Chiglitazar优先通过Configuration-Restricted绑定和磷酸化调节基因表达抑制PPARγ

文摘

用insulin-sensitizing药物治疗2型糖尿病通常称为thiazolidinediones (TZD),改善胰岛素抵抗和血糖控制。尽管其疗效在治疗糖尿病,这些药物提供小的保护从著名的心血管疾病和糖尿病有关。这里我们演示chiglitazar, configuration-restricted non-TZD过氧物酶体proliferator-activated潘受体(PPAR)激动剂与适度的转录活动优先调节ANGPTL4和PDK4参与葡萄糖和脂质代谢。CDK5-mediated磷酸化丝氨酸273 (S273)是一个独特的留给PPAR监管机制γ,这一事件与胰岛素抵抗在2型糖尿病。我们的数据表明,chiglitazar调节基因表达不同于两个服用tzd,罗格列酮和吡格列酮,通过其configuration-restricted绑定和磷酸化PPAR的抑制γ。Chiglitazar诱导显著更大的表达ANGPTL4和PDK4比罗格列酮和吡格列酮在不同的细胞模型。这些增加的表达式是依赖PPAR的磷酸化状态γ在S273。此外,芯片和AlphaScreen化验表明,磷酸化在S273抑制启动子被PPAR绑定和代数余子式招聘γ。基于这些结果,活动从锅兴奋剂chiglitazar可以是一个有效的长期治疗的一部分战略治疗2型糖尿病的一个更为平衡的行动在其目标器官。

1。介绍

代谢综合征,包括2型糖尿病(T2DM)病人体内及其相关并发症(如肥胖、心血管症状,血脂异常),全世界有重大的影响。目前抗糖尿病的治疗,尤其是insulin-sensitizing类的药物称为thiazolidinediones (TZD)(即。,rosiglitazone (Ros) and pioglitazone (Pio)), improve insulin resistance and glycemic control with benefit of improvement in rental complication. However, they offer ambiguous protection from eminent cardiovascular risks associated with the diseases. Moreover, the related side effects, such as water retention and body weight gain, rather impair their extended uses in long-term management of diabetic patients. Nevertheless, the TZD class of peroxisome proliferator-activated receptorγ(PPARγ)受体激动剂是一个主要的和重要的治疗,保护胰腺胰岛素抵抗的直接目标β胰岛细胞,在糖脂调制特异表达转录程序,传授抗炎保护。这些药物也表现出更多的预防效果和提供更持久的糖化血红蛋白控制比其他糖尿病治疗(1,2]。在中国,不到三分之一的T2D患者接受一个持久控制糖化血红蛋白和只有5.6%的患者T2D提供葡萄糖代谢功能实现全面控制,脂质,和血压3]。因此,开发新型胰岛素增敏剂治疗2型糖尿病和相关并发症仍是极大的兴趣和潜力。

PPARγ随着PPAR服用tzd的主要目标α和PPARδ是ligand-activated核激素受体超家族的成员表达在不同组织与重叠或独特的生物活性在控制血糖,血脂,能量体内平衡。总之,PPARγ主要是存在于脂肪组织巨噬细胞和功能分区,脂肪酸从脂肪组织(FAs)肌肉,肝脏,和流通,从而提高胰岛素抵抗[4]。PPARα主要表现在肝脏、心脏、肌肉和肾脏,刺激足总氧化,改善脂蛋白代谢(5]。尽管PPARδ表示无所不在,它的功能是定义和PPAR吗δ主要是视为一个重要的监管机构的新陈代谢和生热作用[6]。所有三个亚型也通过不同施加多向性的抗炎作用机制调节增殖或胆固醇在血管内皮细胞和巨噬细胞(营业额7]。有争议的是,PPARα和PPARδ促进骨的成骨细胞活动,而PPARγ促进破骨细胞活动(8]。考虑他们的相互补偿,有时敌对的效果,更少的强有力的和均衡的三个PPAR激动剂,目标亚型可能提供更全面的保护从代谢紊乱和心血管疾病的陪同下,以及抵消不良的副作用,如体重增加和骨折与高活性PPAR有关γ在T2DM病人中受体激动剂(9,10]。到目前为止,还没有开发的临床证明药物这样的策略,很可能由于难以区分一个影响为同一目标或将从另一个均衡的活动从不同的亚型。

最近,一些研究报道,特定的PPAR抑制γ磷酸化“病态的”刺激引起,如高脂肪饮食、肥胖、炎症,273 (S273) TZD和丝氨酸合成配体,导致基因表达谱变化导致胰岛素抵抗动物和人类。因此,这一事件可能歧视中发挥独特作用insulin-sensitizing从其他副作用,如体重增加和水肿,曾经是PPAR有关γ服用tzd激活的(11- - - - - -14]。

