文摘

抑制内皮一氧化氮合酶(以挪士)加速动脉粥样硬化ApoE-null老鼠通过损害血管紧张素ⅱ(暗)和不平衡。我们之前的数据表明PPAR的角色α在肾素-血管紧张素系统(RAS)的有害影响。我们测试了ApoE-null老鼠缺乏PPAR的假设α(DKO老鼠)将抗proatherogenic抑制NOS的影响。DKO西方饮食的老鼠免疫23%恶化在主动脉窦斑块面积的ApoE-null动物在12周的NOS抑制L-NAME subpressor剂量,。这是伴随着一倍的活性氧(ROS)生成主动脉NADPH氧化酶活性(暗目标,平行Nox1表达式)和10倍超过proatherogenic进气阀打开,。L-NAME还导致一倍的主动脉肾素和血管紧张素mRNA水平ApoE-null DKO老鼠但不是,它调节以挪士DKO只老鼠。这些数据表明,PPAR ApoE-null鼠标α有助于proatherogenic效应无对手的RAS / L-NAME引起的行动,影响与Nox1和伊诺感应,并独立于血压和血清脂质。

1。介绍

表示在所有血管壁的细胞成分,和现在在动脉粥样硬化斑块,过氧物酶体的精确作用proliferator-activatedα受体(PPARα)在动脉粥样化形成仍是有争议的。已知对脂蛋白代谢的影响,主要来自动物实验的替代终点,帮助形状,其激活授予保护动脉粥样硬化(审查1])。大型临床试验旨在评估一类的潜在减少心血管端点,然而,达到不同的结果,这表明益处可能限制子集定义的主题与脂蛋白异常(2- - - - - -4]。我们以前报道,缺乏PPAR ApoE-null老鼠α饮食诱发动脉粥样硬化情况下抵抗,尽管表现出缺乏PPAR的血脂预期恶化吗α。此外,双基因敲除小鼠也有点降低血压(5]。尽管本身无法解释动脉粥样硬化的保护作用,减少,这表明PPARα可能会影响系统的中央动脉粥样化形成和血压调节。在这方面,一个自然的候选人是肾素-血管紧张素系统(RAS)。我们随后显示,PPAR的消融α完全废除了高血压和大大减少食源性筑波高血压鼠动脉粥样硬化,血管紧张素ⅱ的模型(暗)介导的高血压和动脉粥样硬化由于转基因人类肾素和血管紧张肽原基因的表达。在这个模型中,缺乏PPARα明显下降的水平循环kidney-derived人类肾素(RAS)的病原反应步骤,而且人类肾素的分泌在中通过主动脉平滑肌细胞主要文化形式建立这些老鼠,表明一些血管保护组织RAS的差别可能源于对这些血管壁(6]。

之间的一种微妙的平衡还和一氧化氮(NO)在血管健康已经被认可7]。提升血压,减少了一代没有,增加活性氧簇(ROS)的生产主要通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶,从而促进炎症和动脉粥样硬化。相比之下,endothelium-derived没有降低血压,减少活性氧的积累,抑制炎症反应,最终限制了动脉粥样硬化。因此任何事件可能淡化这种平衡所没有的一面促进动脉粥样硬化的潜力。事实上,它已经表明,没有合酶(NOS)的基因或药物消融加速动脉粥样硬化在ApoE-null鼠标8,9]。

我们假设PPARα似乎需要完整的RAS的有害影响,双载脂蛋白e / PPARα击倒(DKO)鼠标应该抵抗动脉粥样硬化引起的慢性的恶化抑制内皮NOS(以挪士)活动subpressor剂量的N_ω-nitro-L-arginine甲酯盐酸盐(L-NAME)。在当前报告我们显示是这样的情况,我们也点两个PPAR的罪魁祸首α端依赖proatherogenic以挪士抑制效应,即Nox1和进气阀打开。

2。方法

2.1。动物和研究设计

ApoE-null老鼠保持电话Aviv-Sourasky医学中心与PPAR杂交动物设施α零老鼠;线都在广泛的回交后C57Bl / 6遗传背景。确定的基因(http://jaxmice.jax.org/pub-gi/protocols/protocols.sh?objtype=protocol&protocol_id=221),F2双重转基因创始人被用来创建DKO线。在这些实验ApoE-null和DKO老鼠使用相同的协议。

