文摘
环戊烯酮的前列腺素15-deoxy-Δ12日,14日前列腺素J2(15 d-pgj2)是一种天然配体的过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR -γγ)和一个潜在的中介在癌细胞凋亡。在目前的研究中,我们评估15 d-pgj的效果2人类甲状腺乳头状癌的细胞(TPC-1)使用不同剂量的15 d-pgj2(0.6 - 20μ米)决定集成电路50(9.3μ通过MTT测定M)。TPC-1上层清液培养基的细胞治疗与15 d-pgj2或车辆(控制)24小时通过CBA il - 6分泌试验评估。RT-qPCR被用来评估mRNA的表达il - 6, SOCS1 SOCS3, STAT3。15 d-pgj TPC-1细胞治疗2降低il - 6的分泌和表达,STAT3, SOCS1和SOCS3的增加。总的来说,我们证明了15 d-pgj2表达下调领导TPC-1 il - 6信号通路和细胞凋亡。总之,15 d-pgj2显示可能成为治疗甲状腺肿瘤的新方法。
1。介绍
结合一些甲状腺癌最常见的内分泌肿瘤显示了作为人类第五常见的肿瘤疾病,发病率增加的速度比其他任何类型。甲状腺癌的治疗主要包括手术切除和消融的组织使用放射性碘,这是只有有效nonmetastatic原发性肿瘤。复发转移性疾病,大多是无法治愈的,需要先进的治疗策略来改善生存(1]。
甲状腺癌和几个信号通路的分子发病机制涉及信号传感器和催化剂的转录(统计),这是一个家庭的转录因子调节细胞增殖、分化、细胞凋亡、免疫和炎症反应,血管生成(2,3]。累积的证据证实STAT3在发展中起着至关重要的作用[4)和中介致癌信号在不同癌症的5]。可以通过刺激诱导的磷酸化STAT3 heterodimeric受体复杂的细胞因子il - 6的家庭,包括il - 6、白血病抑制因子,睫状神经营养因子,制瘤素M, IL-11, cardiotrophin-1 [6]。此外,STAT3磷酸化必须精确控制来维持细胞内稳态在胚胎和成年发展,需要一些消极的参与监管机构(7]。
这些消极的监管机构包括胞质酪氨酸磷酸酶,例如,蛋白酪氨酸磷酸酶1 b统计,抑制细胞因子信号(soc)的蛋白质,阻止细胞因子受体(8]。损失的soc是已知的导致异常激活STAT3的白血病,淋巴瘤,肝细胞癌,肺非小细胞癌(9]。
环戊烯酮前列腺素15-deoxy-Δ12日,14日前列腺素J2(15 d-pgj2),这是一种内源性分子产生PGD的脱水2,是一种天然配体的过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR -γγ)和一个潜在的细胞凋亡(中介10]。15 d-pgj2最近被证明产生抗炎和抗肿瘤的效应在不同细胞系和小鼠模型11- - - - - -15),尽管这种影响是很大程度上独立于PPAR -γ(10),其中许多是通过redox-modulating转录因子介导,如核factor-kappaB (NF -κB),信号传感器和催化剂的转录3 (STAT3),核factor-erythroid 2 (NF-E2)下岗通知相关因素(Nrf2),激活蛋白1 (AP-1),缺氧诱导因子,p53,抗氧化蛋白(16]。在15 d-pgj的亲电羰基礼物2环戊烯酮环被认为是罪魁祸首了大多数此类non-prostaglandin-like效果,因为它及时与半胱氨酸巯基共同反应的蛋白质的关键细胞的增殖机械(10]。
考虑到累积证据指向15 d-pgj强有力的抗肿瘤的效果2以及缺乏研究,调查其对甲状腺恶性肿瘤的影响(17),本研究的目的是评估15 d-pgj化疗的效果2在甲状腺癌细胞在体外。
2。材料和方法
2.1。细胞系