Chiglitazar(气)是一个configuration-restricted non-TZD潘PPAR激动剂,AC50为1.2,0.08和1.7μ在会阴PPAR的细胞α,PPARγ,PPARδ目前分别在三期临床发展在中国。这种化合物是一个温和的转录激活的所有三个PPAR亚型和诱发不同的基因调控模式相比TZD类药物在体外和在活的有机体内(15,16]。在动物实验中,与Ros相比,气了类似的抗糖尿病的作用,但是更少的负面影响体重和脂肪垫重量增加KKAy和db / db糖尿病小鼠模型(16]。这种化合物也在味精生产大大改善了血脂L-glutamate——(味精)诱导肥胖大鼠15]。

在本文中,我们报告优先诱导两个重要的PPAR目标基因,ANGPTL4(angiopoietin-like 4)PDK4(丙酮酸脱氢酶激酶同工酶4)参与脂质代谢和胰岛素敏感,相对于Ros和Pio。这些基因被PPAR主要监管δ和其他PPAR在较小程度上的亚型(17,18]。微分感应的气似乎并不完全是由于其锅受体激动剂活性。相反,我们的结果表明,基因都是直接由CDK5——(细胞分裂蛋白激酶5 -)介导的磷酸化PPARγS273,影响代数余子式招聘PPAR的受体和绑定γ包含复杂的转录PDK4和ANGPTL4启动子。气的独特结构使其不同的绑定和与受体的相互作用,从而导致更强的抑制位点磷酸化导致更高的感应ANGPTL4和PDK4表达式。因为PPAR的磷酸化状态γ直接链接到“病态的”刺激如高脂肪饮食、肥胖、炎症在T2DM病人中常见,气的著名活动在这方面除了锅兴奋剂活动可以合作采取行动调整葡萄糖,吸收,和底物利用率在能源生产胰岛素抵抗和肥胖,可能随着时间的推移提高2型糖尿病患者的临床预后。

2。材料和方法

2.1。化学物质

Chiglitazar被发现和合成由Chipscreen生物科学有限公司14]。罗格列酮和吡格列酮是由江苏Depei化学有限公司(金坛,中国)。Roscovitine索坦,U0126、SR1664 VX680买来塞莱克化学品(美国休斯顿,德克萨斯州)。所有化学品都提供纯度合格。

2.2。细胞系

人类preadipocyte-visceral (HPA-v)细胞从ScienCell购买(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)和在preadipocyte培养基培养(PAM, ScienCell)含10%胎牛血清。人类正常肝细胞株L-02购买从中国科学院上海细胞库(中国上海)和培养rpmi - 1640中含10%胎牛血清,50μ50 g / ml链霉素,单位/毫升青霉素在37°C湿润孵化器有限公司为5%₂。

2.3。分子对接模拟(MDS)

发布的PPAR的晶体结构γ绑定到它的配体是下载的蛋白质数据库(PDB代码:2 prg, 2 xkw) (19]。使用UCSF嵌合体生成的图像结构(20.]。使用Molegro MDS进行虚拟码头工人(MVD) [21]。产生的能量最低的构象停靠Chiglitazar对2 prg或2 xkw被选为该模式。罗格列酮和吡格列酮的MDS模式引用发表的来源(18,19]。输出结构数据准备与PyMOL(德拉诺科技有限责任公司)22]。

2.4。基因表达分析实时rt - pcr和免疫印迹

HPA-v细胞培养在6-well板在使用前用适当的媒介。24小时孵化后的测试化合物在不同浓度(0.1%或车辆控制/卷卷二甲亚砜(DMSO)),收集细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(表达载体,生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国)其次是净化使用RNeasy迷你包(Venlo试剂盒,德国、美国)。核糖核酸的浓度是评估使用紫外光谱仪DU520(美国贝克曼库尔特,沥青,CA)。由上标2合成第一链cDNA逆转录酶(英杰公司)根据制造商的指示。执行实时PCR与StepOnePlus™(应用生物系统公司,生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国)使用由于“快速上手”项目高保真PCR试剂盒(罗氏、分子生化药剂,印第安纳波利斯,美国)。引物序列如下:CD36,F: 5′CATCGCTGGGGCTGTCATT 3′, R: 5′GCGTCCTGGGTTACATTTTCC 3′;ANGPTL4,F: 5′GCAGCCATTCCAACCTCAA 3′, R: 5′CAAGAGTCACCGTCTTTCGTG 3′;PDK4,F: 5′ATGTCATTGGCAAGAGGAAGAA 3′, R: 5′ATTACCAGAAGCACCACAACACT 3′;时间(脂肪酶,荷尔蒙),F: 5′CCCTGCTCCTCCGAGACTT 3′, R: 5′GGACTTGCGCCCACTTAACT 3′;β肌动蛋白F: 5′AGTTGCGTTACACCCTTTC 3′, R: 5′TGTCACCTTCACCGTTCC 3′。相对基因表达水平正常化β肌动蛋白。表达的褶皱变化引起的各种治疗方法计算处理样品的相对表达水平除以车辆样本或治疗控制。

