文摘

背景。过氧物酶体proliferator-activated受体-α(PPAR -α)是与心脏肥大的发展密切相关。先前的研究已经表明,苯扎贝特(BZA), PPAR -α受体激动剂,可以减弱胰岛素抵抗和肥胖。本研究旨在确定BZA可能防止压力overload-induced心脏肥大。方法。小鼠口服给予BZA(100毫克/公斤)7周开始1周后主动脉条带(AB)手术。基于超声心动图评估心脏肥大,组织学和分子方面。此外,新生儿鼠心室心肌细胞(NRVMs)被用来调查BZA对体外心肌细胞肥厚性反应的影响。结果。我们的研究表明,BZA可以减轻心脏肥大和纤维化小鼠受到AB手术。BZA治疗也减少了磷酸化蛋白激酶B(一种蛋白激酶)/糖原合成酶激酶3β(GSK3β)和增殖蛋白激酶(MAPKs)。BZA抑制去甲肾上腺素- (PE)体外诱导心肌细胞肥大。的保护作用BZA被治疗的PPAR -废除α拮抗剂在体外。结论。BZA可能减弱压力overload-induced心脏肥大和纤维化。

1。介绍

心脏肥大的定义是增加心肌细胞大小、间质纤维化和心脏功能障碍(1,2]。心脏肥大可能导致室性心律失常和增加致命的心血管事件的发生率3]。精确的心脏肥大的调节机制尚不清楚。然而,越来越多的证据表明,蛋白激酶B(一种蛋白激酶)/糖原合成酶激酶3β(GSK3β)和增殖蛋白激酶(MAPKs)在心脏肥大的发展上发挥了关键作用[4]。

一种蛋白激酶被激活后的心脏肥厚性刺激。此外,一种蛋白激酶过度诱导心肌细胞显著增加细胞大小(5,6]。一种蛋白激酶GSK-3也导致失活β和导致心脏肥大的过程7,8]。MAPKs也与肥厚性反应的发展密切相关。据报道,细胞外signal-regulated激酶(ERK)和P38在肥厚性心被激活,激活的抑制ERK和P38可能缓解肥厚性反应(9- - - - - -11]。因此,发现药物可以抑制这些prohypertrophic信号通路的重要性。

过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs)是配体依赖性转录因子的核受体超家族12]。PPAR -α心脏中高度表达,可以调节脂质代谢的体内平衡13,14]。先前的研究已经发现,心脏PPAR -α缺乏导致肌凝蛋白功能障碍,明显减少心脏收缩功能和氧化损伤的增加(15,16]。苯扎贝特(BZA) PPAR -α受体激动剂,被广泛应用于治疗高脂血症和也可以减弱肝脂肪变性和调节胰岛素抵抗和肥胖17]。此外,以往的研究结果表明,PPAR -α受体激动剂抑制一种蛋白激酶的激活noncardiomyocytes [18]。但是,BZA能否影响心脏肥大显然没有被研究。本研究旨在探讨BZA对压力超负荷引起的心肌肥大的影响以及揭示出其潜在的机制。

2。材料和方法

所有动物实验程序批准的实验室动物保健和使用指南的中国动物福利委员会和人民医院的指导方针。

2.1。试剂

BZA收购从σ(B7273,纯度> 98%)。去氧肾上腺素(PE、P1240000)从Sigma-Aldrich获得。Anti-PPAR -α(sc - 9000)和anti-PCNA (sc - 7907)购买从圣克鲁斯生物技术。下面的第一抗体购自细胞信号技术:anti-AKT (# 4691), anti-phospho-AKT (# 4060), anti-GSK3β(# 9315),anti-phospho-GSK3β(# 9323 p), anti-ERK (# 4695), anti-phospho-ERK (# 4370 p), anti-P38 (# 9212 p), anti-phospho-P38 (# 4511 p), anti-AMPKα(# 2603 p)和anti-phospho-AMPKα(# 2535)。Anti-GAPDH (# ab8245), anticalcineurin(可以)(# ab90540),和anti-NFAT1 ABCAM (# ab2722)获得。反α辅肌动蛋白从微孔中获得。二次抗体购自LI-COR生物科学。PPAR -α拮抗剂(GW6471 G5045), PPAR -β/ 拮抗剂(GSK0660 G5797)和PPAR -γ拮抗剂(GW9662 M6191)都从Sigma-Aldrich购买。所有其他化学试剂均为分析纯。

