文摘

尽管睾酮作为代谢激素的重要性,其对缺血性心脏的心肌代谢的影响尚不清楚。心肌缺血导致代谢重构,最终导致ATP缺乏和心脏功能障碍。在目前的研究中,睾酮替代对缺血性心脏的影响评估在去势大鼠心肌梗死模型建立了切断左冠状动脉前降2周后阉割。实时聚合酶链反应和免疫印迹分析的结果表明,过氧物酶体proliferator-activated受体α(PPARα)在去势大鼠缺血心肌,减少与sham-castration组相比,和mRNA脂肪酸代谢相关基因的表达(脂肪酸的移位酶CD36,肉碱palmitoyltransferase我和碳链酰coa脱氢酶)和葡萄糖transporter-4也降低了。去势大鼠中ATP含量下降伴随着心肌细胞凋亡增加,纤维化和心脏功能受损,与sham-castration组相比,这些不利影响被睾丸激素替代逆转。综上所述,我们的研究表明,睾酮可以通过移植调节心肌代谢重构PPARα心肌梗死后,施加保护对心脏功能的影响。

1。介绍

心脏代谢重构的特点是在底物利用率和线粒体生物起源和功能障碍,导致三磷酸腺苷(ATP)不足1]。区域心肌梗死导致心脏重构,降低心脏的能力产生足够的ATP维持心脏功能。当这些代谢变化会导致心脏衰竭(2],调制的心脏代谢可能是另一种方法来防止心肌梗死的心脏功能障碍。

心肌梗死导致部分胰岛素抵抗伴随着减少脂肪酸氧化和受损的线粒体生物起源的差别除了对这些代谢基因(3- - - - - -5]。过氧物酶体proliferator-activated受体α(PPARα)是一个核受体功能脂肪酸代谢的主要转录监管机构在心脏。PPARα目标基因包括脂肪酸移位酶(CD36)和肉碱palmitoyltransferase我(mCPT-1),参与导入的细胞和线粒体脂肪酸,碳链酰coa脱氢酶(MCAD),催化碳链脂肪酸的病原反应步骤β氧化(6]。此外,PPARα调节葡萄糖代谢。Heart-specific PPARα超表达诱导的转录脂肪酸代谢相关的基因和基因会使葡萄糖运输和PPARα空的老鼠显示增加葡萄糖transporter-4 PPAR的差别(GLUT-4)表达和对这些α有针对性的脂肪酸代谢的基因(7]。PPARα已经成为一个有吸引力的目标,提高代谢重构。

雄激素在心肌梗死的作用是有争议的。研究表明,高水平的睾丸激素副作用在心肌梗死后心脏重构和功能(8,9];然而,在不同的研究中,慢性睾丸激素治疗心肌梗死后没有不利影响,建议改善长期结果,减少左心室舒张末期压力和壁压力(10]。睾丸激素也已被证明能够降低梗塞大小orchidectomized缺血再灌注的大鼠(11,12]。患者的冠状动脉疾病,睾丸素不足与贫穷相关结果与心脏衰竭和对生存有很大的负面影响13]。睾酮是一种重要的激素,参与调节碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢(14]。低睾酮水平与受损的胰岛素敏感性有关,体脂百分比增加,树干的肥胖和血脂异常(15),睾丸素不足是男性心血管发病率和死亡率的危险因素(16]。尽管睾酮对心肌代谢的影响(17),对睾丸激素的作用在调节心脏缺血性心脏代谢重构。这个实验的目的是评估的影响睾酮替代心脏代谢重构通过调节PPAR的表达α及其下游基因在去势大鼠心肌梗死模型。

2。材料和方法

2.1。动物

雄性Wistar鼠体重220 - 250克从实验动物中心获得哈尔滨医科大学第一附属医院。老鼠维持温控(22 - 24°C)和生理条件下免费使用啮齿动物食物和自来水。所有实验都是按照协议执行的护理和使用实验动物伦理委员会批准的国家研究委员会,我们的医院。

