Natalizumab治疗在多发性硬化症女性患者中调节过氧化物酶体增殖物激活受体表达

摘要

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)是转录因子，提示参与自身免疫性脑脊髓炎和多发性硬化(MS)的炎症病变。我们的目的是评估Natalizumab (NTZ)治疗是否与MS患者PPAR表达的改变相关。我们分析了先前使用一线免疫调节剂(基线)和NTZ治疗后MS患者外周血单个核细胞(PBMC)中PPAR的基因表达以及血液炎症标志物。PPAR无差异α, PPARβ/δ, PPARγ并且在基线和健康对照下的患者之间发现CD36 mRNA表达。在三个月内，NTZ增加了PPARβ/δ信使rna (）与基线相比，而MRNA表达PPARγ而CD36(一种众所周知的PPAR靶基因)则低于健康对照组(和、职责)。尽管这些变化趋势在治疗6个月后仍然存在，但结果没有统计学意义。患者骨桥蛋白水平升高()，且在NTZ治疗随访期间无变化。这些结果表明ppar介导的过程可能参与了NTZ治疗的作用机制。

1.介绍

多发性硬化症（MS）是中枢神经系统的脱髓鞘和神经变性疾病。通常人们普遍认为，自身反应性T细胞和血脑屏障（BBB）的单核细胞迁移对疾病的发病机制至关重要。过氧化物体增殖物激活的受体（PPAR）是代谢和免疫过程中的转录因子[1[调节T细胞介导的自身免疫和实验性自身免疫脑脊髓炎（EAE）的严重程度，多发性硬化的动物模型（MS）[2- - - - - -4］．在MS患者中，外周血单核细胞（PBMC）表现出降低的PPARγ表达与疾病活动性和PPAR呈负相关γ激动剂可能有有益的作用[4- - - - - -6］．一些研究表明PPARα［2)和PPARβ/δ［7也应考虑使用特异性激动剂作为治疗这种疾病的可能策略。

在目前的探索性研究中，我们分析了接受Natalizumab (NTZ)治疗的患者，NTZ是一种人源化单克隆抗体α4种整合素分子，抑制白细胞向中枢神经系统的转导并诱导外周血循环中免疫功能的复杂改变[8- - - - - -10］．然而，这种治疗对多发性硬化症的有利作用和潜在的不良事件背后的机制尚不完全清楚。根据文献，我们假设NTZ治疗可以改变PBMC中PPAR和CD36基因的表达。CD36是一种天然免疫受体，表达于内皮细胞和小胶质细胞/巨噬细胞中，可被PPAR上调γ［1］．我们还检测了血液中金属蛋白酶-9 (MMP-9)、新蝶呤和骨桥蛋白(OPN)的水平，因为它们的表达可能受到PPAR的调节[1]及多发性硬化症治疗[8，11，12］．

2.材料和方法

2．1．病人

12名复发缓解型多发性硬化症(RRMS)女性患者从里斯本(葡萄牙)的两个多发性硬化症临床中心招募，并计划开始使用NTZ治疗。这些患者的平均年龄为43岁(SD: 12);平均病程11.6年(SD: 8.8);平均扩大的残疾状况量表为4.1 (SD: 1.9);年复发率为2.9 (SD: 1.7)。平均年复发率是根据每个受试者在一线免疫调节剂治疗前两年的复发次数计算的。11名患者接受了干扰素-1a治疗(reif, 44岁μg s.c.)每周3次或干扰素-1b (Betaferon, 250μG S.C.）每隔一天。一名患者用Glatizamer乙酸酯注射治疗。在一周的洗涤期后从这些患者收集血液样品，然后在每月一次（基线）静脉注射300mg NTZ进行300mg NTZ之前。在抽样时，没有患者患有复发，也没有服用降脂剂，没有类固醇治疗至少1个月。在切换治疗后的三个月和六个月内，在输注之前，还可以获得血样，在输注NTZ之前。在本研究期间，没有患者患有复发或用皮质类固醇药物患有药物。所有患者和9名年龄匹配的女性健康控制签署了知情同意。当地伦理委员会批准了这项研究。

