文摘

营养过载和遗传因素导致了世界范围内流行的肥胖的根本原因是糖尿病,动脉粥样硬化和心血管疾病。在这项研究中,我们使用大环内酯物吸收FK506等药物雷帕霉素,和大环内酯物派生,timcodar (vx - 853),以确定其对脂质积累在脂肪生成的影响。雷帕霉素和吸收FK506绑定到FK506-binding蛋白质(FKBPs),如FKBP12,导致免疫系统的抑制,抑制mTOR。雷帕霉素之前已经报道过了抑制脂肪形成的过程和脂质积累。然而,雷帕霉素治疗在啮齿动物中引起的免疫抑制和葡萄糖阻力,尽管老鼠体重。在这里,我们表明,timcodar (1μ米),non-FKBP12-binding药物,显著()抑制脂质积累在脂肪生成。比较相同的浓度timcodar (1μ和雷帕霉素(1米)μ米)显示,两者都是抑制剂的脂质积累在脂肪生成。重要的是,timcodar强有力地()抑制脂肪形成的转录监管机构,PPARγ和C / EBPα,导致基因的抑制脂质积累。这些研究为timcodar可能成为典型药物疗法,迅速成为流行。

1。介绍

脂肪形成的过程的药物,抑制剂的兴趣是由于他们在肥胖病人减少脂质积累的能力。由于遗传因素和高脂肪饮食,肥胖是呈上升趋势,并迅速成为一种流行病。肥胖相关的超额总成本估计为2540亿美元/年到2030年在美国医疗费用。我们最近发现,tetratricopeptide重复(TPR)蛋白质,如蛋白质磷酸酶5 (PP5) [1)和吸收FK506结合蛋白(FKBPs) 512,3和524](FKBPs的分子量范围从12到135 kDa [5]),脂质代谢有重要的调控作用。大环内酯物类似物,吸收FK506和雷帕霉素(图1),是目标FKBP蛋白质的免疫抑制药物。他们已经被证明是有效地抑制免疫系统的抑制小分子量FKBP FKBP12 [6]。这些药物期间已被用于抑制免疫系统的移植器官接受援助。然而,潜在的角色在肥胖的治疗现在才变得广为人知。在过去的十年中,轻度炎症已经观察到的可能原因肥胖和2型糖尿病胰岛素抵抗增强[7]。因此,药物目标FKBPs可以作为潜在的治疗方法,改善脂质积累过剩和慢性炎症。

与小FKBPs FKBP51 FKBP52包含三个TPR域内结构,它允许绑定到女伴热休克蛋白90(一半)和核受体复合物[8,9]。我们已经表明,减少FKBP52表达式与高脂饮食导致老鼠挑战加剧了食源性脂质积累在肝脏(肝脂肪变性)以及胰岛素和葡萄糖耐受不良4]。FKBP51,另一方面,有一个逆函数和损失导致减少脂质积累在脂肪生成的细胞模型2,3]。利用3 t3-l1小鼠脂肪细胞模型,叶等人表明,雷帕霉素,而不是吸收FK506,是一种脂肪形成的有效抑制剂(10]。这些大环内酯类使用减少脂质积累的机制仍然未知。吸收FK506绑定FKBP12抑制磷酸酶,而rapamycin-FKBP12互动没有影响(11- - - - - -13]。钙调磷酸酶作为calcium-dependent消极分子开关,调节脂肪细胞分化[14]。通过FKBP12,后来的研究显示,雷帕霉素可以抑制哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR),导致蛋白质合成和生长的抑制15,16]。由于这些原因,雷帕霉素和吸收FK506主要考虑FKBP12配体。雷帕霉素引起抑制adipocytic转录因子,过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγ)和CCAAT / enhancer-binding蛋白质α(C / EBPα)[17),调节脂肪酸吸收和新创脂质合成(18]。