4周时,动物被给予subpressor剂量的一半L-NAME (5 mg / L), NOS抑制剂,在饮用水(Sigma-Aldrich猫N5751)。这个剂量是根据给老鼠,这是显示没有加压的效果,虽然它仍然降低了血浆和尿没有生产(10,11]。有这样4实验小组,每个组成大约20老鼠。8周时的、非侵入性的基础血压得到描述(12),和动物转到西方高脂肪饮食(哈伦Teklad饮食88317年,麦迪逊,WI) 8周。L-NAME政府继续在整个实验过程。

在实验的最后,血压又记录了。4 h后很快,光异氟烷麻醉下,血液样本得到retro-orbital丛的生化决定。动物是牺牲了致命剂量的异氟烷。所有实验协议进行了在获得授权的机构实验室动物实验委员会和符合国家卫生研究院指导实验室动物保健和使用的(13]。

2.2。生化决定和快速蛋白液相色谱(FPLC)脂蛋白的分析

血清生化是评估Advia 1650自动分析器(德国西门子公司(Siemens AG))。此外,各种脂蛋白FPLC分数也进行了分析。这个过程4每个动物组样本,每个样本代表汇集血浆从2小鼠和稀释1:1 v / v的缓冲区,通过0.45第一次过滤μ乳糜微粒过滤器移除。样本被放置在一个superpose-6列(GE淀粉微球)和按大小分开排斥到41分数。VLDL粒子通常是收集管15 - 19之间,管-之间的低密度脂蛋白,高密度脂蛋白管29-37之间。分离后,每个分数的胆固醇浓度测定比色反应(胆固醇试剂,罗氏)微型板块和阅读的ELISA读者(Cobas,罗氏)495海里。

2.3。心脏和主动脉动脉粥样硬化处理和分析

主动脉是snap-frozen RNA隔离和NADPH氧化酶活动的决心。通过心室心被切割;上第三包括主动脉根嵌在10月和冷冻,直到分析。

动脉粥样硬化的评估,10μ米心的低温恒温器部分包括收集主动脉窦的面积和沾Oil-Red-O。量化的斑块进行使用数字图像处理程序(NIS Br元素3.0成像系统)(尼康仪器欧洲帐面价值、荷兰),所述[12]。

2.4。NADPH氧化酶活性评价

NADPH氧化酶活性测定在主动脉内部lucigenin-enhanced chemoluminescent分析如下。主动脉是从相邻脂肪和结缔组织,彻底清洗隔离在冰冷的Krebs-Hepes缓冲区,pH值7.4,snap-frozen液体N₂直到化验在这段时间里,他们被在冰冷的加工制造和保存在冰融化。双眼放大下,主动脉被小心翼翼地清洗所有邻近组织和环切成3 - 5毫米。他们随后孵化37°C prewarmed港口45分钟。每一个环被放置在一个光学板在175年μL加工制造包含新鲜NADPH (Sigma-Aldrich猫。数量N6505)收益率最终反应浓度的100μ25 m .自动注射后的反应开始μL lucigenin (Sigma-Aldrich猫M8010)给的最终浓度5μm .发光测量每5秒1分钟LUMIstar星系光度计(BMG Labtech, Offenburg,德国)。减法后的背景(记录在缺乏组织),每个样本的平均发光的干重量调整的戒指,每个主动脉和平均NADPH氧化酶活动(6 - 8环)表示为相对发光单元·毫克⁻¹·敏⁻¹。在实验条件下,发光是特定NADPH氧化酶的荧光在没有添加底物(NADPH)是微不足道的。

2.5。主动脉基因表达研究

在RNA隔离(试剂盒、表达载体、生命科技,卡尔斯巴德,CA)和逆转录酶合成的cDNA、几个相关基因的表达水平是评估StepOne实时系统(应用生物系统公司,生活技术)。