2．2.RNA提取及PCR分析

在静脉穿刺和PBMC通过淋巴细胞分离培养基梯度收集血液后立即加工血液。根据制造商的方案，使用QIAAMP RNA血液迷你试剂盒（QIAGEN）处理mRNA的纯化。PPARα, PPARβ/δ, PPARγ，定量RT-PCR检测PBMC中CD36 mRNA的表达。使用随机六聚体引物和上标逆转录酶(Life Technologies, France)对RNA进行逆转录，并使用Brilliant III Ultra-Fast对cdna进行定量SYBRGreen使用特定的寡核苷酸(用于PPARγ或通过Kit Brilliant Multiplex QPCR Master Mix Agilent同时检测PPAR的表达α, PPARβ/δ，以及Mx3000仪器上的嗜环素(Stratagene, La Jolla, CA)(参见补充信息在线http://dx.doi.org/10.1155/2016/5716415用于引物和探针)。通过ΔCt方法计算各基因的相对表达量，其中ΔCt为靶基因Ct值减去亲环素mRNA的Ct(阈值周期)值得到的值。靶蛋白相对于嗜环蛋白mRNA的量表示为．

2．3.生物化学分析

从相同的样品中采集血浆和血清，在−80°C下保存至使用。采用市售酶联免疫吸附试验(ELISA)测定MMP-9、OPN (Quantikine ELISA Kit, R&D Systems Europe, Abingdon, UK)和新opterin (ELISA Kit, IBL, Hamburg, Germany)。

2．4．统计分析

PPAR的表达α, PPARβ/δ, PPARγ， CD36 mRNA和炎症标志物的浓度比较患者和健康对照组使用两份样本测试。采用单样本分析NTZ治疗3个月和6个月时这些参数与基线的变化测试。采用Pearson相关系数分析PPAR表达变化与炎症介质变化的相关性。一个值<0.05被认为是统计学意义的。

3.结果

研究人群PBMC中PPAR和CD36 mRNA表达的结果如图所示1．PPAR无差异α, PPARβ/δ, PPARγ，以及基线治疗组与健康对照组之间CD36 mRNA的表达。服用NTZ三个月后，患者的PPAR更高β/δmRNA表达与基线相比(平均差异14.5 (95% CI: 4.4, 24.6)，)．此外，NTZ治疗的患者PPAR较低γ(平均差- 64 (95% CI: - 120， - 9)，)和CD36(平均差为- 32 (95% CI: - 60， - 4)，) mRNA的表达高于正常对照组。CD36水平也低于基线(平均差异- 32 (95% CI: - 60， - 4)，)．虽然这种改变趋势在接受NTZ治疗6个月后仍然存在，但结果没有统计学意义。相比之下，这种治疗没有改变PPARα基因在PBMC中的表达。

血浆炎症标志物浓度见表1．发现患者与健康对照之间的MMP-9蛋白水平没有统计学意义差异。基线下的患者患有较高的Neopterin水平，而不是健康的对照（方法3.9（95％CI：0.4,7.3），)．NTZ疗法将新蝶呤降低到正常水平。在基线水平下，患者的OPN水平高于健康对照组(平均差异53 (95% CI: 23,84)，)和三个月(平均差异30 (95% CI: 10,50)，)和6个月(平均差异33 (95% CI: 10,56)，关于NTZ治疗。未观察到PACT表达的变化与炎症介质的变化之间没有统计学上的相关性（数据未显示）。这些结果保持不变，无论是否从分析中排除了接受Glatizamer醋酸酯处理的患者。

