冠状动脉搭桥术后冠状动脉疾病患者心衰发展过程中PPAR γ的表达水平

摘要

遗传学研究阐明了心力衰竭(HF)的分子机制。过氧化物酶体增殖物激活受体(ppar)似乎在HF的病因学中很重要。研究的目的是找出PPAR之间的相关性冠状动脉搭桥术(CABG)后冠状动脉疾病(CAD)患者心衰发展过程中的表达。方法和结果．我们随访了157例冠心病患者(平均年龄63岁)，这些患者没有心衰的临床、实验室或回声参数，接受了冠脉搭桥。在冠状动脉搭桥手术前以及第1、12和24个月时评估临床和实验室状况。在冠脉搭桥过程中，采集主动脉(Ao)和左室切片进行遗传学研究。HF定义为LVEF <40%或NT-proBNP >400 pg/mL或6MWT <400 m。将患者分为有心衰和无心衰两组。PPAR在2年随访时，两组Ao和LV的表达均未增加。PPAR的敏感性Ao在1.1075以上的HF检测中表达量为20.5% (AUC 0.531, 95% CI 0.442-0.619)。阳性预测值(Ppv)为85.7%。PPAR的敏感性和特异性HF检出时左室表达分别为58%和92.9% (AUC 0.540, 95% CI 0.452-0.626)。Ppv为73.2%。结论．PPARAo和LV的表达具有可比性，不应作为冠脉搭桥后冠心病患者发生心衰的预测因素。

1.介绍

根据欧洲心脏病学会(European Society of Cardiology, ESC)的定义，心力衰竭(heart failure, HF)是一种临床综合征，患者应具有以下特点:心衰的典型症状，如呼吸困难或疲劳，液体潴留的迹象，如肺充血或外周水肿，以及静息时心脏结构或功能异常的客观证据[1］．据估计，心力衰竭的总患病率在欧洲人口的2 - 3%之间，近年来一直在稳步上升。有许多情况可能导致HF。冠状动脉疾病(CAD)是迄今为止最常见的原因，是几乎70%心衰患者的初始诱发条件[2，3.］．糖尿病、高血压、高胆固醇和吸烟是冠心病的危险因素。根据PubMed的数据，13-20%的患者在冠状动脉搭桥术后发生心衰。老年、女性、糖尿病和慢性肾功能不全是冠脉搭桥术后心衰的主要危险因素[4- - - - - -8］．最近的遗传学研究试图阐明病因和心脏重塑的分子机制，并开发新的治疗策略的心力衰竭。在HF的病因学中，一类被认为重要的分子是过氧化物酶体增殖物激活受体(ppar)。这些是属于核激素受体超家族的配体激活转录因子。PPAR超家族由三个成员组成:PPARα、PPARβ, PPARγ．最后一种是研究最广泛的PPAR，主要有两种亚型:PPARγ1和PPARγ2，而至少其他两个，PPARγ3和PPARγ4，也在包括人类在内的多个物种中被发现。结果表明，PPAR具有不同的组织表达。有趣的是,PPARγ不仅在脂肪组织中表达，也在不同来源的组织中表达，如冠状动脉、主动脉和左心室[9］．PPAR受体活性的调节对葡萄糖和脂肪酸代谢紊乱的治疗很有意义。PPARγ激动剂是糖尿病患者常用的控制血糖的口服药物[10］．考虑到炎症和葡萄糖代谢紊乱(甚至那些未被认为是糖尿病的)都是HF发展的危险因素，ppar的活动可能协调病理变化并影响HF的发展的观点得到了支持[11］．

研究的目的是找出PPAR之间的相关性γ冠状动脉搭桥术(CABG)后冠状动脉疾病(CAD)患者心衰发展过程中的表达

2.方法

我们招募并随访了接受冠脉搭桥手术的多血管CAD患者，这些患者没有临床、实验室和超声心动图的心衰参数。排除有糖尿病、既往心力衰竭和瓣膜疾病的患者。在手术干预期间，主动脉和左心室的小切片被收集并保存在“稍后RNA”(Qiagen)溶液中，直到进一步的分子分析。