HPA-v细胞培养在一夜之间60毫米板然后孵化表示化合物在不同浓度(0.1%或车辆控制(卷/期)DMSO) 48小时。蛋白质提取使用NE-PER核和胞质萃取设备和量化与皮尔斯微BCA蛋白质化验设备根据制造商的指示(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。适当数量的蛋白质被加载并分离钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page),然后转移到聚乙二烯二氟化物膜(Amersham生物科学,通用电气医疗集团生命科学,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)。印迹被封锁在室温下1小时在TBST缓冲区(Tris-buffered saline-Tween 20)以5%的脱脂奶粉,随后孵化与个别主要抗体。主要抗体PPARγ(细胞信号技术(CST)、丹弗斯、马;81 b8),磷的(Ser) CDKs基质(CST;2324年),β加利福尼亚州圣何塞肌动蛋白(圣克鲁斯生物技术;69879)、时间(Abcam,剑桥,英国;ab45422), CD36 (Abcam;ab17044), PDK4 (Abcam;ab71240)和ANGPTL4 (Abcam;ab95194)是根据制造商的推荐使用。三洗TBST缓冲区后,膜被孵化室温1小时与相应的二次抗体根据制造商的建议。乐队与超级ECL +可视化检测试剂(Applygen,中国)和暴露于柯达X-OMAT电影。这部电影是扫描并转换为灰度图与Bio-Print凝胶扫描和辅助软件(Vilber Lourmat,法国)。

2.5。细胞转染对报告基因分析和基因表达分析

细胞转染了如前所述使用相同的构造的荧光素酶报告实验(12,13]。短暂,L-02细胞被播种到96孔板的前一天转染获得融合在转染时50 - 80%。对记者分析,质粒表达hRXR (10 ng), pGFP (10 ng),相关的PPAR同种型(10 ng),和相应的记者质粒(30 ng)使用FuGENE cotransfected 6转染试剂(罗氏)根据制造商的指示。在转染后48小时内,细胞治疗表明化合物在不同浓度(0.1%或车辆控制(卷/期)DMSO) 24小时。荧光素酶活性测定使用荧光素酶从Promega分析工具(WI麦迪逊,美国)。顺序GFP荧光和荧光素酶活性检测使用Fluoroskan提升FL读者(热Labsystems,芬兰赫尔辛基)。记者表示的基因表达荧光素酶活动的规范化与GFP荧光在相同的。记者感应的测试化合物与车辆控制(即。DMSO)。

检测基因表达的变化,L-02细胞被播种到6-well板块和质粒表达hRXR cotransfected PPAR亚型不同。在转染后48小时内,细胞被孵化的测试化合物或车辆控制(0.1%浓度表示(卷/期)DMSO) 24小时。总RNA提取,然后实时rt - pcr进行如上所述。

2.6。免疫沉淀反应(IP)和PPAR的免疫印迹γ

HPA-v细胞培养在一夜之间60毫米板然后孵化表示化合物或DMSO溶液。细胞溶解产物溶解在皮尔斯IP裂解缓冲(热费希尔科学),然后与anti-PPAR孵化γ主要抗体(中科81 b8)在前一夜之间4°C混合蛋白质G-Sepharose珠子(热费希尔科学)2小时。裂解缓冲的珠子被洗了三次,和免疫沉淀反应和溶解在SDS加载缓冲区中恢复过来。等量的免疫沉淀反应之前被加载,通过sds - page分离使用初级PPAR抗体免疫印迹分析γ(CST;81 b8)和含磷的(Ser) CDKs基质(CST;2324)。

2.7。定点诱变

在人类PPAR定点诱变氨基酸的网站γ343年289年2(丝氨酸,谷氨酰胺,酪氨酸473)(23)是由插入完整的人类PPARγ2到pcDNA3.1向量使用QuikChange定点诱变工具包(美国Stratagene拉霍亚,CA)推荐的制造商。以下引物对用于定点诱变:PPARγS289A F: 5′GCTGCCAGTTTCGCGCCGTGGAGGCTGT 3′, R: 5′ACAGCCTCCACGGCGCGAAACTGGCAGC 3′,太极拳(丝氨酸),替换与GCC(丙氨酸);Y473D F: 5′CTCCTGCAGGAGATCGACAAGGACTTGTACTAG 3′, R: 5′CTAGTACAAGTCCTTGTCGATCTCCTGCAGGAG 3′,与广汽TAC(酪氨酸)取代(天冬氨酸);E343A F: 5′GGGTTCTCATATCCGCGGGCCAAGGCTTCA 3′, R: 5′TGAAGCCTTGGCCCGCGGATATGAGAACCC 3′,呕吐(谷氨酸酸)取代了GCG(丙氨酸)。的引物和核酸内切酶位点subcloning如下:NheI F: 5′CTGGCTAGCGTTATGGGTGAAACTCTGG 3′, XhoI R: 5′GGCCTCGAGCTAGTACAAGTCCTTGTA 3′。所有结构都证实了全身的测序。

2.8。染色质免疫沉淀反应(芯片)