使用以下TaqMan基因表达分析需求:肾素:MM02342887_MH;血管紧张肽原:AGT-MM00599662_M1;血管紧张素转换酶1:ACE1-MM00802048_M1;血管紧张素ⅱ1型受体:AT1-R-AGTR1a MM00616371_M1;内皮一氧化氮合酶:eNOS-MM00435217_M1;诱导号:iNOS-MM01309897-M1 MM00446968_M1与内源性产生HPRT基因。此外,主动脉表达式单核细胞趋化蛋白1 (MCP1)和NADPH氧化酶基因Nox1 Nox2, Nox4,半定量的评估。主动脉瓣下基因的表达水平是由半定量PCR反应的线性范围,使用beta-actin管家,和下面的正向和反向引物:MCP1: 5′-CATTCACCAGCAAGATCC-3′;5′-CTCATTTGGTTCCGATCCAG-3′;Nox1: 5′-ATATTTTGGAATTGCAGATGAACA-3′;5′-ATATTGAGGAAGAGACGGTAG-3′;Nox2: 5′-CTTGGGTCAGCACTGG-3′;5′-TTCCTGTCCAGTTGTCTTCG-3′;Nox4: 5′-TTGTCTTCTACATGCTGCTG-3′;5′-AGGCACAAAGGTCCGHAAAT-3′;β-肌动蛋白:5′-GACTACCTCATGAAGATCCTG-ACC-3′;5′-TGATCTTCATGGTGCTAGGAGCC-3′。所有用2毫米MgCl反应进行₂最终浓度(除了Nox1要求4毫米),使用Promega GoTaq绿色主人混合(Promega公司麦迪逊,WI)。PCR电泳产品size-separated的ethidium bromide-containing 2%琼脂糖凝胶。乐队荧光强度被捕的202 d能(Dinco,铼,耶路撒冷,以色列)与蒂娜和分析软件(Raytest Straubenhardt,德国)。

2.6。统计分析

数据表示为±SE。组比较,参数方差分析测验后的紧随其后。重复测量方差分析是用于参数获得的基线和实验的最后。当比较4组被认为是不必要的,学生的以及使用。参数之间的相关性建立了使用线性回归或斯皮尔曼等级相关。统计学意义是假定。

3所示。结果

3.1。动物的体重、血压、血清生化和FPLC脂蛋白

故意在subpressor剂量,L-NAME确实不影响动物的血压。所有动物血压正常的基线和高脂肪喂养8周后,独立的治疗,尽管增加了肥胖DKO动物已经检测到基线(表1)。像预期的那样从PPAR的角色α在脂蛋白代谢,胆固醇水平的两倍,和甘油三酯DKO高出3倍的老鼠比ApoE-null老鼠高脂肪喂养后时期。然而,L-NAME增加胆固醇39%和超过50%的甘油三酸酯ApoE-null老鼠,DKO虽然没有任何影响。这种上升基本上把胆固醇等于水平在两行(表1)。FPLC分析其次是胆固醇测定各种分数随后证实,海拔由L-NAME本质上是有限的极低密度脂蛋白(VLDL)。然而,低密度脂蛋白(LDL)胆固醇影响L-NAME仍明显高于DKO(图1)。

3.2。DKO老鼠减少动脉粥样硬化和免疫L-NAME Proatherogenic效应

证实了我们之前的观察(5],DKO控制小鼠动脉粥样硬化在主动脉窦发展低于ApoE-null同行尽管更糟糕的脂蛋白概要文件。事实上,8周后在西方饮食,包含44.1%的窦动脉粥样硬化斑块面积ApoE-null老鼠,然而DKO只有33.8%,23%的差异,(数据2(一个),2 (c),2 (e))。DKO老鼠也免疫与L-NAME proatherogenic阻塞的影响没有一代,随着斑块覆盖34.4%的窦治疗动物(数字2 (d)和2 (e))。相比之下,L-NAME治疗增加了斑块的程度ApoE-null老鼠23%控制相比,覆盖54.3%的窦区(数字2 (b)和2 (e);与控制)相比,从而创建一个斑块面积大于37%,以治疗DKO ()。

3.3。主动脉NADPH氧化酶活动只在ApoE-Null L-NAME引起的小鼠和NOX-1表达式和动脉粥样硬化相关

主ROS生成系统,NADPH氧化酶是一个主要玩家在起始和动脉粥样硬化的发展。我们评估了它的活动在整个主动脉。NADPH氧化酶活动类似于控制、高fat-fed动物两行。然而,没有生成的抑制L-NAME ApoE-null老鼠的活动增加了一倍(与控制),但DKO(图中没有任何影响3(一个))。了解这个系统的相关性被发现,动脉粥样硬化的程度也与NADPH氧化酶活动(的程度,)。

几个亚型的NADPH氧化酶表达在脉管系统,我们质疑形式可能导致活动测量。这是解决部分通过检查Nox1的表达,Nox2, Nox4主动脉。虽然Nox1 mRNA水平控制在ApoE-null老鼠和DKO相似,就像活动水平,L-NAME治疗诱导表达的增加80% Nox1 ApoE-null老鼠,而它倾向于抑制DKO (与控制),仅1/3的测量ApoE-null动物(图3 (b))。尽管Nox2不是增强ApoE-null L-NAME的小鼠,观察在治疗水平DKO主动脉是大约一半的ApoE-null动物()。Nox4表达另一方面是相同的线和不受L-NAME治疗(没有显示)。事实上,之间显著正相关发现NADPH氧化酶活性和Nox1 mRNA的表达水平在主动脉(图3 (c)NADPH氧化酶的)表明这对碘氧基苯甲醚,公认目标,推动活动的增加来衡量在ApoE-null L-NAME下老鼠。