乳头状甲状腺癌(TPC-1)细胞株在杜尔贝科修改选择和培养鹰介质(DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫在湿润有限公司5%2气氛在37°C。正常成纤维细胞细胞系(FG11)是在相同条件下培养和作为细胞毒性的控制。
2.2。分析细胞生存能力
15 d-pgj的效果2用MTT试验对TPC-1可行性评估。简单地说,甲状腺癌细胞被播种在200年96 -孔板包含一式三份μL DMEM + 10%的边后卫(1×104细胞每15 d-pgj)和孵化2在浓度从0.6到20μ为72小时。细胞从每个处理10μ5-dimethylthiazol-2-yl L解决方案3 - (4)2,5-diphenyltetrazolium溴化(MTT);Sigma-Aldrich)和盘子被孵化额外4 h 37°C。硫酸在2 N (200μ信用证)添加和混合彻底解散深蓝色的晶体。转换染料的吸光度测定的分光光度法使用标在570 nm(测试)和650海里(参考)。细胞存活率计算MTT抑制的百分比如下:% =生存(平均吸光度实验/平均控制吸光度)×100。
FG11细胞也播种如上所述TPC-1细胞。他们然后用15 d-pgj孵化2在浓度范围从5到15μ米24、48和72小时。细胞计数和可行性评估Vi-Cell XR设备(美国贝克曼库尔特)。
2.3。评估通过膜联蛋白V染色细胞凋亡
药物引起的细胞凋亡测定使用膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯(膜联蛋白V-FITC)和πcostaining使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测设备(Sigma-Aldrich)。经过24小时的治疗15 d-pgj2在100年,细胞被冲洗和resuspendedμL染色溶液(膜联蛋白V-FITC和π消息灵通的缓冲区)。细胞培养在黑暗中在室温下15分钟,随后的400年μL具有约束力的缓冲区。凋亡细胞的比例建立了流式细胞仪使用流式细胞仪Accuri C6流(BD eBiosciences)。
2.4。细胞因子分析
15 d-pgj的效果2以TPC-1细胞分泌细胞因子是评价IMDM介质从0到24小时37°C和5%股份有限公司2。这个实验使用24-well板块进行了一式三份(1×104细胞/)。细胞悬浊液和15 d-pgj补充2在9.3μ每口井。细胞因子在文化由BD仪分析了上层清液珠阵列(CBA)人类Th1 / Th2 / Th17。这种方法使用珠子与不同的荧光强度与cytokine-specific捕获抗体。测量进行了使用流式细胞分析仪的FL2和FL3频道Accuri C6流(BD eBiosciences)。使用一个特定的探测包il - 6根据制造商的协议(BD eBioscience)。分析输出得到表格和图表的形式使用FCAP数组™3.0版本软件(BD eBioscience)。
2.5。信使rna表达分析
实时定量PCR (RT-qPCR)化验使用应用生物系统公司7500序列进行检测系统(美国应用生物系统公司,加州)和SYBR预混料交货Taq II(豆类、志贺、日本)以下反应条件:40周期的PCR (95°C 1分钟15秒和60°C)在最初变性1分钟(95°C)。用于扩增的引物如下:SOCS3,向前:TCACCGAAAACACAGGTTCCA和反向:GAGTATGTGGCTTTCCTATGCTGG;β肌动蛋白,向前:CTACAATGAGCTGCGTGTGGC和反向:CAGGTCCAGACGCAGGATGGC。管家基因的扩增β肌动蛋白是作为内部控制规范化SOCS3 mRNA水平。RT-qPCR数据提出了周期阈值水平,并对相应的规范化β肌动蛋白控制周期阈值。使用2相对基因表达进行了计算−ΔΔCT方法,如前面描述的(18]。
2.6。统计分析