4.讨论

该探索性研究表明，NTZ诱导PPAR的选择性改变β/δ和PPAR.γms患者PBMC的基因表达。这种治疗与外周血活化T细胞的隔离和血液中促炎细胞因子的增加有关[8- - - - - -10］．炎症刺激降低了PPARγ启动子活性与基因转录和PPARγ激动剂具有抗炎作用，能够上调CD36的表达[1，4，5］．因此，NTZ诱导全身炎症反应可能是PPAR降低的原因γ和CD36基因在患者PBMC中的表达。重要的是，全身炎症活动与NTZ在减少鞘内炎症生物标志物方面的有益作用有关[8，9］．人们普遍认为NTZ会阻塞α4β1 (VLA-4)整合素介导的白细胞向CNS的转运[8- - - - - -10］．在这方面，PPAR很有趣γ可以调节的表达β1整合素[13］．此外，在未接受治疗的MS患者中，PPAR显著升高γ脑脊髓液（CSF）的水平与鞘内炎症增加有关[14］．总的来说，这些数据表明PPARγ-介导的过程可能有助于NTZ的作用机制。相比之下,PPARβ/δ这种药使基因表达增加。PPARβ/δ在免疫调节中具有复杂的作用。虽然PPAR.β/δ激动剂有很强的抗炎作用，也可能诱发一些免疫刺激成分[15］．在实验模型中，PPARβ/δ表达介导抑制中枢神经系统自身免疫的独特机制[3.和促进髓鞘形成[7］．因此，目前的结果可能表明PPAR之间的联系β/δ和NTZ的保护作用。值得注意的是，PPARα在我们的女士妇女的队列中，mRNA水平不变。事实上，PPARα研究表明，在男性中，EAE的表达可以调节促炎细胞因子的产生和EAE的发展，但在女性中没有[2］．这些发现表明，分析PPAR是否具有重要意义α也调节NTZ治疗作用机制中的性别差异。

由于大多数患者已经接受了干扰素治疗，所以血浆新蝶呤水平在基线水平上升高并不意外。这种治疗的作用机制已知会增加巨噬细胞激活的炎症标志物[11］．值得注意的是，在NTZ治疗过程中，血浆内转蛋白降至正常水平。如大多数研究所述，在我们以前用免疫调节器药物治疗的患者中增加了血浆OPN [12，16］．然而，与新蝶呤相比，在NTZ治疗的前6个月，OPN水平没有显著变化。在最近的一项研究中，NTZ仅在治疗12个月后才降低了OPN水平，并与认知功能的改善相关[12］．在这方面，PPAR的潜在相关性γ和PPAR.α激动剂对OPN基因表达有抑制作用[17，18］．NTZ治疗诱导的T细胞活化和细胞因子产生的系统谱已经显示为时间依赖性，并且在单个受试者中可能会发生变化[9，10］．目前研究结果的一个主要限制是研究人群的规模小和治疗的随访时间短。因此，他们不排除PPAR在调节患者对这种治疗的反应中的作用。这需要在更长的治疗周期下进行更大的样本队列测试，并包括其他细胞因子测量和成像数据。与持续NTZ治疗相关的一个主要问题是，潜在病毒感染激活的风险增加，包括进行性多灶性脑白质病变的发生。在目前的背景下，需要注意的是，血浆OPN在表现出认知主诉的艾滋病毒感染者中尤其增加[19]和PPARγ和PPAR.α激动剂可预防hiv诱导的炎症反应[20.］．

总之，我们的研究结果表明，NTZ治疗诱导了循环免疫细胞中ppar介导过程的选择性改变。这些结果需要在更大的患者队列和更长的治疗随访期中得到证实。根据回顾的数据，他们建议PPAR应该被认为是MS患者对NTZ治疗反应的潜在有用的生物标志物。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

Véronique Ferret-Sena、Alexandra Maia e Silva、Inês Cavaleiro和Bruno Derudas对实验室分析做出了贡献，并修改了手稿。Armando Sena对研究的设计、数据的获取和手稿的撰写做出了贡献。José淡水河谷为获取数据做出了贡献，并修改了手稿。Giulia Chinetti-Gbaguidi和Bart Staels对监督研究和撰写手稿做出了贡献。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

致谢

作者感谢J. C. Vasconcelos博士对手稿的统计分析和批判性审查提供的帮助。这项工作得到了Biogen Idec (Natalippar项目)的支持。

补充材料

参考文献

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