3.4。主动脉血管紧张肽原和肾素诱导L-NAME Apo-E Null老鼠而不是PPAR的缺失α(DKO老鼠)

我们先前报道,衰减的动脉粥样硬化DKO伴随着持续减少主动脉MCP1的表达,在ApoE-null看到老鼠相比,这种效果是依赖于存在和PPAR的激活α。MCP1强有力的促炎趋化因子,是引起暗生,与动脉粥样硬化的发展ApoE-null鼠标(14]。我们因此质疑这是参与观察的微分L-NAME对动脉粥样硬化的影响。作为一个整体,MCP-1表达式是DKO大大减少老鼠,但它不是受到抑制L-NAME-induced NOS的影响。像MCP1,主动脉ACE-1 mRNA的表达相当低的DKO但L-NAME未受影响的行。相比之下,肾素和血管紧张素增加了一倍多的组织表达L-NAME治疗与野生型PPAR ApoE-null老鼠α基因而不是DKO老鼠(表2)。PPAR的缺失α当时与较小的主动脉血管的表达和缺乏主动脉肾素和血管紧张肽原L-NAME感应。总的来说这些变化将有利于生成更多的组织还在ApoE-null所有实验条件下小鼠主动脉。

3.5。主动脉伊诺强劲与动脉粥样硬化有关

相反以挪士,其净效应是供应没有血管舒张,抗血栓形成的,和antiatherogenic目的,进气阀打开,通常不明显活跃于血管壁,引起炎性细胞因子和活性氧。丰富的生产,然后生成导致过氧硝酸盐的形成,增加氧化应激和呈现以挪士失调通过解偶联活动,最终促进炎症和动脉粥样硬化。MCP1的高度表达,诱导ApoE-null老鼠,NADPH氧化酶活性的条件有利于伊诺的感应,我们评估了它的表达式在小鼠主动脉和希望看到更大水平ApoE-null老鼠。控制ApoE-null老鼠伊诺mRNA水平的4倍,在未经处理的DKO老鼠。L-NAME治疗进一步增加伊诺ApoE-null老鼠的2.7倍,而相比之下没有影响伊诺DKO老鼠。这导致了~ 10倍的表达相比,L-NAME-treated ApoE零小鼠主动脉伊诺L-NAME-treated DKO(图4(一))。进一步支持这一观点的病理生理的意义来自于强大的动脉粥样硬化的程度之间的相关性和主动脉伊诺的水平,,(图4 (c))。控制ApoE-null小鼠主动脉以挪士的表达程度高于DKO老鼠;然而,这下未能增加L-NAME治疗,虽然DKO(图增加了两倍多4 (b))。

最后,在一个多元回归分析,其中包括显示的变量相关程度的斑块的单变量分析(MCP-1、NADPH氧化酶活性和伊诺mRNA水平),NADPH氧化酶活性随着伊诺单独预测86%的动脉粥样硬化研究的条件下,。没有其他变量在预测研究有重大影响动脉粥样硬化的程度。值得注意的是,在这个范式,动脉粥样硬化的程度与高脂血症的严重程度无关。

4所示。讨论

突出当前研究的发现是PPAR的缺席α基因可以防止食源性的加重动脉粥样硬化引起的L-NAME ApoE-null鼠标在活的有机体内,独立于血压或血脂变化。这些结果扩展和加强我们之前报道,PPAR的缺失α是动脉粥样硬化的保护由ApoE-null /高脂肪饮食状态(5)以及过度的RAS筑波高血压老鼠(6]。PPAR的缺失α也防止L-NAME-induced动脉粥样硬化的遗传背景ApoE-KO,再度强调这种基因的作用在动脉粥样硬化的发展由几个不同的触发器。

我们的研究的一个重要方面是,我们雇佣了20倍低于报道各种啮齿动物模型的动脉粥样硬化这个代理是在饮用水是在当前的研究中(8]。这些研究提出了关于血压的硬数据;最多,他们指出,治疗没有效果。因此很难排除,加速动脉粥样硬化报道下L-NAME也不是由于不增加血压和剪切应力。相比之下,根据我们的设计,剂量选择L-NAME(大约1.5毫克公斤⁻¹·d⁻¹)导致没有高程血压的压力,虽然没有被证明能够有效降低生产(10,11]。因此,通过防止L-NAME-induced高血压血压和保持相同的整个研究在所有动物群体,我们排除了我们的发现可能是由于高血压和/或剪切应力。