数据分析在GraphPad棱镜(v.6.0c)软件来比较不同治疗方法的效果。双向方差分析和Bonferroni事后测试是用来分析数据。
3所示。结果
3.1。在体外15 d-pgj效果2TPC-1 FG11细胞增殖和生存能力
15 d-pgj2减少细胞增殖(数字1(一)和1 (b)10)和细胞浓度的可行性μM和20μM(图1 (c))。这些发现被用来计算IC50,成立于9.3μM(图1 (d))。这个浓度是用于后续实验。15 d-pgj2没有显示显著的影响在剂量不同纤维母细胞增殖和生存能力从5到15μM(图2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。15 d-pgj凋亡的影响2在甲状腺癌的细胞
膜联蛋白V TPC-1细胞凋亡测定显示,47%的细胞治疗15 d-pgj2(9.3μ米)进入细胞凋亡,而小于5%为对照组(图中观察到3)。
3.3。相对白介素TPC-1 mRNA表达和释放il - 6
结果表明,il - 6与15 d-pgj TPC-1和治疗中高度表达2相对降低il - 6 mRNA表达(图4小时后4(一))。同时,释放il - 6在细胞培养基增加率比对照组要低得多,从而展示15 d-pgj downmodulation效应2由TPC-1细胞对il - 6分泌治疗(图后只要两个小时4 (b))。
(一)
(b)
3.4。SOCS3的相对表达,SOCS1, STAT3
Upregulation TPC-1 SOCS1和SOCS3发生,而早期的治疗15 d-pgj2(数据5(一个)和5 (b))。之间的显著差异控制和治疗细胞治疗后观察两个小时,SOCS3显示相对mRNA表达提高四倍。这种效果并不持久,治疗后4小时的表达SOCS1 SOCS3规范化。STAT3表达下调4小时后治疗和保持在24小时(图的分析5 (c))。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
最重要的不利方面在目前的手术方法治疗乳头状甲状腺癌的风险长期复发和转移性疾病管理的困难,尤其是在那些情况下最初被视为低风险(19,20.]。在最近的过去,一直尽最大努力定义新的分子疗法加强当前的有效性和15 d-pgj抑制细胞生长的药物2最近成为一个强有力的抗肿瘤的分子(21]。
几项研究已经表明,尽管15 d-pgj2是一种内源性配体的PPAR -γ,它的大部分是PPAR -抗肿瘤的效果γ独立(22,23]。PPAR -的影响γ配体也可能由独立的行动机制,因为它们之间广泛癌类型不同,因此必须单独检查。
本研究调查了15 d-pgj外生的角色2在乳头状甲状腺癌的细胞,TPC-1细胞系。药物剂量的细胞生存能力降低10到20μM(图1 (c))。细胞生存能力在文化中发现了类似的结果与其他细胞系的乳腺癌,肺癌、淋巴瘤(24,25),和结直肠26,27),卵巢22,胃21),胰腺(28),和前列腺癌29日]。
尽管整个antitumoral 15 d-pgj的效果2大多数研究报道,剂量和时间响应,较低剂量通常促进反对影响细胞毒性剂量(23]。微摩尔的剂量的15 d-pgj2需要诱发淋巴瘤细胞死亡(30.,31日),而生理浓度的代谢物picomolar摩尔(的范围23,32]。它也被报道,高剂量的15 d-pgj2(≥5μmol / L)导致培养的神经元细胞毒性,而低浓度的受体激动剂(15 d-pgj2≤1μmol / L)抑制大鼠和人类神经元细胞凋亡和坏死引起的H2O2治疗(32]。