染色质免疫沉淀反应(芯片)分析工具包(美国北部/微孔,泰梅库拉,CA)是根据制造商的指示。短暂,孵化与显示治疗后,HPA-v细胞在37°C和1%甲醛固定15分钟,然后用使用xo - 900 d超声波细胞破碎仪(中国南京)。与蛋白质A-agarose珠子,清除杂物后上层清液的整除被作为输入控制。相同的样本体积与anti-PPAR受到免疫沉淀反应γ抗体(CST;81 b8)如上所述。DNA片段随后被恢复使用QIAquick列(试剂盒)。实时PCR进行如上所述使用以下sequence-specific底漆对与目标基因启动子:ANGPTL4,F: 5′TGAGCTCTTCTCCGTTCATCTCGAACCAC 3′, R: 5′GAGTCTAGACATCTCAGAGGCTCTGCCTG 3′;PDK4,F: 5′GGATTTCAACAGCCAGTGCT 3′, R: 5′ATAGTGCTGCCCAGTGTGTG 3′;CD36,F: 5′ATTTGTGGTTGGTTGCCAAG 3′, R: 5′AGGTGATGGGTCTTCACCAG 3′;时间,F: 5′CAAGTGATTGGGATGAAGCA 3′, R: 5′CTAGCCAGCCCAGTCTTCAG 3′;胰岛素,F: 5′CTTCAGCCCAGTTGACCAAT 3′, R: 5′AGGGAGGAGGAAAGCAGAAC 3′。实时聚合酶链反应胰岛素启动子作为消极的控制。相应的输入样本作为内部控制(加载)。实时PCR进行如上所述。启动子结合评估了正常化的Ct (PCR)的阈值周期值样本与anti-PPAR免疫沉淀反应γ抗体的Ct各自的输入控件。

2.9。在体外磷酸化和代数余子式招聘分析

活跃的异质二聚体CDK5 / p25购买从微孔(猫。14号- 516)。重组体人His-PPARγ小黑裙片段表达和纯化如前所述24]。在体外PPAR的磷酸化γ小黑裙(配体结合域)进行50μl反应体积组成的个人测试受体激动剂或车辆控制(DMSO)表示浓度,1μ克His-PPARγ小黑裙,30 - ng活跃CDK5 / p25、和100毫米ATP 1 x激酶缓冲区。30°C的反应是孵化30分钟,然后进行免疫印迹分析或AlphaScreen化验的代数余子式绑定。

代表LXXLL肽图案不同的代数余子式合成根据文献发表。各种肽图案PPAR的绑定γ小黑裙是决定使用AlphaScreen试验(AlphaScreen®组氨酸(镍螯合)检测设备,优秀的,沃尔瑟姆,妈,美国)如前所述[24]。传统的测定进行了大约40 nM His-tagged PPARγ小黑裙和40海里的生物素化的多肽的5μg / ml施主和受主珠子在缓冲区包含50 nM拖把,50 mM氟化钠,50 mM皮套裤,牛血清白蛋白和0.1毫克/毫升、pH值7.4。代数余子式的绑定与磷酸化PPAR化验γ小黑裙,在体外磷酸化是第一次做如上所述传统AlphaScreen过程紧随其后。PPAR的磷酸化状态γ小黑裙的存在是取决于CDK5 / p25、ATP、检测受体激动剂或添加到他们的订单在体外磷酸化反应。例如,“小黑裙+ CDK5−ATP +兴奋剂”代表没有ATP磷酸化反应;“小黑裙+ CDK5 + ATP受体激动剂”表示,所有组件中磷酸化反应。此外,“(小黑裙+ CDK5 + ATP) +兴奋剂”表示在体外磷酸化是受体激动剂之前完成补充道。代表生物素化的肽主题如下:NCOR2核受体辅阻遏物(2):Biotin-GHSFADPASNLGLEDIIRKALMGSF;PGC1a(过氧物酶体proliferator-activated受体γ,共激活剂1α):Biotin-QEAEEPSLLKKLLLAPANTQ;SRC1-2核受体共激活剂(1):Biotin-SPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSP;SRC2-3核受体共激活剂(2):Biotin-SPKKKENALLRYLLDKDDT;SRC3-3核受体共激活剂(3):Biotin-SPKKKENNALLRYLLDRDD;TRAP1b(中介复杂的亚基1,MED1): Biotin-FSKVSQNPILTSLLQITGN。

基线代数余子式招聘感应的褶皱变化表示为相对荧光素酶单位的比值(RLU)值与代数余子式除以ligand-free绑定反应没有肽的存在价值。代数余子式的褶皱变化招聘测试受体激动剂诱导的计算的比率从绑定RLU价值反应与兴奋剂除以车辆控制(DMSO)。

2.10。统计分析

学生的根据需要执行以及确定统计学意义。被定义为不同的比较之间的统计学意义 。

3所示。结果

3.1。微分的感应ANGPTL4和PDK4表达式由Chiglitazar和TZD类化合物

调查过程中Chi和TZD化合物的微分效应基因的表达参与脂质代谢和胰岛素敏感,我们确定了两个基因在多个已知的PPARγ目标(补充图在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/4313561),ANGPTL4和PDK4气引起的,优先。如图1,在人类preadipocyte HPA-v细胞信使rna和蛋白质ANGPTL4和PDK4明显气而引起的活性氧或Pio。与先前的研究一致的(16),的表情CD36和时间,两个成熟的PPARγ目标基因,类似与每个化合物治疗后(图1 (c))。