术前、术后1个月、12个月和24个月评估临床状态和实验室检测。根据这些结果，患者被分为两组:在随访期间发生心衰的组和没有发生心衰的组。诊断HF的标准为超声心动图评价的左心室射血分数<40%或NT-proBNP >400 pg/mL或6分钟步行试验<400 m。没有一个患者在手术前符合这些标准1)．

调查符合《赫尔辛基宣言》所概述的原则。患者的知情同意和研究方案由当地伦理委员会批准。

2．1．RNA隔离

手术后立即将组织碎片置于“稍后RNA”(Qiagen)溶液中并保存，直到RNA分离。由于RNA分离过程的方法困难(组织小片段)，采用RecoverAll总核酸分离试剂盒(Ambion)进行分离。该试剂盒允许忽略均质阶段，在此期间有显著的组织材料损失。为了去除残留的基因组DNA，对标本进行了DNA酶处理。根据组织的初始数量，获得的RNA浓度从几十毫微克到几百毫微克不等。A260/A280的纯度介于1.8 ~ 2.1之间。用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)合成cDNA。为验证cDNA合成的正确性，本研究采用引物GAPDH基因。由于RNA数量少，表达水平低(平均水平)ct值30)，增加输出基质，使用预扩增试剂盒TaqMan PreAmp Master Mix (Applied Biosystems)。PPARγ测定mRNA表达水平7500快Real-Time PCR System (Applied Biosystems)，采用TaqMan方法。对每个基因进行3个重复的qPCRμL反应混合物中含有10μTaqMan基因表达主混合材料(应用生物系统)，1μ每个引物和探针组的L, 4μL去离子水，5μL的稀释预扩增cDNA。热循环条件包括在95°C初始变性步骤10分钟，以及在95°C 15 s和60°C 1分钟的40个循环。为了避免由于不同数量的模板、质量和qPCR抑制剂的存在而导致的定量误差，我们使用了三个内参基因GAPDH、TBP和HPRT，并使用这些基因的几何平均进行归一化。所有引物和分子探针均来自Applied Biosystems，确保了相同水平的扩增效率，并省略了DNA残留扩增。PPAR的表达水平γ在一组126例患者中，由于从其余31例患者中分离出的材料质量太低，无法对两种组织样本进行比较分析，因此确定了主动脉和左心室的组织。

2．2.统计数据

定量变量以均数±标准差表示，定性变量以研究组百分比表示。采用卡方检验和单因素方差分析比较两组(基线时有和无心衰组)的具体参数和随访期间参数值的变化。PPAR之间的相关性γ用Pearson和Spearman相关系数评估表达和其他参数。所有患者按PPAR分为2组γ表达式值(高于或低于75%)。建立ROC曲线以确定PPAR的截断点γ描述冠脉搭桥后发生心衰的患者。的值被认为具有统计学意义。使用Statistica 10.0PL软件进行分析。

3.结果

3．1.患者基线特征见表2

评估PPAR的表达水平γ使患者更容易发生HF，生成ROC曲线，并建立参数的敏感性和特异性。PPAR的表达水平γ在预测心衰发生方面效果不佳(AUC 0.531, 95% CI 0.442-0.619;)．在1.1075以上水平，检测HF的敏感性为20.5%，计算阳性预测值为85.7%。PPAR表达水平γ左心室检测心力衰竭的敏感性为58%，特异性为92.9% (AUC 0.540, 95% CI 0.452-0.626;)．建立的阳性预测值为73.2%(图)1和2)．

所有患者被分为两组:心衰患者和非心衰患者。表中显示了心衰和非心衰患者重要临床参数的时间变化1．在两组中，我们分析了PPAR的4分位内患者的频率γ与其他四分位数相比，但无显著差异()(图3.)．