2.2。阉割和激素替代

老鼠与腹腔内注射10%水合氯醛麻醉(3毫升/公斤),和阉割(Cas)或sham-castration (S-Cas)后随机执行先前描述的方法(18]。动物被随机分成四组:(1)sham-castration +安慰剂(S-Cas),(2)阉割+安慰剂(Cas),(3)阉割+睾酮(Cas + T),和(4)阉割+睾丸激素和flutamide (Cas + T + F)。根据分组的不同干预措施进行了当天的手术,以避免破坏荷尔蒙的影响(19]。丙酸睾酮(氨基酸,P。F,天津,中国)溶解在花生油的生理剂量皮下注射2毫克/公斤/天,和flutamide(σ化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国),雄激素受体(AR)的拮抗剂,溶解在丙二醇注射的剂量30毫克/公斤/天(20.]。花生油(2毫克/公斤/天),作为安慰剂,注入大鼠在组1和2。

2.3。心肌梗死模型

两周后阉割,老鼠收到左冠状动脉结扎建立心肌梗死模型(21]。简而言之,腹腔内注射的老鼠麻醉水合氯醛(3毫升/公斤),然后他们有机械正压通风频率为65 - 70 /分钟的呼吸器。左冠状动脉的结扎3/8针和6 - 0缝合线。建立的成功证实了热烫的左心室前壁和典型的st段抬高。共有27个老鼠(8 S-Cas 6 ca 7 Cas + T,和6 ca + T + F)包含在分析完成后14天的结扎和皮下注射睾酮有/没有flutamide。额外的正常大鼠(),经历了同样的过程没有阻塞作为对照组。

2.4。超声心动图研究

超声心动图进行麻醉在冠状动脉结扎后14天。二维和M-mode图像被用来记录左心室舒张末期直径和左心室收缩末期直径(LVDd不全和LVSd, resp)。从胸骨旁的烈度衰减视图使用超声波机器(SONOS的7500年,飞利浦)配有12 MHz换能器。左心室射血分数(EF)和部分缩短(FS)实时计算。所有测量平均连续三心脏周期。

老鼠被安乐死,从心脏和离心收集血液样本1000 g×20分钟获得血清。心被切除,用生理盐水灌溉。切除心房后,右心室,大血管,和阀门,左心室快速冻结在氮和储存在−80°C或固定在4%多聚甲醛和嵌入在石蜡进行进一步的组织学分析。

2.5。ATP的测量

ATP浓度测量使用工具从建成生物技术研究所(中国南京)。所有的程序都按照制造商的指示执行。peri-infarct心脏组织均质在盐水和离心机10000 g×5分钟。组织ATP由分光光度计比色法测定636海里(22]。

2.6。实时聚合酶链反应

总RNA提取RNAiso +和reverse-transcribed PrimeScript第一链cDNA使用™RT试剂盒与gDNA橡皮擦(豆类,大津,日本)根据制造商的协议。PPAR的mRNA水平α,CD36 mCPT-1 MCAD, GLUT-4 peri-infarct心脏组织测量通过实时PCR SYBR绿色(罗氏公司、德国)公司ABI 7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司,福斯特,CA)。基因表达的相对量化决心通过比较GAPDH target-amplified产品,这是作为一个内部标准。表中描述的引物序列1。

2.7。西方墨点法

从左心室peri-infarct组织提取蛋白质,10% sds - page分离,并转移到聚乙二烯二氟化物膜如前所述[23]。然后,细胞膜受到主要PPAR抗体α(1:200年,圣克鲁斯,达拉斯,德克萨斯,美国),GLUT-4(1: 800年,细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国),和GAPDH(康晨1:5000年,中国上海)其次是相应的辣根peroxidase-conjugated二级抗体(中山1:2000年,北京,中国)。蛋白质乐队可视化使用增强化学发光检测试剂(热科学™沃尔瑟姆,美国马)和接触x射线胶片。发达的电影是数字化扫描仪(佳能要110年,日本)。带强度(面积×OD)分析了使用NIH ImageJ软件(美国韦恩Rasband,马里兰州贝塞斯达),GAPDH和蛋白质水平正常化。