我们已经表明,TPR蛋白,FKBP51 PP5,可以绑定PPAR特别γheteromeric复杂和积极调节受体的活动(1- - - - - -3]。在配体PPAR的绑定γ,PP5进入核受体复杂的PPAR脱去磷酸丝氨酸112γ,这是PPAR的氨基酸γ显示控制脂肪形成的途径(1,19]。PPAR FKBP51绑定γ复杂,但这只是调查ligand-free状态(2]。有趣的是,戴维斯等人证明了糖皮质激素受体(GR)本机FKBP51国家更高的亲和力,并换取FKBP52发生与糖皮质激素发生时(20.]。后来的研究显示,FKBP52是一个积极监管机构GR基因调节和必要的活动(9]。FKBP52在PPAR的效果γ活动仍然未知。然而,吸收FK506和雷帕霉素可以加强dexamethasone-induced GR响应,表明他们的目标不仅FKBP12还大FKBPs [21]。雷帕霉素可以绑定到大FKBP FKBP51;和抑制mTOR的相对表达是由FKBPs [22]。吸收FK506已经证明绑定FKBP51和FKBP52 [23,24]。

immunophilin的大环内酯物吸收FK506发挥其强有力的免疫抑制效应主要是通过瞄准FKBP12 [6]。吸收FK506的发现也有神经营养活性(25),需要non-FKBP12配体已经开发出类似物。通过布鲁斯金和其他的工作,一些吸收FK506类似物缺乏FKBP12绑定能力已确定,可以从根本上提高神经突伸长和促进神经再生26]。已经利用这些属性表明non-FKBP12-binding类似物可以预防神经系统疾病,如自身免疫性脑脊髓炎(27]。尽管non-FKBP12-binding化合物的神经保护作用机制尚不清楚,这些影响归因于FKBP52,不是FKBP12,导致中断FKBP52-containing核受体复合物和激活的细胞外signal-regulated激酶(ERK)途径28,29日]。这方面的工作特别感兴趣的是复合timcodar (vx - 853),一个nonimmunosuppressant吸收FK506导数由顶点不能绑定FKBP12但这是传说中的促进神经突产物(30.在老鼠模型)和改善神经功能药物引起糖尿病神经病变的31日]。最近的一个小,临床试验显示,病人没有timcodar对神经再生的影响受到标准化神经损伤(32]。然而,只有健康的病人被用在这个实验中,留下的可能性timcodar和相关药物在糖尿病条件下可能确实是有利的。因为timcodar结构相似的吸收FK506衍生品FKBP52绑定,我们测试的能力目标FKBP52 FKBP51和影响那些陪伴在糖皮质激素受体的行为活动。通过使用FKBP51 FKBP52敲除老鼠细胞系,我们表明,timcodar救了GR减少活动通常在FKBP52淘汰赛细胞,但只有当FKBP51在场,这表明FKBP51可能timcodar行动的直接目标(33]。然而,直接生化检测,使用纯化的碎片人类FKBP51 FKBP52未能证明timcodar绑定,要么FKBP [34]。应该注意的是,这项工作只用FK1、域包含peptidyl-prolyl顺反异构酶(PPIase)功能的蛋白质。因为FKBP51和FKBP52包含一个额外的和密切并列PPIase-like域(FK2),可能timcodar可能控制通过FK2 FKBPs域。

在这些研究中,我们表明,timcodar 3 t3-l1细胞类似于雷帕霉素抑制脂质积累和吸收FK506没有效果。有趣的是,timcodar强劲压抑的表达主脂肪形成的监管机构,PPARγ,比雷帕霉素强得多。这些初步研究表明timcodar可能作为治疗肥胖。

2。材料和方法

2.1。材料和细胞系

鼠标3 t3-l1 preadipocyte细胞常规培养和维护在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)含10%牛牛血清或与1% penicillin-streptomycin的边后卫。从细胞信号技术吸收FK506和雷帕霉素,Inc .(波士顿)。vx - 853是一个礼物从布鲁斯金博士(俄勒冈健康与科学大学)。

2.2。扩散分析

3 t3-l1细胞(2.5×10⁴细胞每口井)镀在含10%小牛血清DMEM 12-well板块。药物对增长率的影响确定在48小时内与0.1和1.0进行治疗μ吸收FK506的米,雷帕霉素或timcodar。细胞增殖是由一个量热试验用MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴)如前所述[35]。