３．２．研究的局限性

有一些研究局限性。首先，15例患者撤回知情同意书，另有41例患者未返回进行随访评估。第二，由于伦理问题，我们无法在2年随访中采集组织样本。这些额外的数据可以确定PPAR表达水平的长期变化γ为了解心衰的发病机制提供有价值的信息。

4.讨论

PPAR的作用γHF的发展是复杂而有争议的。尽管已有大量研究，但对其在人类HF发展中的作用仍知之甚少。大多数研究都是在动物或体内模型上进行的。最近的临床研究提出了PPAR的作用问题γ合成配体(噻唑烷二酮，前列腺素)在心血管系统。这些合成因子可能干扰和影响PPAR的表达γ．一方面是PPARγ激动剂可减少人类患者和动物模型的动脉粥样硬化[12- - - - - -15］．大量的临床前研究表明，PPAR除了对动脉粥样硬化发生有影响外，还能促进动脉粥样硬化的发生γ配体也影响CAD和HF的发展。长时间缺血导致心肌细胞死亡，随后存活心肌发生一系列结构和功能改变，称为心脏重塑。细胞外基质和心肌细胞生物学发生适应性变化，最初能够维持收缩功能。然而，进行性心脏重塑会导致心室扩张、收缩功能障碍，最终导致心力衰竭[16］．PPAR的人类遗传学研究γ已经揭示了该核受体的功能改变与CAD有关。此外,PPARγ配体可减少新生儿心肌细胞因机械应变引起的肥厚[17］．另一方面，有临床证据表明，噻唑啉二酮(TZDs)治疗的2型糖尿病患者心衰发生率增加[18]和大鼠心肌梗死后死亡率[19］．

Son等发现PPAR水平升高γ在转基因小鼠中表达脂肪毒性增加，导致左心室肥大和功能障碍[20.］．在PPAR低表达的转基因小鼠中未见此类异常γ．Chintalgattu等人在他们对心脏成纤维细胞的研究中证明了PPARγ血管内皮生长因子(VEGF)在缺血心肌中起重要作用。这些发现表明PPARγ激动剂可能对心脏重塑有积极影响[21］．还有其他临床证据表明PPARγ激动剂改善左心室收缩和舒张功能[22，23］．

大多数证据表明，PPAR具有重要作用γHF的发展来自于动物模型的研究。相比之下，我们进行了一项有157名患者参与的大型前瞻性研究。我们已经证实，28例(17%)患者在两年内发展为心衰。动脉粥样硬化的进展导致急性缺血性发作(71%)和心房颤动(29%)，是HF的主要原因。为了进一步的遗传学检查，在冠脉搭桥过程中直接从主动脉和左心室获取组织样本。我们证实了PPAR的表达γ主动脉和左心室都有但是，我们并没有证实之前的研究结果，即PPAR表达水平升高γ在左心室和人类供体心脏主动脉中年龄相关受体的表达[24］．这可能是因为之前的研究中患者人数较少(5例)。令人惊讶的是，我们的结果没有显示PPAR的表达水平增加γ在两年的随访中，无论是发生HF的组还是没有发生HF的组(平均±1.065，平均±1.054 vs平均±1.054，平均±1.076)。

在PPAR的表达水平γ在1.1075以上的主动脉中，检测HF的敏感性大于20.5%，计算阳性预测值为85.7%。PPAR表达水平γ左心室检测心衰的敏感性为58%，特异性为92.9%。确定的阳性预测值为73.2%。这些值使PPAR的分析不合格γ组织表达作为预后因素。鉴于与之前发表的实验数据存在显著差异，这项研究首次提供了如此广泛的证据，证明PPAR在人类中的作用γ组织中的表达不能预测心衰的发展。

5.结论

我们的发现暗示了PPARγ主动脉和左室的表达具有可比性，不应作为冠状动脉搭桥治疗冠心病患者发生心衰的预测因素。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

承认

这项研究得到了波兰华沙科学和高等教育部的研究基金N N 402 177934的支持。

参考文献

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