ANGPTL4和PDK4被PPAR监管δ和其他PPAR在较小程度上的亚型(17,18]。是PPARδ活动从锅受体激动剂气的唯一因素导致观察到的明显高于感应这两个基因吗?L-02,我们对待人类肝细胞细胞系表达内源性PPARs和他们的目标基因,包括ANGPTL4和PDK4治疗细胞气时,Ros, Pio(补充图)。如图2气,而诱导ANGPTL4和PDK4在PPAR显著δ转染细胞,这潘PPAR激动剂调节PPAR基因更重要γ——但不是PPARα转染细胞Ros和Pio相比细胞模型。这些结果表明,ANGPTL4和PDK4表达式是调节不仅对PPAR的回应δ激活被PPAR也γ。然而,这种诱导基因表达后与PPAR激动剂治疗似乎没有相关γtransactivity,因为气PPAR不断产生比较有效γtransactivation相对于Ros在不同的细胞模型系统(16]。与此一致的是,记者化验证明治疗L-02细胞与气,Ros, Pio产生交流₅₀对于PPARγ传递性的 , , μM,分别(平均数±标准差,补充图)。

3.2。不同绑定到PPAR Chiglitazar和TZD类化合物γ和抑制CDK5-Mediated磷酸化

气具有non-TZD结构相对受限制的配置。模拟分子对接的PPAR出版γ晶体结构(19)透露,Ros(图3(一))和Pio(图3(b))和PPAR形成氢键γ通过酪氨酸螺旋12 - 473和他的螺旋5 - 323,这是符合典型的完全激动剂绑定模式25,26]。然而,气(图3(c))没有表现出任何氢键供体或受体接近螺旋12和5;这种化合物最有可能不会形成氢键与这两个站点。相反,气形成氢键的arg ser - 289和- 288 3和glu - 343的螺旋β表。来验证它们之间的不同的绑定模式,我们执行串行基因定点突变称为残留的受体包括酪氨酸- 473 asp (Y473D),阿拉巴马州ser - 289 (S289A),阿拉巴马州和glu - 343 (E343A),分别。出乎意料,Y473D突变显著减少transactivity Chi Ros和Pio的报告基因分析(数据3(d) -3(f)),尽管没有Chi和PPAR之间的氢键γ在这个地区,不同于SR1664,已知部分PPARγ受体激动剂,显示没有与Y473互动(补充图)[11]。其他交互残留物,只有S289A突变变弱气的transactivity与Ros和Pio(数字不同3(d) -3(f))。气似乎可能会像一个完整的受体激动剂与螺旋中的时尚的互动12和5但不同影响受体活动通过configuration-restricted绑定模式与其他地区的特定的残留物。最近的研究表明,PPARγ活动可以通过在S273 CDK5-mediated磷酸化(调制12],glu - 343是毗邻报道磷酸化的口袋里。基于这一独特receptor-ligand绑定模型,我们假设,与服用tzd相比,气可能与PPAR交互γ通过优先抑制受体磷酸化,从而产生一个微分PPAR的模式γ有针对性的基因调控。

为了测试这个假说,preadipocyte HPA-v细胞孵化与配体肿瘤坏死因子的存在与否α的诱导物CDK5-mediated PPARγ磷酸化(12]。细胞提取物PPAR使用抗体免疫沉淀反应γ然后是免疫沉淀反应被免疫印迹可视化使用anti-phospho - (Ser) CDKs基质抗体。同时服用tzd Chi和两个都表现出剂量依赖性抑制TNFα之二的磷酸化PPARγ在HPA-v细胞,气产生更强的抑制作用即使在0.05和0.2μM(图4(一))。为了证实这一结果,我们执行一个在体外人类His-PPAR磷酸化反应和纯化重组γ配体结合域(精神的小黑裙)24异质二聚体CDK5 / p25)和活跃。我们的结果表明,0.2和2μ米气抑制CDK5-mediated PPAR的磷酸化γ服用tzd的小黑裙显著大于两个测试(图4 (b))。这些实验表明,气表现出更强的抑制影响CDK5-mediated PPARγ磷酸化与两个TZD的化合物。

调查的角色CDK5-mediated PPARγ磷酸化调节目标基因表达中,我们检查了PPAR目标基因表达在肿瘤坏死因子α对待HPA-v细胞孵化小组的激酶抑制剂(索坦VEGFRs和pdgfr VX680 AURK a / B / C, U0126 MEK1/2,和roscovitine CDK5)。的表情ANGPTL4和PDK4只有roscovitine治疗引起的,这表明这个事件是CDK5 kinase-dependent。与此同时,经典PPAR的感应γ目标基因,CD36和时间在HPA-v没有改变细胞的治疗上述激酶抑制剂(图5),建议,至少,这两个目标基因的诱导由于PPAR的磷酸化状态不太可能γ。这些结果表明之间的直接联系CDK5-mediated PPARγ磷酸化和ANGPTL4和PDK4表达式。综上所述,这个微分抑制作用的气CDK5-mediated PPARγ磷酸化或许解释了为什么这种化合物诱发ANGPTL4和PDK4服用tzd大于表达。