2.3。脂肪生成分析

脂肪形成的3 t3-l1细胞的分化是通过治疗1μ敏捷,830 nM胰岛素,和100年μM isobutylmethylxanthine在10%的边后卫在0天的差异化协议(1- - - - - -3]。在分化,细胞被沾尼罗红可视化脂质含量,和微用作直接测量中描述(1- - - - - -3]。确定timcodar对脂肪形成的影响我们对待0μ0.1米(Ctrl)μ1.0米,μM timcodar 9天中脂肪生成过程。比较与其他大环内酯物timcodar药物对脂肪形成的影响我们接受1μM吸收FK506, 1μ米雷帕霉素,1μM timcodar 9天中脂肪生成过程。从尼罗红染色细胞总RNA提取用于实时PCR分析(见下文)。

2.4。定量实时聚合酶链反应分析

组织总RNA提取鼠标使用5 ' PerfectPure细胞RNA工具包(费舍尔科学公司,有限责任公司)。总RNA读NanoDrop 2000分光光度计(热费希尔科学、威明顿、德),并使用高容量cDNA逆转录互补脱氧核糖核酸合成装备(应用生物系统公司)。PCR扩增的互补脱氧核糖核酸是由定量实时PCR使用TrueAmp SYBR绿色qPCR SuperMix(推进生物科学)。热循环协议由10分钟在95°C, 40 15秒的周期在95°C, 30秒60°C, 20秒在72°C和完成一个融化曲线从60到95°C允许特定产品的区别。规范化进行了在不同的反应引物序列表1。

2.5。凝胶电泳和免疫印迹

整个细胞提取物(WCE)在一夜之间由冷冻细胞颗粒−80°C。3卷的颗粒被resuspended WCE缓冲区(20毫米消息灵通的,0.42 M氯化钠,EDTA 0.2米,和25%甘油;pH值7.4)加蛋白酶抑制剂鸡尾酒和孵化冰上十分钟紧随其后在4°C 100000×g离心。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质样本解决electrophoretically转移到Immobilon-FL膜。膜被封锁在室温1小时在TBS (TBS;10毫米Tris-HCl (pH值7.4)包含3% BSA和150毫米氯化钠)。随后,细胞膜在一夜之间被孵化与抗体PPAR在4°Cγ(圣克鲁斯,7273),C / EBPα(圣克鲁斯,365318),或热休克蛋白90(一半)(圣克鲁斯,13119)(圣克鲁斯生物技术,达拉斯,德克萨斯)。后三个洗TBST (TBS + 0.1%渐变20),膜与红外anti-rabbit孵化(IRDye 800,绿色)或anti-mouse(680年IRDye红色)二级抗体贴上IRDye红外染料(LI-COR生物科学)2小时在4°C。免疫反应性是可视化和量化奥德赛的红外扫描系统(LI-COR生物科学)。

2.6。统计分析

数据分析与棱镜5 (GraphPad软件,圣地亚哥,CA)使用方差分析结合图基的后续测试比较双组意味着或未配对测试。值0.05或更小的被认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

在这个调查中,我们首次展示timcodar可以抑制脂肪形成的脂质积累在细胞模型。我们曾表明FKBP蛋白质,FKBP52 FKBP51,微分影响核receptor-regulated基因活动(2,3,9,35]。我们还表明,针对FKBP蛋白可以改变脂质积累(1- - - - - -4]。在这项研究中,我们利用三个immunophilin药物,吸收FK506,雷帕霉素,timcodar(图1)。如上所述,吸收FK506雷帕霉素已知绑定FKBP12和大TPR-containing FKBPs, FKBP52和FKBP51等。相比之下,timcodar已经开发成一个non-FKBP12-binding immunophilin [30.]。没有绑定FKBP12 immunophilin药物之间可能由于结构上的差异。吸收FK506和雷帕霉素都是大环内酯类,定义的一个大的大环内酯和吡喃糖基。Timcodar缺乏这些具体要求;然而模拟结构特征的化合物具有功能上面的大环内酯类吸收FK506和雷帕霉素。尽管有一些相似性,timcodar不包含一个大环的环,这也许可以解释为什么timcodar明显差异不绑定FKBP12(图1,存在和缺乏“大环的连接”)。最FKBP12 FKBP蛋白质特征,在T淋巴细胞是免疫抑制剂的目标的活动13,36]。此外,FK506-FKBP12也和rapamycin-FKBP12交互导致抑制mTOR活动,导致蛋白质翻译的抑制。FK506-FKBP12复杂引发免疫抑制通过抑制钙调磷酸酶calmodulin-dependent磷酸酶活动,2 b型钙/ calmodulin-dependent磷酸丝氨酸/ phosphothreonine蛋白磷酸酶(12]。另一方面,rapamycin-FKBP12复杂的免疫抑制剂,但没有影响calmodulin-dependent磷酸酶活性(12]。吸收FK506抑制磷酸酶活性增强脂肪细胞的分化,增加脂质积累(14]。FKBP51已被证明能够抑制钙调磷酸酶(23),这可能是它增加脂质积累的主要方法。另一方面,mTOR信号可能受FKBP51,因为它已被证明与FKBP12竞争抑制(22]。施赖伯等人最近发现雷帕霉素结合FKBP51增长和抑制信号通路如mTOR [22),已经被证明可以减少脂肪形成的脂质积累在细胞模型(10,17]。