生产白介素和肿瘤恶化信号是先决条件33]。事实上,il - 6的生产过剩是常见的在多种肿瘤细胞和血清il - 6水平升高与较差的预后结果在癌症患者34- - - - - -36]。il - 6所示是一个自分泌肿瘤细胞系的增殖因素(37- - - - - -39]。此外,STAT3被报道中近40%的乳房癌,在某种程度上,自分泌il - 6的表达(40]。反过来,旁分泌il - 6可以诱导细胞自分泌il - 6表达在肿瘤微环境,从而建立il - 6+利基和增强肿瘤恶化[35]。15 d-pgj TPC-1细胞治疗2在当前的研究中已经证明降低il - 6表达和释放与减少细胞增殖有关,因此确凿IL-6-linked上述机制在甲状腺癌细胞肿瘤进展。最近的研究证实15 d-pgj的抑制作用2在il - 6表达在体外(41),在活的有机体内(42]。
不同于正常细胞,这使磷酸化统计在严格的控制下,STAT3不断磷酸化在一些肿瘤疾病通过受体激动剂的生产过剩,如特定的细胞因子,即细胞因子il - 6,各自的受体(40]。这个周期可以通过拮抗负监管机构,进一步提高soc和酪氨酸磷酸酶等(43]。
STAT3一直报道发挥重要作用在维护癌症干细胞在体外和在活的有机体内,暗示不可或缺的STAT3参与肿瘤起始,发展和维护(4]。事实上,这种信号途径在肿瘤发生具有重要意义,针对STAT3在肿瘤骨髓疾病几乎中断转移的进展(44- - - - - -47]。累积证据指向一个明确的15 d-pgj STAT3-inhibitory效应2在炎性疾病10,48,49]。然而,我们的研究结果显示一个小和稳定的减少相对STAT3的表达在甲状腺癌细胞治疗15 d-pgj2(图5 (c)),但不显著。STAT3磷酸化可能被15 d-pgj阻止2通过upregulation SOCS3,导致抑制STAT3激活,如图所示(其他地方50]。
Upregulation SOCS3和SOCS1 il - 6表达的差别也紧随其后的是对这些相关TPC-1细胞暴露于15 d-pgj2。SOCS3诱导内源性STAT3的消极监管机构,和建议作为一个肿瘤抑制基因51]。SOCS1和SOCS3的负面调制是一种生存的策略在大多数肿瘤细胞(52- - - - - -54]。相反,过度的细胞因子抑制剂可能表明一种抗增殖反应。事实上,我们的研究结果表明,15 d-pgj2增加SOCS3 TPC-1细胞接触药物的两个小时内,从而支持antioncogenic这个基因(图的性质5 (b))。有趣的是,细胞水平提出了减少SOCS3 SOCS1六小时后治疗,该治疗后24小时(数字5(一个)和5 (b)),可能是因为15 d-pgj2已经开车细胞凋亡(图3)。
il - 6的差别有关对这些由SOCS3过度,早在两个小时后15 d-pgj接触2,考虑到不利影响和行为有关的il - 6与肿瘤的生长、进展和复发55- - - - - -57),15 d-pgj2提出了一种新型抗肿瘤药。
我们的数据表明,细胞凋亡检测在近50%的15 d-pgj TPC-1细胞治疗2,而对照组的5%。我们还表明,SOCS3超表达是细胞治疗的早期事件,而STAT3在24小时内保持稳定。众所周知,STAT3的激活癌症导致基因表达促进细胞增殖、抗凋亡[58),但15 d-pgj2全身SOCS3过度可能阻止STAT3磷酸化(50]。尽管为时过早,而且15 d-pgj的效果2SOCS3,其表达upregulation(图5(一个))可能是足够高的调解细胞内凋亡信号(59]。
5。结论
目前的研究显示重要的抗增殖和凋亡在人类活动引起的甲状腺癌细胞15 d-pgj2。这些事件与SOCS3的过度表达,抑制il - 6信号,在许多癌症的一个关键因素。这是第一个报告d-pgj 15日2全身SOCS3表达式,它依据一种新的治疗选择的治疗甲状腺癌和其他癌症依赖il - 6信号。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
卡洛斯·安东尼奥Trindade-da-Silva和费尔南德斯卡里斯同样导致了这项工作。