2.2。动物和治疗

雄性C57BL / 6小鼠(8 - 10周大)购买实验动物研究所的科学,凸轮&曾经(中国,北京),和美联储在环境温度和湿度控制。小鼠完整的能够自由获取水和食物在12 h光暗周期。一周后,所有的动物被随机分为4组:假+车辆,假+ BZA AB +车辆,AB + BZA。的剂量BZA用于我们的研究是确定根据一篇文章(19]。老鼠给BZA溶解在盐水(100毫克/公斤,每天17点)7周开始AB手术后1周。对照组的老鼠受到同样体积的生理盐水。AB手术的细节被描述在一篇文章20.]。七周的治疗后,进行超声心动图检查。然后,所有的动物都被处以安乐死之前收集他们的心和体重。

2.3。超声心动图分析和血流动力学检测

超声心动图参数获得根据我们上一篇文章(21]。MyLab 30简历(Esaote SpA、热那亚、意大利)配备10 MHz线性阵列使用超声波换能器。左心室收缩末期直径不全(LVSD)和舒张末期直径(LVDD)检测到的乳头状水平M-mode跟踪扫描速度的50 mm / s。测量血流动力学参数的变化,microtip导管传感器(spr - 839,米勒仪器,休斯顿,德克萨斯州,美国)插入到颈动脉,直到在左心室监控压力信号和心率不断咏叹调压力-容积电导系统[22]。

2.4。组织学分析

心被逮捕在10%氯化钾和10%福尔马林固定。然后,他们用石蜡和嵌入式减少横向。Haematoxylin-eosin(他)和picrosirius红色(PSR)技术被用于组织学分析。染色后,我们使用了数字分析系统(Image-Pro + 6.0版本;美国媒体控制论,马里兰州贝塞斯达)评价横截面积(CSA)的细胞和胶原蛋白的比例。我们概述了每组至少200细胞。

2.5。免疫印迹分析

里帕缓冲区被用来从心灵中提取的蛋白质。总核蛋白质提取如前所述[23,24]。蛋白质的浓度检测使用BCA蛋白质分析工具包(猫。23227号;美国马热费希尔科学、沃尔瑟姆)。然后,蛋白质分离的10% sds - page和转换到PVDF膜(猫。IPFL00010数量;美国马EMD微孔,Billerica)。随后,他们孵化与不同的初级和二级抗体抗体隔夜孵化之前1 h。最后,分析了膜和量化使用奥德赛红外成像系统(美国东北LI-COR生物科学,林肯)。

2.6。实时聚合酶链反应分析

从冰冻的心通过RNA提取试剂盒(猫。号码15596026;英杰公司生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国)。互补脱氧核糖核酸合成的1μg RNA从每组使用RT试剂盒(cat '脚本。RR047Q数量;豆类生物科技(大连)有限公司)。定量分析进行了使用LightCycler 480赛博绿色主混合(猫。号码04896866001;罗氏诊断GmbH)。引物的细节都展示在表1。

表1
引物用于这项研究。
2.7。细胞培养和染色

新生大鼠心室细胞(NRVMs)被孤立如前所述25]。NRVMs是培养与杜尔贝科修改鹰中/营养混合物F-12火腿(与10%胎牛血清的DMEM / F12)(的边后卫)(GIBCO, 10099), 1%链霉素(100毫克/毫升;GIBCO, 15140)和青霉素(100 U /毫升)。我们使用溴脱氧尿苷(0.1毫米),以防止纤维母细胞生长。心脏细胞的纯度进行评估与抗体阳性染色α辅肌动蛋白。细胞最初播种到six-well文化板块48 h DMEM和10%的边后卫,然后只提供0.5% DMEM 12 h。最后,去甲肾上腺素(50 摩尔)添加到媒体刺激BZA细胞有或没有。免疫荧光染色法被用来分析肌细胞表面。染色细胞,NRVMs是固定的4%甲醛和渗透的0.1% Triton x - 100。随后,反的细胞被染色α辅肌动蛋白(1:100稀释)在孵化前用Alexa萤石568 -山羊anti-mouse二级抗体(表达载体,A11017)。Image-Pro + 6.0软件被用来检查细胞区域。

