文摘
过氧物酶体扩散者激活受体γ(PPARγ)密切参与心血管疾病的过程。本研究旨在调查是否吡格列酮(PIO), PPARγ受体激动剂,能防止压力overload-induced心脏肥大。小鼠口服给予PIO(2.5毫克/公斤)从1星期后主动脉条带和持续7周。形态学检查和生化分析被用来评估PIO的影响。新生大鼠心室心肌细胞也被用于验证保护PIO肥大体外。在我们的研究结果表明,PIO显著抑制肥厚性反应引起的主动脉瓣联合体内。此外,PIO也抑制心脏纤维化体内。PIO治疗也抑制活化的蛋白激酶B(一种蛋白激酶)/糖原合成酶激酶3β(GSK3β)和增殖蛋白激酶(MAPK)的心。此外,PIO减轻体外血管紧张素II-induced肥厚性反应。总之,PIO可以通过衰减GSK3 AKT /抑制心脏肥大β和MAPK通路。
1。介绍
心脏肥大的特点是膨胀的心脏,心脏细胞增大,胶原蛋白的积累。心脏肥大可能导致心室性心律失常、心力衰竭、心脏性猝死(1,2]。虽然心脏肥大的原因和影响都进行了广泛的调查,心脏肥大的潜在的分子机制仍不清楚。众多研究已经涉及,激活蛋白激酶B(一种蛋白激酶)/糖原合成酶激酶3β(GSK3β)和增殖蛋白激酶(MAPK)是密切参与心脏肥大的过程(3]。因此,发现新的药物可以抑制这些信号通路的重视治疗心脏肥大。
过氧物酶体扩散者激活受体(PPARs),以诱导肝过氧化氢扩散的能力以应对异型生物质的刺激,是核受体超家族的成员(4]。有三种同形像PPARs: PPAR -αPPAR -β和PPAR -γ(5]。PPARγ主要在脂肪组织表达。PPARγ发现调节脂肪形成和胰岛素敏感性6,7]。后来的研究显示PPARγ也表达了在老鼠心脏细胞(8),并密切参与心脏肥大的过程。Cardiomyocyte-specific PPARγ基因敲除小鼠可能诱发心脏肥大9PPAR)和激活γ由特定的受体激动剂罗格列酮,可以抑制心脏肥大体内和体外10]。吡格列酮(PIO),另一个PPARγ受体激动剂,也显示在心血管疾病的保护作用。吡格列酮可以抑制动脉粥样硬化(11)和改善左心室重构在老鼠postmyocardial梗塞[12]。然而,在心脏肥大PIO的作用尚不清楚。先前的研究表明,PPARγ受体激动剂抑制GSK3β在结肠癌细胞(13]。PPAR的激活γ可能导致的抑制细胞外signal-regulated激酶(ERK) [14]。因此,PIO是否敌对行动在这些信号通路也仍然需要调查。
在这项研究中,我们使用了一个动物模型的压力超负荷引起的心肌肥大是否PIO可以防止心脏肥大,我们还发现保护作用的分子机制。
2。材料和方法
显示所有动物实验进行实验动物保健和使用指南发布的美国国立卫生研究院(NIH出版,2011年修订)和动物保健和使用委员会批准武汉大学人民医院,中国。
2.1。试剂
从Sigma-Aldrich PIO购买(由高效液相色谱CDS021593,纯度> 98%)。血管紧张素ⅱ(Ang II, A9525)也从Sigma-Aldrich购买。Anti-PPARγ(sc - 7196)购买从圣克鲁斯生物技术。第一抗体后从细胞信号技术购买:anti-AKT (# 4691), anti-phospho-AKT (# 4060), anti-GSK3β(# 9315),anti-phospho-GSK3β(# 9323 p), anti-ERK (# 4695), anti-phospho-ERK (# 4370 p), anti-P38 (# 9212 p)和anti-phospho-P38 (# 4511 p)。从ABCAM Anti-GAPDH (# ab8245)获得。反α肌动蛋白是微孔。二次抗体来源于LI-COR生物科学。所有其他化学试剂均为分析纯。
2.2。动物和治疗