基于上述情况,我们认为timcodar,像雷帕霉素,同时还能调节脂肪形成和脂质积累。第一个测试,吸收FK506的影响,雷帕霉素,timcodar生长抑制特性和毒性3 t3-l1细胞以治疗为0.1和1.0μ米每个化合物的在一个MTT试验(图2(一个))。吸收FK506浓度和雷帕霉素显著抑制增长。Timcodar(0.1和1.0μ米),然而,没有对生长抑制的影响。接下来,确定timcodar在脂质积累的影响,我们把3 t3-l1脂肪细胞与0.1和1.0μM(图2 (b)),并显著抑制脂质积累在1μ雷帕霉素(1 m .比较μM)和timcodar (1μ米)表明,他们都显著(减少脂质积累(图2 (c))。没有明显(脂质积累和吸收FK506(1)变化μ米),即使数据略有升高。

之前我们已经表明,timcodar最可能的目标是FKBP51因为它解救了糖皮质激素(GC)信号在FKBP52淘汰赛MEF细胞保留正常数量的FKBP51 [33]。相比之下,FKBP51淘汰赛细胞减少脂质积累(2,3),这表明timcodar可能产生重大影响脂肪形成的信号通过FKBP51抑制和敏化gc。GC的响应性可以通过测量确定GC受体的活动(GR)在已知的基因调控37]。GR基因(NR3C1)是复杂的,是只有一个副本,或者拼接创建多个亚型:GR)α,GRβ,GRγ、丁腈橡胶和GR-P [38]。GRα是典型的受体类型被绑定到GCs和激活或抑制基因GC响应元件(GRE)启动子(37]。相比之下,GRβ不绑定GCs和抑制GR吗α(37,39- - - - - -41]。因此,GR的比率α图像β(GRα/ GRβ)可以协助确定GC敏感性[37,39- - - - - -41]。雷帕霉素治疗增加GRβ信使rna,但是没有GR的变化α/ GRβ观察比率(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。吸收FK506对GR没有影响α或GRβ表达式。然而,Timcodar显著(GR)增加α信使rna,但是没有GR的变化β表达式,并导致显著增加GR的比率α/ GRβ()。更重要的是,GC-responsive丙酮酸脱氢酶激酶基因(PDK4)和激素性亮氨酸拉链(GILZ)显著((图)增加timcodar治疗3 (d)),这是高于雷帕霉素。吸收FK506对PDK4没有改变、GILZ或p21表达。雷帕霉素p21增加高于控制、吸收FK506或timcodar。雷帕霉素的抗增殖特性可能归因于高程的细胞周期阻滞蛋白质,p21 [42,43]。雷帕霉素是一种已知的抑制剂的扩散和显著(MTT测定图)抑制增长2(一个)。antiadipogenic timcodar的影响可能部分归因于增加GILZ表达式。GILZ已被证明是一种抑制剂脂肪形成的间充质干细胞,3 t3-l1 C3H10T1/2脂肪细胞(44,45]。GILZ抑制PPARγ通过直接绑定到启动子转录,这减少了脂肪细胞的分化(44]。