2.8。组织病理学

心肌样本切成5μ米厚的横截面纤维疤痕的中心和沾Masson-Trichrome估计心肌纤维化。纤维化面积百分比计算,用来量化peri-infarct地区心脏纤维化的程度。分析了随机选择的数码照片的每个片使用图像分析软件(Image-Pro + 6.0,媒体控制论,罗克维尔市,医学博士,美国)。纤维化面积的百分比计算的比率积极中纤维化心肌总面积。

细胞凋亡测定使用TUNEL分析如前所述[21]。程序的指令是由原位细胞死亡检测装备,POD(罗氏,曼海姆,德国)。凋亡细胞的比例计算的总数计算细胞至少6×400随机选择字段放大显微镜下使用Image-Pro + 6.0软件。

2.9。测量血清睾酮和雌二醇

血清睾酮和17β雌二醇水平测量与商业化酶联免疫测定(ELISA)试剂盒(Uscn生命科学公司,休斯顿,德克萨斯州,美国)。所有程序都按照手册执行如前所述[24]。检测极限为0.0437 ng / mL为17睾丸激素和4.75 pg / mLβ雌二醇。

2.10。统计分析

结果平均值±标准偏差。单向方差分析(方差分析)其次是图基的事后测试来确定差异进行组间通过使用SPSS 20.0统计软件(SPSS Inc .)、芝加哥,美国),和被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。改变PPAR的mRNA和蛋白表达α

PPARα在调节心脏能量代谢方面起着关键作用。在目前的研究中,实时PCR(图1)和免疫印迹(数字2(一个)和2 (b))表明,PPARα在mRNA和蛋白水平表达下调S-Cas组与对照组相比),表明心肌infarction-induced代谢重构涉及PPAR的抑制α信号。阉割进一步减少PPARα信使rna和蛋白质的表达(Cas与S-Cas,),它被暴露在救起睾酮增加mRNA和蛋白表达(Cas + T与中科院,);额外flutamide治疗没有下调PPARα水平相比单独使用睾酮治疗组()。综上所述,这些研究结果表明内源性睾酮不足PPAR受损α在大鼠心肌梗死模型信号,这种效应被睾丸激素替代逆转。

3.2。脂肪酸代谢相关基因的mRNA表达

脂肪酸代谢的主要监管机构的mRNA水平(CD36、mCPT-1 MCAD)被评估在不同的组(图3)。CD36的表达、mCPT-1 MCAD ()下调S-Cas组与对照组相比。阉割进一步CD36的mRNA水平下降,mCPT-1和MCAD ()与S-Cas组相比,而睾酮替代增加表达式()与去势大鼠相比。Flutamide没有对抗的影响睾酮替代CD36的表达,mCPT-1和MCAD ()(Cas + T + F与中科院+ T)。

3.3。睾酮对GLUT-4的表达的影响

GLUT-4 mRNA和蛋白水平(数字4和5),它负责葡萄糖运输、高S-Cas组与对照组相比,但没有显著差异()。阉割的信使rna和蛋白质水平降低GLUT-4(中科院与S-Cas,),而睾酮可以减弱GLUT-4下降而去势大鼠()。Flutamide没有阻止睾酮的影响(Cas + T + F与中科院+ T,)。

3.4。ATP浓度的变化

ATP的浓度在大鼠左心室组织团体(图之间的比较6)。ATP水平S-Cas组低于对照组(794.80±82.97和1109.67±140.17μ摩尔/ gprot,),阉割进一步减少ATP的水平相比S-Cas组(514.96±56.96和794.80±82.97μ摩尔/ gprot,)。睾丸激素的治疗,ATP的水平恢复,与去势大鼠(783.81±76.22和514.96±56.96μ摩尔/ gprot,)。额外flutamide治疗ATP含量下降与睾酮组相比,但没有统计学意义(715.04±67.57和783.81±76.22μ摩尔/ gprot,)。