3.3。Chiglitazar不同影响子PPAR的绑定γ包含复杂的转录和代数余子式招聘CDK5-Mediated磷酸化

PPARs二聚化类维生素a的X受体(RXR)招募代数余子式(例如,辅活化因子或辅阻遏物)在特定的配体结合或诱导蛋白质-蛋白质之间的关系(例如,与chromatin-binding蛋白质),导致形成调节下游靶基因的转录组(27,28]。有研究报道,独一无二的β表PPAR的区域γ小黑裙,S273所在,与RXR交互αDNA结合域(DBD) (29日,30.]。因此,它是高度可能PPAR的磷酸化γS273可能会影响其与RXR互动和随后的启动子绑定。我们芯片进行化验测试启动子PPAR的绑定γ包含复杂的转录诱导气、Ros和Pio的存在和缺乏S273磷酸化。在缺乏肿瘤坏死因子α气,很明显,引起更大的PPAR招聘γ包含复合物的ANGPTL4和PDK4启动子比CD36和时间(图6)。最引人注目的是,肿瘤坏死因子α刺激压抑PPAR的绑定γ包含复合物四个目标基因启动子研究HPA-v细胞受体激动剂治疗,同时气似乎保持更强的PPAR的招聘γ包含复合物的ANGPTL4和PDK4启动子与CD36和时间启动子(图6)。这些结果暗示一般,而不是gene-specific镇压PPAR的启动子绑定γ为了应对肿瘤坏死因子α通过S273磷酸化和可能ERK信号(31日]。

接下来,我们进行一个使用纯化重组PPAR AlphaScreen化验γ小黑裙是否特定的代数余子式招聘受到S273磷酸化在目标基因调控。我们的数据显示,第一次在体外PPAR的磷酸化γ由CDK5抑制代数余子式招聘(图7)。在六个代数余子式检查,招聘共激活剂的PGC1a和辅阻遏物NCOR2,这显示重大基线绑定活动的小黑裙配体独立的绑定(补充图),没有显著受到PPAR的磷酸化状态的影响γ在S273。然而,招聘的其他辅活化因子,即SRC1, SRC2, SRC3,和TRAP1b (MED1),被CDK5-mediated显著抑制受体磷酸化。抑制部分和不同恢复在添加三个配体,与他们的抑制效力一致在体外磷酸化在S273(图4 (b))。NCOR2担任主要辅阻遏物招募HDAC(组蛋白脱乙酰酶)组成一个复杂和PPAR进一步抑制转录活动γ。值得注意的是,有更多chi-bound PPARγ小黑裙分离从NCOR2比这两个复杂TZDs-bound PPARγ小黑裙;这个微分不能报告基因实验中观察到的现象。

4所示。讨论

尽管TZD-like Ros和Pio承诺等药物疗法治疗2型糖尿病患者(1,2),潜在的安全风险与心血管疾病和其他不受欢迎的影响极大地限制他们的应用程序(32,33]。新一代的PPAR配体为subtype-selective PPAR调制器,transcriptional-inactive PPARγ合成配体,或锅受体激动剂目前正在临床前或临床研究9,15,34- - - - - -38]。PPAR不同亚型具有重叠,有时敌对glucose-lipid代谢的影响不同的方面,炎症调节,和其他生物学途径。当前知识的局限性有关每个亚型和部分的确切机制无法进一步区分彼此通常停止发展进步39]。最近的研究表明,特定的磷酸化S273 PPARγCDK5 obesity-linked或high-fat-diet-induced激活,导致胰岛素抵抗在动物和人类,可以通过服用tzd治疗或改善没有transactivation PPAR的配体γ通过抑制CDK5-mediated S273磷酸化(11,14]。考虑到由CDK5 S273磷酸化PPAR所特有的γ,命令绑定这个事件是重要的潜在目标基因的启动子与葡萄糖和脂质监管,因为PPARγ二聚化RXR DBD地区α通过β表域S273所在。因此,有必要了解这个磷酸化功能区分PPAR的影响γ从其他亚型和随后的角色configuration-restricted non-TZD配体生成一个更平衡的或有益的效果在调制的葡萄糖/脂质/能量代谢。

气适度但显著激活所有三个PPAR亚型和交流₅₀价值观是临床可行的浓度。从我们的对接研究结果与PPAR的晶体结构γ表明气不形成一个典型的绑定模型的TZD-type PPARγ完整的受体激动剂(例如,Ros)(图3)。相反,气与参数之间形成氢键的螺旋H3和glu - 343 - 288β表毗邻CDK5磷酸化的口袋里。这个绑定模型非常类似于MRL-24,部分PPAR激动剂γ(26]。不同的受体激动剂受体结合可以产生独特的构象变化,在最近的一项研究显示利用核磁共振,/氢氘交换,和对接40- - - - - -42]。Ros稳定AF2域和已被证明β表在绑定的受体,而MRL-24主要是稳定的β表。尽管气cocrystal数据的缺乏,我们对接研究和报告基因激活结果与串行基因定点突变与发表文献显示稳定的保持一致β表在磷酸化的抑制是很重要的。正如所料,气表现出更强的抑制CDK5-mediated PPAR的磷酸化γ在HPA-v S273细胞(图4(一)),在体外磷酸化化验(图4 (b)服用tzd)比另两个测试。