2.8。统计分析

所有的数据表示为均值±SD。使用单向方差分析数据进行了分析。图基的测试是用来进行事后分析。 被认为显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。BZA改善小鼠心脏功能受到AB手术

老鼠受到AB手术发达心脏功能恶化,就是明证LVDD的增加和减少左心室部分缩短(LVFS)和射血分数(LVEF)(图1(一))。调查BZA的影响,给出的老鼠BZA溶解在盐水(100毫克/公斤,每天17点)7周AB手术后1周开始。这些超声心动图改变BZA治疗后的改善。压力过载也导致明显减少心脏收缩性,以dP / dT max和dP / dT min(图1 (b))。BZA治疗恢复受损的心脏收缩性(数据1(一)- - - - - -1 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
超声心动图和血流动力学参数在老鼠受到BZA(100毫克/公斤)。(一)超声心动图参数( = 10 - 13)。表示组(b)血流动力学参数( )。与假+车辆相比, 。与AB +车辆相比, 。
3.2。AB BZA减毒引起的心肌肥大手术

老鼠受到AB手术表现出显著肥厚性反应与虚假的集团相比,在图中以增加心脏重量/体重(HW / BW),心脏重量/胫骨长度(HW / TL),和CSA(数据2(一个)- - - - - -2 (c))。然而,老鼠受到BZA治疗肥厚性反应明显减少了。这些结果证实了分析的心房利钠肽(ANP)、脑利钠肽(BNP),α肌球蛋白重链(αmhc),β肌球蛋白重链(βmhc)(图2 (d))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图2
BZA抑制心脏肥大体内。(一)心脏总值( )。(b)的结果HW / BW和HW / TL比( = 12 - 15)。(c)的横截面区域虚假和AB组和没有BZA ( )。(d)的mRNA水平ANP、BNP,αmhc,βmhc ( )。
3.3。BZA阻塞心脏纤维化

AB的观察小鼠接受手术,胶原沉积在间质和血管周的空间增加(数据3(一个)- - - - - -3 (b))。此外,mRNA水平的胶原蛋白,胶原蛋白三世和结缔组织生长因子(CTGF)在AB组明显增加(图3 (c))。然而,这些病变是BZA治疗后缓解。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图3
BZA抑制心脏纤维化体内。(a)的组织学表现PSR左心室和血管纤维化( )。(b)的胶原蛋白水平的骗局和AB集团的存在和缺乏BZA治疗( )。(c)的mRNA水平胶原蛋白,胶原蛋白三世和结缔组织生长因子(CTGF) ( )。
3.4。GSK3 BZA抑制MAPKs和AKT /β信号通路对肥厚性刺激的反应

如图4蛋白质水平的PPAR -αAB手术后表达下调。此外,作为一个PPAR -α受体激动剂,BZA可以移植减少PPAR -α。压力过载导致一种蛋白激酶的磷酸化和GSK3升高β。相反,BZA GSK3抑制AKT激活/治疗β途径。此外,PPAR -α激活BZA可以降低ERK的磷酸化而不是P-P38。在P-AMPK没有显著差别αAB +车辆和AB + BZA组之间。


图4
GSK3 BZA AKT /的效果β,AMPKα和MAPK信号通路。的相对定量结果PPAR -α、P-AKT P-GSK3β、P-ERK P-P38, P-AMPKα在四组( )。
3.5。BZA减毒在苯肾上腺素的体外心肌细胞肥大