脂肪形成的过程是由两个主要的监管机构,PPARγ和C / EBPα。药物抑制PPARγ- c / EBPα轴被认为是antiadipogenic,减少脂质积累。在数据4(一)和4 (b),雷帕霉素和timcodar抑制PPARγ和C / EBPα蛋白质和mRNA表达,证明他们是antiadipogenic,至少部分由PPAR的抑制γ- c / EBPα轴。有趣的是,timcodar (1μ米)强劲抑制PPAR的表情γ蛋白质和信使rna,它是更重要的比雷帕霉素(蛋白质,;信使rna,)。然而,C / EBPα被雷帕霉素和timcodar压制在相似的水平。相比之下,吸收FK506 (1μ没有改变PPAR M)治疗γ和C / EBPα表达式。有趣的是,Pref-1并不影响吸收FK506或timcodar但被雷帕霉素诱导(1μ米)(图4 (c))。Pref-1已被证明是一种抑制剂的脂肪形成46,47),这可能是一条由雷帕霉素抑制脂质积累。细胞因子的生产从脂肪细胞可能导致肥胖的低度炎症状态,最终可能导致胰岛素抵抗表现型。肿瘤坏死因子等细胞因子的表达α和il - 6,由C / EBP监管β(48,49]。C / EBPβ是一个脂肪形成的早期反应基因,后来减少到正常水平后脂肪细胞成熟(50]。两个吸收FK506 timcodar没有影响C / EBP的表情β(图4 (d))。但是,雷帕霉素(1μ米)显著()提高C / EBPβ成熟脂肪细胞的表达。动物的可能,长期雷帕霉素治疗可能导致胰岛素抵抗通过长期增加C / EBPβ,或者通过GRβ(37]。张等人的研究表明,长期雷帕霉素政府在高脂饮食小鼠有不利影响在啮齿动物血糖(51]。雷帕霉素诱导的胰岛素抵抗与白藜芦醇能够逆转52),这表明活性氧(ROS)可能参与其中。抗氧化剂减少肥胖预防自由基释放(53,54),进而抑制ROS生产和免疫细胞信号通过磷酸化的NF -下降κB (55]。此外,Makki等人证明了rapamycin-FKBP12轴抑制诱导葡萄糖耐受不良的CD4 + t细胞和CD8 +细胞表达增加56]。改变免疫系统的信号已被证明导致葡萄糖耐受不良(57]。

几项研究已经报道,雷帕霉素antiadipogenic属性,减少脂质积累(52,56,58,59]。雷帕霉素抑制基因参与脂肪酸的新陈代谢和存储,这是必不可少的脂肪形成的过程和调节脂类的积累。Timcodar (1.0μ米)抑制基因治疗新创脂质生产和脂质储存,如脂肪酸合成酶(FASN)固醇调节元件结合蛋白1 (SREBP1) stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1)和脂肪酸结合蛋白4 (FABP4)(数据5(一个)- - - - - -5 (d))。雷帕霉素(1μ米)治疗抑制FASN的表达式和SCD1但并不影响SREBP1或FABP4的表达。吸收FK506 (1μ米)显著((图)增加SCD1表达式4 (c))。timcodar影响脂质积累很可能从复合减少PPAR的能力γ- c / EBPα轴。然而,timcodar肥胖病人或啮齿动物的影响是未知的。

4所示。结论

Timcodar是一个强有力的抑制剂的脂肪形成的过程,在未来疗法可能是有用的。几项研究已经报道,雷帕霉素具有典型属性。然而,长期雷帕霉素政府可能诱导胰岛素抵抗和II型糖尿病。重要的是,timcodar不绑定到小FKBP蛋白质,如FKBP12,抑制mTOR和免疫系统所必需的。我们确实发现timcodar强劲抑制脂质积累,被抑制的基因调节(PPAR的脂肪形成的过程γ和C / EBPα),新创脂质生产和存储。抑制肥胖的脂肪细胞的扩张提供了一个途径来调节身体质量的大小。虽然其作用机理仍未得到解决,这些结果表明,timcodar可能作为一种新的治疗肥胖症的治疗,这是随着流行病迅速加剧。

信息披露

内容是完全的责任作者,不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢布鲁斯金博士为这些研究提供timcodar药物。研究报告在这个出版得到了国家心脏,肺和血液研究所的美国国立卫生研究院的奖号。K01HL125445(特里·d·希德Jr .)和L32MD009154(特里·d·希德Jr .)和美国国立卫生研究院骄傲格兰特(HL106365)(特里·d·希德Jr .)。