S273磷酸化的增加与肥胖和2型糖尿病患者的胰岛素抵抗,可能由于葡萄糖,相关基因的表达改变脂质和能量体内平衡(11,12]。在这里,我们表明,S273磷酸化是直接关系到两个resistance-related胰岛素基因的转录调控,ANGPTL4和PDK4。在人类preadipocyte HPA-v细胞系,气不同监管一组不同的目标基因与Ros和Pio相比。其中,表达式的ANGPTL4和PDK4显著高于气治疗后(图1)。这种感应是肿瘤坏死因子相关α刺激和CDK5-mediated S273 PPAR的磷酸化γ,因为CDK5激酶抑制剂roscovitine模仿Chi(图的影响5)。最引人注目的是,的表达ANGPTL4和PDK4在基因和蛋白水平似乎气引起的优先。然而,其他胰岛素sensitization-related基因等CD36和时间,这显然是不受肿瘤坏死因子α或CDK5-mediated S273 PPAR磷酸化γ(图5),这三种受体激动剂(数据显示类似的表达式1和2)。这些结果说明明确区分TZD和non-TZD类型化合物如气调节胰岛素抵抗,符合其他报告证明CDK5-mediated S273 PPAR磷酸化γ独立管理一组特定的insulin-sensitizing相关基因(11,12]。

我们的芯片和AlphaScreen化验表明TNFα刺激和CDK5-mediated磷酸化确实抑制启动子PPAR的绑定γ含有目标基因转录复合物,以及代数余子式招聘。气可以部分恢复一些代数余子式(即的招聘活动。,SRC2 SRC1 SRC3和TRAP1b)而不是其他人(例如,NCOR2 PGC1α)抑制CDK5-mediated S273磷酸化(图7)。这些数据是由前一个结构研究表明SRC3 PPAR交互γ地区远离螺旋12附近β表包含CDK5结合位点(11]。尽管先前的研究表明,PPARγ/ B-domain (n端ligand-independent激活函数1,AF-1)具体参与的招聘或稳定营地反应元件结合蛋白和p300-containing辅因子复合物目标基因的一个子集(43),我们了解一个特定的目标基因是由个体代数余子式被PPAR依然贫穷。我们没有发现在招聘中六辅因子的差异测试,这可能导致增加ANGPTL4和PDK4表达式由气而服用tzd另外两个。相比之下,我们发现气更重要的水解辅阻遏物从PPAR NCOR2γ小黑裙比Ros AlphaScreen试验;淘汰赛NCOR在脂肪细胞是压制PPAR最近报道γS273磷酸化和增加胰岛素敏感性在小鼠模型13];离解的PPAR NCOR2更多的力量γ通过气部分有助于其磷酸化的抑制。相比之下,另一份报告表明,短链FA丁酸可以诱发一系列独特的PPAR目标基因,包括ANGPTL4代数余子式招聘,尽管没有明显的活动(除了诱导绑定两个辅阻遏物NCOR1和NCOR2绑定)观察了PamChip®数组(44]。丁酸盐是一种HDAC抑制剂,它可能被NCOR2 PPARγ转录组;可以诱导ANGPTL4表达式通过干涉HDAC和NCOR2之间的交互。考虑PPAR的病理生理和治疗的相关性γS273磷酸化在2型糖尿病及其相关并发症,这种生物过程的影响在特定目标基因调控和代数余子式招聘值得进一步调查。

胰岛素抵抗、2型糖尿病、心血管并发症反映一个非常复杂的结果由于障碍的相互补充葡萄糖之间的交互,脂质和能源利用相关的组织。后果之一,即在脂肪组织脂质过多,肝脏,肌肉,和心脏组织由于T2D后经常出现代谢综合征患者,是一个关键因素,导致体重增加,心脏衰竭,和其他心血管疾病。因此,治疗恢复血糖、脂质和能量稳态可能提供最大的临床效果。在三个亚型,PPARα和PPARδ可以提供额外的影响脂质代谢PPARγ。事实上,Pio带来心血管病人最有可能由于较弱的PPAR福利γ和PPARα激活与Ros (45,46]。如此复杂的作用机制供PPAR胰岛素敏感γ和其他PPAR亚型不仅可以解释临床结果的巨大差异,如心血管事件,造成相同的化学服用tzd类(例如,Pio与Ros)还可能使开发configuration-restricted non-TZD分子与PPAR相关副作用较少γ激活。