所有60雄性C57BL / 6小鼠(8-10-week-old;男性体重:23.5 - -27.5 g)购买实验动物研究所的科学,凸轮&曾经(中国,北京),和有温度和湿度控制。所有的老鼠被允许免费获取食物和水在12 h光暗周期在武汉大学心血管研究所(武汉)。动物被随机分为虚假手术或AB集团是口服治疗或没有PIO(2.5毫克/公斤体重/天)7周,并开始1周后主动脉条带。如前所述执行AB (15,16]。PIO的剂量选择的根据我们的初步实验(参见图S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/9174190)。PIO在生理盐水溶解体内实验。术后8周,动物和1.5%异氟烷麻醉,进行超声心动图测量,随后与过度的戊巴比妥钠小鼠安乐死(200毫克/公斤)。心被解剖,重计算心脏重量/体重(HW / BW)和心脏重量/胫骨长度(HW / TL)比率PIO-treated和vehicle-treated老鼠。收集左心室心脏组织在液氮snap-frozen并存储在- 80°C,直到进一步的实验。
2.3。超声心动图分析
超声心动图进行安乐死老鼠通过Mylab 30简历(Esaote S.P.A.,Genoa, Italy) equipped with a 10 MHz linear array ultrasound transducer, as previously described [17]。胸骨旁的烈度衰减视图,极震区视图和2 d引导M-mode图像乳头肌短轴的水平都被记录下来。左心室收缩末期直径不全(LVSD)和舒张末期直径(LVDD)测量跟踪扫描速度的50 mm / s。
2.4。组织学分析
移除心脏组织被捕氯化钾10%和10%福尔马林固定。然后我们嵌入式分段石蜡和横向的心。补液后,部分(4 - 5μ米)的核心是获得并安装到幻灯片和沾haematoxylin-eosin(他)或picrosirius红(PSR)。染色后,细胞的横截面区域和平均体积胶原蛋白定量测定数字分析系统(Image-Pro + 6.0版本;美国媒体控制论,马里兰州贝塞斯达)。的部分进行盲目的。
2.5。免疫印迹分析
冰封的心组织被里帕缓冲细胞溶解,也就是720μL•瑞帕,100μL的鸡尾酒,100年μL Phos-stop, 50μL的氟化钠,20μL PMSF和10μL (Na3签证官4复合在每毫升的裂解缓冲。蛋白质浓度随后用BCA蛋白质分析工具包(猫。23227号;美国马热费希尔科学、沃尔瑟姆)。蛋白质是解决10% SDS PAGE和转移到PVDF膜(猫。IPFL00010数量;美国马EMD微孔,Billerica)。之后,膜被封锁和孵化初级和二级抗体的抗体。最后,这些墨迹观察和分析使用奥德赛红外成像系统(美国东北LI-COR生物科学,林肯)。
2.6。实时聚合酶链反应分析
从冻左心室组织总RNA或细胞溶解产物使用试剂盒(猫。号码15596026;英杰公司生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国)。1μg RNA的每个样本被用来reverse-transcribe cDNA使用PrimeScript RT试剂盒(猫。RR047Q数量;豆类生物科技(大连)有限公司)。PCR进行使用LightCycler 480 SYBR绿色主混合(猫。号码04896866001;罗氏诊断GmbH)。所有底漆表提供细节1。GAPDH mRNA水平正常化。
2.7。细胞培养
初级新生儿的隔离大鼠心室心肌细胞(NRVCMs)根据先前的研究进行18]。溴脱氧尿苷(0.1毫米)被用来抑制心脏成纤维细胞的生长。孤立的小学新生大鼠心室心肌细胞生长在杜尔贝科的修改鹰中/营养混合物F-12火腿(DMEM / F12) 1: 1的混合物(GIBCO C11995)。NRVCMs提供10%胎牛血清的边后卫(GIBCO, 10099),链霉素(100毫克/毫升;GIBCO, 15140)和青霉素(100 U /毫升)。那么细胞培养的氛围中5%的股份有限公司2湿润孵化器(三洋18米)37°C。细胞被播种到six-well文化板块或24-well板24 h DMEM和10%的边后卫,后用0.5% DMEM培养12 h。之后,Angⅱ(1μ摩尔)添加到介质的存在与否PIO (20μmol / L)。新生大鼠心室心肌细胞的生存能力是由CCK-8 5个独立的实验。
2.8。免疫荧光染色
