Bexarotene作为PPAR的识别拮抗剂与HDX

文摘

类维生素a x受体(rxr)药理Bexarotene的目标,一个抗肿瘤药表示治疗皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。rxr形式与几个形成核受体(NRs),包括过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγγ通过合作招聘),调节目标基因表达的转录机器。这里我们应用/氢氘交换(HDX)质谱特征的影响Bexarotene构象可塑性的完整RXRα:PPARγ异质二聚体。有趣的是,除了Bexarotene PPARγ在缺乏RXRα诱导保护溶剂交换,建议直接受体结合。这个使用竞争结合试验观察确认。此外,Bexarotene PPAR运作γ拮抗剂能改变罗格列酮诱导transactivation基于细胞启动子:记者transactivation化验。在一起这些结果强调复杂的亲脂性的NR polypharmacology靶向小分子和效用的HDX识别和描述这些交互。

1。介绍

类维生素a的x受体(,,)形式与一个子类形成核受体(NRs),包括PPARs LXRs, FXRs, PXRs, rar,车,TR, VDR协同调节基因表达(1,2]。这些可分为形成宽容,受体激动剂对异质二聚体合作伙伴可以激活基因表达,或独自RXR受体激动剂的非许可的转录活动没有影响但可以与合作伙伴协同诱导hyperactivation受体激动剂(3,4]。结构决定因素描述宽容和非许可的RXR形成重要的研究的重点,随着heterodimer-selective类维生素a可能治疗代谢性疾病的潜在治疗(5]。

过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγγ)是一个宽容RXR异质二聚体合作伙伴(6)的药理目标thiazolidinedione (TZD)类胰岛素增敏剂,包括罗格列酮(7]。RXR目标类维生素a也被证明作为药物胰岛素增敏剂在动物模型中(8),通过什么似乎是守恒的和独特的机制(9,10]。同时显示使用噻唑烷二酮类药物增加体重和脂肪量在啮齿动物和人类(和也许食物摄入量在啮齿动物),类维生素a,部分由中枢神经系统,减少食品消费和减少体重和脂肪量的啮齿动物11,12]。有趣的是,类似的表型与药理PPAR报道γ镇压在中枢神经系统13]。

Bexarotene (Targretin,以前LGD1069)是第三代类维生素a抗肿瘤药,强有力地激活rxr (14)和批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL) [15]。Bexarotene强有力地在多功能间充质基质细胞激活脂肪细胞的分化,但相对于PPAR 20%最大功效γ受体激动剂罗格列酮(16]。描述RXR Bexarotene绑定的影响α的构象可塑性宽容coreceptor PPARγ,我们应用hydrogen-deuterium交易所(HDX)加上质谱分析完整的异质二聚体。这些研究表明,Bexarotene PPAR直接结合γ在功能上相关的浓度。进一步的研究表明,PPAR Bexarotene功能γ拮抗剂。这里给出的结果突出的复杂polypharmacology亲脂性的小分子的核受体和效用目标HDX描述这些交互。

2。材料和方法

2.1。HDX-MS

液相酰胺HDX实验进行了使用一个完全自动化的系统如前所述[17]。的PPARγ和RXRα小黑裙是表达和纯化之前报道(18]。10μ米的PPARγ和RXRα小黑裙KPO蛋白质(20毫米₄pH值7.4,50 mM氯化钾)与1:preincubated 2摩尔过剩的化合物或DMSO控制。5μ20 L的蛋白质的解决方案是混合μL D₂KPO O-containing HDX缓冲区(20毫米₄pH值7.4,50 mM氯化钾在4°C)和孵化10年代,30年代,60年代,900年代和3600年代。交易所的转移后,多余的前进或后退交换最小化,蛋白质变性通过稀释25μL淬火解决方案(0.1% v / v组织在3 M尿素)。样本然后通过一个固定胃蛋白酶在200列μL敏⁻¹(0.1% v / v组织、15°C)和生成的肽被困在一个C₈陷阱列(海波西尔金、热科学、CA)。结合肽被gradient-eluted CH (5 - 50%₃CN w / w / v v和0.3%甲酸)在2毫米×50 mm C₁₈高效液相色谱柱(海波西尔金、热科学、CA) 5分钟在4°C。筛选了肽被直接电喷雾电离耦合进行了高分辨率Orbitrap QExactive质谱仪(热科学、CA)。每个HDX实验进行了一式三份和强度加权平均m / z每个肽同位素值(重心)包络计算与内部HDX工作台软件(19]。

2.2。PPARγ结合试验

PPARγ竞争结合试验(英杰公司)是根据制造商的协议执行。5 nM谷胱甘肽的混合物转移酶与人类PPAR融合γ配体结合域(GST-PPARγ精神的小黑裙),5 nM Tb-GST-antibody 5 nM Fluormone Pan-PPAR绿色,和系列稀释的化合物10点开始μM向下了威尔斯的黑色384孔容量板块(格林尼)18的总量μl .所有稀释在TR-FRET PPAR分析缓冲区。DMSO最终浓度2%被用作no-ligand控制。实验进行了一式三份和孵化2 h在黑暗中在分析珀金埃尔默ViewLux超高温超导微型板块读者。担心信号被激发在340 nm和测量发射荧光素在520 nm和490 nm铽。褶皱的变化在DMSO溶液被520海里/ 490海里比率计算。图形绘制在GraphPad棱镜(拉霍亚,CA)复合烦恼的褶皱变化信号DMSO-only控制和电子商务₅₀计算。