3.5。睾酮对心脏功能的影响

心脏功能是由超声心动图评估在结扎后14天(图7)。左心室舒张末期和收缩末期直径的心肌梗死心脏高于对照组(),表明心脏扩张,而EF和FS减少心肌梗死的心(),表明心脏功能受损。阉割加重心脏功能的损害,进一步减少EF(42.22±2.29%和51.98±2.95%,)和FS(16.72±1.09%和21.71±1.61%,)和增加LVDd(7.32±0.35和6.02±0.32毫米,不全)和LVSd(6.10±0.34和4.72±0.33毫米,),而S-Cas组。睾酮替代LVDd 6.09±0.43毫米(减少不全)和LVSd 4.76±0.42毫米(表示的)和改善心肌的性能,增加EF(52.41±3.00%和42.22±2.29%,)和FS(21.95±1.65%和16.72±1.09%,)值,与去势大鼠相比。这些参数之间的差异Cas + T + F组和Cas + T组没有达到统计学意义(所有)。

3.6。睾酮对心肌细胞凋亡的影响及纤维化

TUNEL染色法在不同组的结果如图8 (g)。TUNEL-positive核的数量S-Cas组高于对照组(31.63±2.29%和10.68±0.93%,相比),阉割加重心肌细胞凋亡S-Cas集团()。睾酮治疗显著地抑制细胞凋亡,凋亡细胞百分比低于去势组(35.10±3.52%和51.59±5.45%,)。

Masson-Trichrome染色被用来估计所有组的心肌纤维化程度的数字8(一个)- - - - - -8 (f)。纤维化的面积明显高于S-Cas老鼠比对照组(10.29±1.47%和1.25±0.14%,)和阉割加重心肌纤维化()。睾酮替代减毒的纤维化程度10.72±1.51%,相比15.63±1.63%的去势组()。对心肌细胞凋亡和纤维化(Flutamide没有影响)。结果表明,睾酮对心肌细胞凋亡和纤维化具有保护作用。

3.7。血清睾酮和雌激素浓度

如图9(一个)阉割睾酮水平显著降低(中科院与S-Cas,),而睾酮替代恢复较去势大鼠血清睾酮水平(5.36±0.43和3.48±0.25 ng / mL,)。没有在统计上有显著差异的血清睾酮水平在对照组之间,Cas + T集团和Cas + T + F组。

平均血清17β雌二醇浓度组(图之间的可比性9 (b))。这些结果表明,雌激素会对每个实验组起到类似的效果。

4所示。讨论

在目前的研究中,睾酮在心脏代谢的影响缺血性心脏研究使用大鼠心肌梗死模型。我们的研究结果表明,阉割PPAR的水平下降α和抑制下游信号,表达下调脂肪酸和葡萄糖代谢相关基因的表达。阉割ATP浓度降低和增加心肌细胞凋亡和心脏纤维化加重心脏功能障碍与心肌梗死有关。睾酮治疗逆转这些不利的结果。

改变心脏代谢中发挥关键作用的发病和进展心肌缺血和心脏衰竭25]。这些代谢变化称为代谢重构,包括从脂肪酸转变为葡萄糖作为首选能源基质,减少氧化磷酸化,和能量传递受损,从而导致ATP缺乏和随后的收缩功能障碍。由于心肌功能的密切联系与能量代谢,代谢途径是心脏功能障碍的潜在治疗靶点治疗(26]。在心脏重塑的早期阶段,心肌能量来源从脂肪酸切换到葡萄糖。减少心脏脂肪酸代谢、脂肪酸转运蛋白和氧化的差别,包括对这些酶,据报道在鼠模型心肌infarction-induced收缩功能;然而,心肌infarction-induced改变心肌葡萄糖代谢仍增加(3- - - - - -5]。尽管更高效率的葡萄糖代谢与脂肪酸相比,增加ATP产量可能不足以弥补ATP缺乏,加重心力衰竭的恶化(27]。卢等人表明,促进脂肪酸氧化葡萄糖不能提高infarct-remodeled能源生产的调节对缺血/再灌注损伤后老鼠的心脏,这可能促进缺血后收缩恢复(28]。因此,逆转代谢转变可能有利于改善缺血后收缩功能障碍(29日]。