NRVCMs培养上封面都使用或没有PIO (20μ1 mol / L)和刺激μ摩尔和二24 h。染色的细胞,NRVCMs固定用4%甲醛和permeabilized Triton x - 100年的0.1%。随后,反的细胞被染色α肌动蛋白(1:100稀释)并使用Alexa萤石孵化568 -山羊anti-mouse(表达载体,A11017)。截面法测量使用Image-Pro + 6.0。每组超过100细胞中概述。
2.9。统计分析
数据是平均数±标准差。比较了由单向方差分析之后还有一个事后图基的测试。的值被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。PIO抑制心脏肥大Overload-Induced体内的压力
sham-operated组相比,老鼠,老鼠接受主动脉瓣联合开发LVDD显著增加和减少心脏功能(图1(一))。AB老鼠显示肥厚性反应以HW / BW的比率来衡量,HW / TL,总值心脏大小和横向区域(数据1 (b)和1 (c))。相反,与老鼠受到AB相比,肥厚性反应压力超负荷引起的减毒老鼠PIO治疗。此外,心脏肥大的标记,包括心房利钠肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)β肌球蛋白重链(βmhc),也检查(图1 (d))。我们的数据证明了肥厚性标记在AB减毒老鼠PIO处理。并无显著差异,而在有或没有PIO sham-operated老鼠。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。PIO的心脏纤维化引起的主动脉带体内
纤维化,是心脏肥大的主要特性之一,特点是不成比例的积累的胶原蛋白和血管周的纤维化(19,20.]。因此,核心部分是沾染了PSR和分析定量评估肝纤维化的程度。如图2(一个)、间质和血管周的纤维化和增加胶原蛋白体积与AB手术,观察小鼠和PIO治疗可以减弱纤维化反应。信使rna表达水平的胶原蛋白,胶原蛋白三世,结缔组织生长因子(CTGF)和纤连蛋白增加在AB集团(图2 (b))。虽然PIO不能影响纤维化基因在基线,PIO治疗减少纤维化标志物水平的增加引起的过载压力。
(一)
(b)
3.3。PIO防止心脏肥大通过抑制MAPK和AKT / GSK3β通路
我们的数据表明,PPAR的水平γ后被减少长期过载压力。PIO, PPARγ受体激动剂,显然是调节PPAR的表达水平γ在老鼠身上PIO有或没有主动脉带(图3)。GSK3 MAPK和AKT /β信号通路也检查在我们的研究中。正如图所示3PIO治疗仅抑制磷酸化AKT GSK3β在小鼠没有手术。此外,PIO GSK3也可以减少一种蛋白激酶磷酸化的增加和β由于AB。蛋白质水平的磷酸化ERK和P38还增加主动脉条带的8周后手术,和治疗PIO可以减少这些途径。然而,没有明显的变化P-ERK和P-P38虚假的和虚假的+ PIO组。
3.4。PIO缓解心脏肥大细胞在体外
考虑到PIO的心血管保护作用,新生大鼠心室心肌细胞被用来进一步检查PIO的保护对肥大细胞在体外。Angⅱ用于诱导肥大的肥大引起的主动脉带部分是由Angⅱ介导的(21]。一种蛋白激酶/ GSK3β和MAPK信号也可以引起Angⅱ(22- - - - - -24]。和治疗PIO不能培养细胞(图中造成严重的细胞毒性4(一))。正如所料,Angⅱ诱导肥大细胞,ANP的增加(图的特征4 (b)(图)和横截面增大区域4 (c))。PIO治疗剂量依赖性衰减肥厚性反应,而无显著差异在基线。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
我们的研究表明,PIO防止心脏肥大引起的主动脉条带和抑制肥大细胞刺激和II。此外,观察到PIO减毒P-AKT的增加,P-GSK3β、P-ERK P-P38,由AB。此外,PIO可以减弱长期压力过载造成的纤维化。这些发现表明,PIO心脏肥大的保护中发挥了突出的作用通过抑制一种蛋白激酶/ GSK3β和MAPK信号通路。