进一步了解BZA在肥大的影响,NRVMs受到体育诱导肥大细胞在体外(图5)。正如所料,BZA减少增加细胞区域和肥厚性标记。尽管PPAR -α拮抗剂(GW6471 20 摩尔)并不影响细胞区域基线,GW6471废除保护BZA对肥大细胞的区域和ANP水平(图5)。PPAR -β/ (GSK0660, 1 摩尔)和PPAR -γ(GW9662 10 摩尔)拮抗剂对BZA-mediated保护(图没有影响6)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图5
BZA屏蔽体外心肌细胞肥大的过程。(一)新生大鼠心室心肌细胞的可行性由去甲肾上腺素刺激( )。(b)的ANP水平BZA和苯肾上腺素在不同浓度( )。(c)的代表展览心肌细胞在免疫荧光染色( )。(d)心肌细胞的平均细胞面积( )。
(一)
(一)
(b)
(b)
图6
下的影响不同的PPAR亚型拮抗剂BZA治疗与去甲肾上腺素刺激时。(a)的平均细胞面积心肌细胞在处理不同类型的PPAR亚型与去甲肾上腺素和BZA ( )。(b)心肌细胞的平均细胞面积与一个孤独的抑制剂( )。
3.6。BZA没有显著影响/ NFAT-1信号通路,炎症和细胞凋亡

如图7,我们测量的蛋白质含量可以/ NFAT-1信号通路。没有显著差异,NFAT-1 AB +车辆和AB + BZA组之间的细胞质和细胞核。此外,BZA也无显著影响的mRNA水平伯灵顿和bcl - 2。关于炎症反应、mRNA水平的单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1) BZA治疗下略有下调,而interleukin-1β(il - 1β)和肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)没有显著影响BZA治疗。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图7
BZA的影响可以/ NFAT1信号通路,炎症和细胞凋亡。(一)的蛋白质水平可以/ NFAT1细胞质和细胞核( )。(b)的mRNA水平il - 1β、MCP-1和TNF -α在BZA治疗( )。(c)的mRNA水平伯灵顿和bcl - 2 ( )。

4所示。讨论

我们的研究表明,BZA可以抑制心脏肥大的体内和体外。BZA缓解心脏纤维化引起的过载压力。此外,一种蛋白激酶的磷酸化/葛兰素史克β和MAPKs信号通路BZA治疗后表达下调。BZA也减少PE-induced细胞肥大。影响被PPAR -废除α拮抗剂在体外。

作为能源代谢调节剂,PPAR -α可以调节心脏代谢底物转化在心脏肥大,心脏衰竭,缺血性心脏病(26]。先前的研究结果说明,PPAR -α有各种功能,包括细胞外基质重塑和炎症反应。缺乏PPAR -α导致更明显肥厚性反应和心脏功能恶化伴随着增强炎症标记物的表达和细胞外基质重塑(27]。激活PPAR -α改善心脏功能在糖尿病心肌病(28,29日]。PPAR -α受体激动剂可以阻止心脏肥大引起endothelin-1 [30.,31日]。与这些研究的结果相一致的是,我们的研究结果还表明,BZA心脏肥大体内和体外变弱。然而,不同的角度是,老鼠的心脏过度PPAR -α开发的自发性心肌细胞肥大(32]。在先前的研究中,蛋白质含量的PPAR -α更丰富的(15 - 135折)在转基因动物的心比nontransgenic同窝出生的。在我们的研究中,PPAR -α略被BZA激活,这可以解释不同的研究之间的差异。先前的研究也报道,PPAR受体激动剂对心脏的影响是由non-PPAR效果。非诺贝特被发现产生有害的多向性的PPAR -心肌动作α有缺陷的小鼠(33]。与以前的研究结果不一致,我们的研究表明,保护BZA对心肌细胞肥大的影响可以被PPAR -α对手而不是PPARβ/ 和PPAR -γ抑制剂,这意味着BZA变弱通过PPAR -心脏肥大α。这一发现表明,过度的心肌脂肪酸吸收加上葡萄糖利用减少可能导致心脏中过多的脂质积累和夸张的心脏重塑。有理由相信BZA治疗恢复正常状态的能量平衡,防止心脏肥大的恶化。