超出其温和的锅兴奋剂活动,气极大地诱发两个靶基因,ANGPTL4和PDK4,参与通过抑制PPAR葡萄糖和脂质代谢γ磷酸化。饮食饱和脂肪酸(美国)可以在循环的形式呈现给细胞游离脂肪酸(远期运费协议)或FAs脂蛋白脂肪酶水解的乳糜微粒(低密度脂蛋白)或VLDL淋巴结和血液。美国是强大的促炎的营养物质可以触发胞内炎症通路的激活先天免疫细胞如巨噬细胞、以及主要胰岛素靶细胞,脂肪细胞,细胞,肝细胞,导致胰岛素抵抗、肥胖和心血管疾病(47,48]。ANGPTL4是低密度脂蛋白的内源性抑制剂活性和防止fat-induced炎症中扮演着关键角色由美国引起食源性肥胖,并通过保护心肌梗死血管完整性(49- - - - - -51]。ANGPTL4减少循环远期运费协议源自甘油三酯(TG)丰富的靶器官脂蛋白提高胰岛素敏感性。积极的关系ANGPTL4活动增加等离子体水平TG-rich VLDL脂蛋白在人类与less-of-function方差ANGPTL4E40K以及ANGPTL4不足或肝脏特异性超表达转基因小鼠52- - - - - -54];然而,转基因的过度ANGPTL4抑制泡沫细胞形成减少动脉粥样硬化发展atherosclerosis-prone E3L老鼠(55]。类似于lipotoxic心肌病引起的心脏LPL的过度表达,心脏功能也在转基因小鼠受损心脏过度ANGPTL4(56),强调平衡的重要性FFA对正常心脏功能和可用性的需求。因此,ANGPTL4可能导致脂质积累(即增加。,脂质过载)在肝脏、肌肉和心脏(57),这是一个“副作用”,可以通过增加被克服β在这些组织通过氧化PPAR的额外的激活α和PPARδ活动(58]。的确,等离子体TG水平增加了活性氧,但降低了Pio在临床应用。它可能是部分由于较强的感应ANGPTL4Ros和PPAR疲软αtransactivity Pio的44,59]。在临床前研究中各种动物模型、气表现出不同的基因表达谱,包括优惠诱导UCP-1脂肪和骨骼组织(15]。此外,没有身体体重leptin-positive KKAy leptin-negative老鼠和更少的脂肪垫重量增加db / db老鼠被气[指出治疗后16]。更少影响心脏重量增加的长期毒性大鼠学习和不增加心脏重量在狗气治疗也观察到(16]。

增加胰岛素敏感性增强FA reesterification后发生在脂肪组织,减少了FA流出,和有限的异位脂肪沉积。PDK4复杂使丙酮酸脱氢酶失去活性,从而导致依赖β氧化FFA作为主要能源,而不是葡萄糖。的glycerol-3-phosphate催化葡萄糖因此用来固定循环FFA在脂肪组织,进一步提高胰岛素敏感性其他glucose-utilizing器官。PDK4在骨骼肌在胰岛素抵抗状态调节,提出参与胰岛素抵抗的病因60]。然而,系统性PDK4基因敲除小鼠没有明显的表型变化,不影响血糖水平和胰岛素敏感性在美联储状态,只会导致低血糖后长时间饥饿(61年],它的基本作用是一致的PDK4对葡萄糖体内平衡。虽然心脏过度的PDK4加剧了肥厚性心肌病引起的钙调磷酸酶压力激发了途径PDK4 /中央社双转基因小鼠(62年),它产生一个对心脏缺血再灌注损伤保护作用通过慢性代谢适应类似的心脏PDK4转基因小鼠(63年]。Myocardiocytes T2DM病人施加少衬底的灵活性对能源生产和显性糖尿病心肌病或后期没有其他macrovascular心脏衰竭的并发症。除了PDK4,不同的代谢PPAR调制的状况δ从另外两个PPAR亚型,在缺血/再灌注心脏保护老鼠之前报道(64年]可能赋予潘PPAR激动剂如气对预防糖尿病心脏功能障碍。

5。结论

总之,我们表明,监管的表达ANGPTL4和PDK4重要的监管机构的葡萄糖和脂质代谢和胰岛素抵抗,直接与S273 PPAR的磷酸化γ针对常见的2型糖尿病高脂饮食等因素,肥胖,和炎症。气优先诱导ANGPTL4和PDK4表达式通过抑制这些瀑布最有可能通过其独特的configuration-restricted受体结合,影响代数余子式招聘和启动子PPAR的绑定γ包含转录复杂。进一步的研究需要阐明的详细机制gene-specific磷酸化调节的受体。然而,气的影响胰岛素的规定被PPAR resistance-related基因表达γ,连同其PPAR温和的活动α和δ,可以平衡葡萄糖和足总吸收和底物利用率在脂肪组织,肌肉,肝脏,和心脏在胰岛素抵抗和肥胖,可以提供全面的临床好处T2DM病人在未来。

的利益冲突

所有作者没有利益冲突声明。

作者的贡献

De-Si锅和魏王同样这项工作。

确认

作者感谢李勇博士和金依萌利华国际生命科学学院,厦门大学,因为在AlphaScreen试验提供技术援助。这项研究是由中国支持的国家“863”项目(没有。2002 aa2z3146),国家“新药倡议”(2008 zx09101 - 002),中国国家自然科学基金委(81641051),从广东省生物技术领域的重大项目(没有。2002年a1090214)和深圳市(2003 - l1 - 013号、ZDSYS20140509172959975 JCYJ20140418112611757,和GJHZ20140416153844269)。

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