许多发表的研究涉及广泛的细胞内信号通路参与了肥厚性反应。一种蛋白激酶是心脏肥大的重要调节器25]。激活一种蛋白激酶磷酸化GSK3下游,使其失去活性β信号,进一步促进病理心脏肥大的发展(26]。之前的研究表明,长期AKT激活可能会加速心脏衰竭的过程(27]。心脏过度的本构AKT激活肥大的突变可能导致呼吸困难;相反,AKT1基因敲除小鼠抗心肌肥大(28]。数据从我们以前的研究表明,抑制一种蛋白激酶/ GSK3β缓解AB-induced心脏肥大(29日,30.]。与这些结果一致,我们还发现GSK3减少一种蛋白激酶的激活/ PIO治疗β途径,伴随着PPAR的增加γ。引起的一种蛋白激酶信号差别的潜在机制对这些基因与PPAR PIO可能相关γ-ligand-mediated upregulation PTEN。和PTEN可能抑制一种蛋白激酶的活化脱去磷酸肌醇磷脂中间体的PI3K通路31日]。此外,PPARγ减毒AKT PPAR -γ独立的方式(32]。未来研究使用特定的PPAR抑制剂γ会感兴趣的。
ERK和P38 MAPK信号通路的成员,参与基因表达与心脏肥大有关。先前的研究表明,心肌细胞动作电位可以激活ERK在肥厚性刺激,和心脏的封锁或删除ERK加重心脏肥大的发展(33]。P38还激活期间overload-induced-hypertrophy体内的压力。和超表达P38培养心肌细胞的重组腺病毒引起肥厚性反应特点(34]。霁等人发现吡格列酮可以抑制小胶质细胞炎症通过阻断p38信号通路(35]。月球等人证明alpha-eleostearic酸,PPAR激动剂γ,可以通过激活PPAR发挥抗癌作用γ和表达下调ERK的磷酸化36]。李等人证实吡格列酮减毒ERK的磷酸化通过刺激脂联素水平(37]。符合这些发现,我们的研究还发现,PIO ERK的磷酸化水平降低和P38小鼠主动脉条带。与我们的数据不一致,先前的研究表明,PIO可以通过upregulation ERK(防止缺血再灌注损伤38]。因此,大量的工作需要的精确澄清PIO的心血管保护。
不符合我们的研究中,PPAR激动剂γ诱导心脏肥大的野生型小鼠和cardiomyocyte-specific PPARγ基因敲除小鼠,这意味着体内受体激动剂对心脏的影响是由non-PPAR效应(9]。事实上,这种prohypertrophic效应并不发生在人类有限的剂量(39,40]。针对高水平的PPARγ在增加脂肪酸和葡萄糖的吸收(41),一个相对较小的剂量的PIO使用在我们的研究中,这可以解释不一致的结果。
纤维化是一种病理生理的心脏肥大的过程,特点是胶原蛋白的积累和增加细胞外基质(42]。老太太等人发现心脏肥大是伴随着增加CTGF的水平(43]。莫莱斯等人表示,纤连蛋白导致适应不良的心脏肥大(44]。据报道,罗格列酮可以抑制Ang II-induced CTGF表达血管平滑肌细胞。在这项研究中,我们还注意到,增加胶原蛋白体积和分子标记,包括胶原蛋白,胶原蛋白三世,CTGF,纤连蛋白,在PIO治疗后缓解。先前的研究表明,心肌间质纤维化引起的压力过载可能通过MAPK和GSK3 / AKT介导的β通路(28,29日]。一种蛋白激酶/ GSK3的抑制β和MAPK通路PIO可能造成的潜在机制介导antifibrotic效果。
总之,本研究的结果表明,PIO防止心脏肥大体内和体外抑制肌细胞肥大。和心血管效应介导的抑制MAPK和AKT / GSK3β通路。我们的研究提供了理论依据与PIO在临床应用治疗心脏肥大。
信息披露
Wen-Ying魏和马Zhen-Guo co-first作者。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Wen-Ying魏和马Zhen-Guo同样这项工作。
确认
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81270303,81270303,81470402),中央大学的基础研究基金(没有。2014302020202),湖北省优秀医学学术领袖计划。
补充材料
PIO对心脏肥大的影响。老鼠受到AB是PIO(1毫克/公斤,2.5毫克/公斤或5毫克/公斤)治疗3周。统计结果的心脏重量(HW) /体重(BW)表示组(n = 5)。