转录因子的PPARα扮演着一个重要的角色在调制优化的心脏代谢底物的选择。减少了PPAR的活动α的差别导致了对这些脂肪酸运输和代谢相关基因的表达(30.]。与此同时,PPARαKO小鼠表现出依赖葡萄糖与葡萄糖摄取和增加心肌ATP生产GLUT4表达式(31日,32]。因此,PPAR的调制α激活已被建议作为一个治疗方法,改善心肌功能(33]。PPARα是表达下调,以应对心脏肥大34),心肌梗死(35),和心脏衰竭36与脂肪酸的利用率下降。本研究的结果表明,阉割PPAR的mRNA和蛋白表达下降α缺血性心肌和扭转了这种影响睾酮替代疗法。我们的研究结果还表明,脂肪酸吸收和氧化相关基因在心肌梗死大鼠表达下调与控制老鼠。脂肪酸代谢基因的表达,包括CD36 mCPT-1, MCAD,被阉割进一步下调,而表达水平受到睾丸激素恢复。此外,睾酮替代恢复ATP水平去势后大鼠心肌梗塞。这些结果表明,睾酮可以增强脂肪酸代谢增加ATP生成的缺血性心脏移植PPARα。我们已经表明,睾丸素可以保护线粒体在心肌dt和变弱ATP水平和减少心肌细胞凋亡(24]。符合我们的发现,慢性PPAR的激活α移植心肌的脂肪酸代谢途径,尽管积累甘油三酯没有恶化的左心室功能障碍大鼠梗死模型心脏衰竭(37]。

尽管Collett等人建议PPARα是一个androgen-negative基因在人类前列腺癌(38),另一项研究表明,肾上腺雄激素脱氢表雄酮可能在大鼠引起过氧物酶体增殖反应,可能由androgen-mediated PPAR的增加α(39]。在目前的研究中,我们也证明了睾酮可能上调PPARα表达式。然而,PPAR睾酮的影响α和脂肪酸代谢下游基因的表达可能不被flutamide得罪了。Flutamide,基于“增大化现实”技术的拮抗剂,能阻止睾酮诱导的影响。上述研究表明,睾酮可以PPAR的调制α表达式通过AR-independent机制。我们已经证明睾酮可以部分通过活化蛋白激酶(AMPK),过氧物酶体proliferator-activated受体γcoactivator-1α(PGC-1α)途径防止线粒体功能障碍和心肌细胞凋亡在心肌dt (24]。PGC-1α可以绑定到由PPAR形成α和视黄acid-activated受体(RXR)然后coactivate PPARα加强在心肌脂肪酸利用率(6]。此外,AMPK活化剂可以上调PPARα信号通路抑制心肌肥大(40]。然而,Tennakoon等人证明通过AR-AMPK-PGC-1雄激素调节前列腺癌细胞的生长α信号促进线粒体生物起源和诱导代谢开关(41]。因此,我们应该进一步研究基于“增大化现实”技术之间的相互作用,PPARα,RXR和阐明睾酮的确切机制调节代谢重构dt -心。

睾丸激素的影响可以由睾丸激素的雌激素的转换酶芳香化酶。因此,我们测量血清雌二醇浓度排除其影响。缺乏血清17的差异β雌二醇水平组中暗示雌激素的影响将在每组是相似的。

MHC-PPARα老鼠,它的特点是心脏PPARα超表达,减少葡萄糖运输(42,43]。然而,在目前的研究中,睾酮增加PPAR的表达α以及GLUT-4。睾丸激素的影响在GLUT-4信使rna可能是由AMPK水平。这是支持的一项研究表明,睾酮增加GLUT4-dependent葡萄糖吸收,这是由Ca^{2 +}/钙调蛋白蛋白激酶和AMPK在培养心肌细胞(44]。阐明睾丸激素调节葡萄糖代谢的机制在缺血性心脏,未来的研究将针对调查睾酮对胰岛素信号和葡萄糖氧化的影响,以及其他葡萄糖代谢途径,如糖酵解、磷酸戊糖途径。

总之,目前的研究表明,睾酮不足表达下调PPARα和脂肪酸代谢的改变了mRNA表达和葡萄糖运输相关的基因,影响缺血性心肌ATP生产。睾酮替代疗法逆转这些不利变化和改善心脏代谢重构和心脏功能障碍。这些数据提供新的睾丸素在心血管疾病中的应用。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。