2.3。基于细胞Transactivation化验

HEK293T细胞(写明ATCC;猫# crl - 3216)在批cotransfected通过添加4.5μg人类PPARγ2-Gal4, 4.5μg UAS-luciferase记者和27μ采用无血清L X-treme 9基因转染试剂Opti-mem降低血清媒体(Gibco)。18小时孵化后37°C公司5%₂孵化器,转染细胞在白色的384孔板镀一式四份(珀金埃尔默)10000细胞的密度。金属焊补后,细胞治疗只DMSO溶液或表示化合物在增加剂量从下午2点到10μm . 18小时孵化后,细胞治疗开发闪亮Lite +(珀金埃尔默)和384年读发光珀金埃尔默设想Multilabel板读者。图是绘制褶皱处理细胞DMSO-treated控制细胞的变化。

3所示。结果

描述RXR配体结合的变构效应α构象PPAR的可塑性γ、微分HDX应用研究完整的复杂(图1(一))。添加整个RXR Bexarotene导致显著的保护α配体结合域(数字1 (b)和1 (c)),符合高亲和力受体结合(20.]。相比之下,PPAR的几个地区γ小黑裙证明增加交换包括一个地区的二聚体界面(图1 (d))。这些数据表明,Bexarotene变构改变构象PPAR的动力学γ在绑定到RXR coreceptorα。

确认的更改在PPAR HDX动力学观察γ确实是变构,HDX PPAR的分析γ孤独的存在和缺乏Bexarotene。令人惊讶的是,除了Bexarotene PPARγ仅改变氘交换动力学相似的观察分析直接绑定PPAR的配体γ,包括类似的保护在螺旋3(数据交换2(一个)和2 (b))[21]。值得注意的是,Bexarotene没有影响螺旋12氘(图合并2 (c)),镜像SR1664 HDX概要文件,一个已知的PPARγ拮抗剂(18]。确认直接绑定Bexarotene PPARγ,TR-FRET竞争位移分析进行展示μM(图3(一个))。cotransfection子:执行报告基因分析,结果显示,Bexarotene无法transactivate记者基因(图3 (b))。然而,在竞争分析,Bexarotene改变了罗格列酮介导的报告基因transactivation(图3 (c)),确认它直接向PPAR绑定γ和功能作为拮抗剂。

4所示。讨论

再利用药品出现的策略应对挑战和费用获得监管部门批准的新药(22,23]。在个性化的癌症治疗药物再利用尤为常见,在肿瘤筛查异常途径合理干预和适当的治疗。扩大的一个重要恭维已经批准的药物是描述复杂polypharmacology和药物interactomes。核受体药理学的努力到目前为止,主要集中在亚型选择性的优惠同种型目标(24,25]。虽然这仍然是一个重要的考虑因素,它已成为明显的polypharmacology NR针对性的亲脂性的小分子跨越整个总科和超越26,27]。这将是一个重要的考虑与新兴重点描述密切相关的配体来提高治疗指数使用路径分析,特别是在扩大的复杂性现在感激核受体信号(28]。同时筛选激酶板已成为必要的小说发展的抑制剂(29日),这已经成为常规核受体药理学尽管配体结合域的同源性和冗余在内源性配体(30.,31日]。HDX完全审问在体外pharmacomic交互随着自动化平台和数据处理软件兼容的筛查吞吐量(32]。

Bexarotene CTCL的被批准治疗,像大多数化疗一样,一直在追究功效其他癌症类型(33]。Bexarotene也被报道减少淀粉样斑块,改善心理功能在APP / PS1阿尔茨海默病小鼠模型(34),临床试验正在进行,以确定这将翻译的人。这里我们展示了非目标绑定Bexarotene PPARγ还一个目标,出现了用于治疗阿尔茨海默病(35]。interactome这些有前途的再利用的系统分析在识别真正的候选人将重要的作用机制以及不相干的不利影响最小化。例如,日常的亲和力Bexarotene PPARγ可能导致的报道insulin-sensitizing疗效类维生素a通过调制受体转译后的修改(28]。

5。结论

这里我们有应用HDX识别非目标绑定Bexarotene PPARγ,证实了这一竞争结合试验。Bexarotene充当PPARγ基于细胞启动子的对手:记者transactivation试验,与罗格列酮竞争,HDX概要文件与其他已知的PPAR一致γ拮抗剂。Bexarotene来调节PPAR的能力γ可能导致胰岛素抵抗的动物模型中观察到的有利影响和阿尔茨海默氏症。在一起这些结果突出的复杂polypharmacology NR配体,HDX描述这些交互的工具,描述配体在NR总科的重要性。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

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