAR的增加γ活动会导致增加圣形成,而PPAR下降γ活动会导致减少圣形成(补充图S1 (B))。不仅如此而且治疗1μM GW1929显著增加人类绒毛膜促性腺分泌而VCT治疗1μM GW9662明显降低人类绒毛膜促性腺分泌。这表明PPAR的增加γ活动会导致人类绒毛膜促性腺分泌的增加,而PPAR下降γ活动会导致人类绒毛膜促性腺分泌减少(补充图S1 (C))。总的来说,PPAR的增加γVCT的活动将会增加细胞融合形成导致更多的多核圣所以更高水平的分泌促。

3.2。VCT PPRE-H2B-eGFP转染:一个新的模型可视化PPAR的活动γ

初级滋养层与新建的转染质粒PPRE-H2B-eGFP显示PPAR的正常活动(正常强度)γ在未经处理的细胞核(图2)。这个活动增加了细胞治疗1μM GW1929 (PPARγ受体激动剂),而它减少细胞治疗1μM GW9662 (PPARγ拮抗剂;图2(一个))。三维分割是用来量化信号而定义核边界(图2 (b))。图示显示的荧光强度显著增加(约2.5倍)的细胞治疗1μM GW1929,虽然有明显降低(约2倍)的细胞治疗1μM GW9662(图2 (c))。经免疫印迹(图2 (d)),这说明质粒PPRE-H2B-eGFP很大的帮助研究PPAR的活动γ在初级滋养层通过可视化方法。

3.3。VCT PPRE-pNL1.3 (secNluc)转染:一个新的模型来研究PPAR的活动γ没有细胞溶菌作用

另一种方法,用于研究PPAR的活动γ在初级滋养层与新PPRE-pNL1.3质粒,转染VCT PPAR的表达γ导致转染细胞的分泌到上层清液的荧光素酶蛋白质。分光光度法阅读50μl 24和48小时的上层清液PPRE-pNL1.3转染/千瓦对待VCT显示发光强度的增加1μM GW1929 (PPARγ受体激动剂)和发光强度下降1μM GW9662 (PPARγ拮抗剂)nontransfected相比,细胞与细胞治疗中更相关的结果(图48小时2 (e))。另一方面,分光光度法100年阅读μl的上层清液24 - 48小时PPRE-pNL1.3转染/千瓦对待VCT显示发光强度的增加1μM GW1929 (PPARγ受体激动剂)和发光强度下降1μM GW9662 (PPARγ拮抗剂)相比nontransfected细胞在细胞治疗提供更加相关的搜索结果(图48小时2 (f))。这些结果表明,完全PPAR PPRE-pNL1.3是另一个伟大的工具来研究γ活动主要滋养层细胞裂解,这样他们可以进一步用于其他实验。

3.4。PPRE-H2B-eGFP模型适用于不同类型的细胞

确认PPRE-H2B-eGFP从事其他细胞,一个PPAR疣状γ抗体进行转染后对人类或牛细胞在实验室,也就是说,人类主要滋养层细胞,人类BEWO滋养层细胞,人类胎盘间充质细胞,或牛胚外中胚层细胞(bXMCs)。Immunocytofluorescence PPAR表达的四种细胞类型的数据证明γ,PPARγ转录活性检测的核由于翻译eGFP荧光报告基因(补充图S2)。

4所示。讨论

总之,当前的工作证明的有效性两个小说PPRE记者系统PPAR的体外研究γ活动。一方面,我们的小说分析使用一个分泌nanoluciferase高度敏感只需要少量的培养基对荧光素酶活性随时间的变化进行评估。另一方面,我们的可以用于监控PPAR GFP的记者γ活动通过实时成像。此外,这些工具可以很容易地适应大规模筛选的化合物(96或384孔板)可以确定对PPAR激动剂或拮抗剂的影响γ活动感兴趣的细胞。

数据访问

PPRE-H2B-eGFP和PPRE-pNL1.3 [secNluc]质粒中描述的这个报告已经提交了加入非营利组织质粒库Addgene (https://www.addgene.org/),将质粒# 84393和质粒# 84394,分别。

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

确认

作者感谢Stephane Mandard (INSERM U866,勃艮地大学法国)和Promega公司提供PPRE-pGL3 pNL1.3质粒,分别。作者还要感谢科钦研究所成像设备。这项工作是支持的ans (PhthalatPreG项目)。

补充材料

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