先前的研究已经表明AKT的过度导致明显的心脏肥大,显著增加心肌细胞大小(34]。此外,肥厚性反应可以缓解一种蛋白激酶基因敲除小鼠(35]。我们的实验室工作结果表明,抑制一种蛋白激酶/ GSK3β明显变弱压力overload-induced心脏肥大(36]。非诺贝特,PPAR -α受体激动剂,以前发现减轻肾ischemia-infusion损伤和glucose-induced矩阵沉积通过AKT通路(37,38]。此外,非诺贝特缓解endothelin-1-induced心肌细胞肥大GSK3通过抑制一种蛋白激酶的磷酸化和β(39]。与这些研究的结果相一致的是,我们的数据也显示,AKT GSK3 /β在BZA治疗表达下调,意味着一种蛋白激酶/ GSK3吗β心脏保护由BZA扮演了一个角色。兵被激活在新生儿心肌细胞肥厚性刺激的反应。此外,用药物抑制ERK大大阻碍了肥厚性反应(40]。据报道,PPAR -α激活能改善aldosterone-induced心脏重构在成年大鼠心室细胞,部分是通过抑制ERK的磷酸化41]。在我们的研究中,ERK的磷酸化是明显下调BZA AB手术后治疗。P38还与心脏肥大(密切相关42]。具体P38抑制剂或消极P38突变表达减弱心肌细胞肥厚性刺激增长的回应,而过度的P38导致肥厚性反应(43,44]。先前的研究表明,激活PPAR -α减少P-P38缓解肾损伤(45]。然而,不同的角度是PPAR -α抑制黑素原生成通过upregulation P-P38 [46]。不符合这些研究的结果,我们的结果表明,BZA P-P38水平没有明显的影响。不一致的结果的原因是,人们在不同的病理过程中扮演不同的角色。

作为一个能源传感器,AMPKα被最广泛的调查在能量代谢在生理和病理条件下(47]。我们以前的工作表明,AMPK活化α可以减轻肥厚性反应(48,49]。此外,它已被证明,PPAR -α可以增强AMPK的磷酸化作用吗α棕榈酸酯减少网压力诱导的人类心脏细胞(50]。出乎意料地,AMPK的差异不显著αBZA治疗后观察AB组在我们的研究中,这意味着AMPK吗α不会导致心脏肥大BZA的保护作用。

先前的研究已经表明,CaN-NFAT心脏肥大的发展中起着重要作用,overactivation PPAR -α可能会导致核易位的NFAT-1细胞质细胞核(39,51]。然而,我们的研究发现的蛋白质含量没有显著差异之间/ NFAT-1 AB +车辆和AB + BZA组。炎症生物标记物是调节在肥厚性反应。早期研究发现激活PPAR -α能抑制炎症激活和减少巨噬细胞在动脉粥样硬化的发展的活动52,53]。我们的研究结果显示,只有MCP-1 BZA治疗下略下调。此外,在我们的研究发现细胞凋亡。伯灵顿的mRNA水平和bcl - 2在BZA治疗大约保持不变。所有这些结果暗示BZA并非由的保护作用/ NFAT1,炎症和细胞凋亡通路。

纤维化,心脏重塑的另一个重要的病理生理过程,特点是胶原蛋白的积累和细胞外基质的沉积。一项研究表明,PPAR -αKO小鼠表现出进步的心脏纤维化和加重心脏肥大(50]。陈等人。54)发现激活的PPAR -α减毒引起的肝纤维化蛋氨酸choline-deficient饮食。此外,Suk et al。55)表明,BZA抑制纤维发生在鼠性脂肪肝模型。与这些研究的结果相一致的是,我们观察到BZA治疗变弱AB-induced心脏纤维化。PPAR -的激活αBZA治疗可能造成的潜在机制介导antifibrotic效果。

总之,我们的研究表明,BZA可以预防心脏肥大引起的过载压力。GSK3 BZA也抑制一种蛋白激酶的激活/β和ERK在肥厚性心。通过PPAR - BZA缓解PE-induced肥大心肌细胞α。我们的研究提供了实验证据的应用BZA治疗心脏肥大。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Si-Chi徐和马Zhen-Guo贡献了同样的工作。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金项目(8147056)。