互补排除L-NAME-induced高血压的作用在我们的模型中观察到的血清脂质变化的,这也不能解释的动脉粥样硬化加重L-NAME治疗老鼠。以前曾有报道称,L-NAME提升循环脂质(15- - - - - -17由于甘油三酯合成的增加通过诱导肝phosphatidate phosphohydrolase(甘油三酯合成必不可少的酶)和减少氧化由于肉毒碱抑制palmitoyltransferase我(CPT-1),胆固醇和海拔二次降低胆汁酸合成由于抑制肝脏胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1),后者两个基因被了解PPAR的目标α(18,19]。然而,在目前的研究中,DKO老鼠,正如所料,高循环脂质水平,虽然L-NAME并诱导ApoE-null小鼠血脂水平的增加,它只是把循环脂质在L-NAME-treated DKO老鼠相同的水平。因此,保护从L-NAME-related加速动脉粥样硬化的DKO不能归因于循环脂质,这要求检查其他的可能性。

NADPH氧化酶,主要血管过氧化物ROS发电机,是一个目标。ROS生成的激活导致破裂,最终导致内皮功能障碍,解开以挪士,从而限制没有可用性,然后开始生产更多的超氧化物和活性氮物种。NADPH氧化酶活动水平控制老鼠的两行8周后在西方饮食是相同的。然而,在伴随L-NAME治疗,活动的水平翻了一番DKO ApoE-null老鼠,但几乎没有变化。NADPH氧化酶激活的其他潜在的刺激如高血糖、低密度脂蛋白胆固醇,和剪切应力可以排除考虑到这种差异,可想而知,upregulation NADPH氧化酶在低剂量L-NAME治疗取决于PPAR的存在α并能反映无对手的所有行动。

Nox1、Nox4 Nox2脉管系统的表达。Nox1由内皮细胞在低水平表达,观察上级在血管平滑肌细胞(VSMC)。这是诱导两种细胞类型在文化还20.,21]。此外,最贴切地,基因消融Nox1被证明大大减少食源性ApoE-null小鼠动脉粥样硬化的程度(22]。Nox2和Nox4都觉得是涉及心血管病理。持续活跃,Nox4也调节了,不过最近收到注意保护血管的属性(23]。Nox2与吞噬呼吸爆发活动有关,和内皮细胞的表达。然而研究它在动脉粥样硬化中的作用通过专门去除ApoE-null老鼠没有显示任何好处(24]。我们发现NADPH氧化酶活动带来的L-NAME平行的感应Nox1表明这同种型负责活动我们测量,它取决于PPAR的存在α。进一步,因为NADPH氧化酶是一个既定的目标行动,随之而来的改变几个组件Apoe-null小鼠的主动脉RAS观察是一致的认为这个系统至少一个辅助作用的感应NADPH氧化酶在L-NAME Apoe-null老鼠,虽然这不是手术没有PPAR的机制α。主动脉血管mRNA表达DKO远低于在Apo-E老鼠,有或没有L-NAME治疗。此外,主动脉肾素和血管紧张素mRNA表达诱导的L-NAME ApoE-null老鼠但不是DKO老鼠,没有感应并行的主动脉NADPH氧化酶活动设置。尽管事实上,主动脉MCP1 mRNA表达与动脉粥样硬化的程度显著相关,没有进一步归纳在ApoE-null L-NAME治疗下老鼠。这样的结果是可以预料的,因为这也是一个目标。虽然我们不能对这种差异提供了一个解释,也许不同的结果会出现我们测量蛋白质含量,它是表达显著降低水平DKO是可再生的5),需要强调。

以挪士相比,这是广泛表达于内皮,NOS在正常血管的主要形式,难以觉察的伊诺是在正常血管细胞。已知引起暗生,伊诺产生大量的没有和一起,反应生成过氧硝酸盐。后者进一步氧化低密度脂蛋白和分开以挪士。因此伊诺是觉得粥样硬化过程中发挥核心作用,确实是丰富在动脉粥样硬化斑块25,26]。此外,基因消融伊诺ApoE-null保护小鼠动脉粥样硬化(27]。符合大差异伊诺mRNA表达我们观察到ApoE-null和DKO老鼠之间,放大PPAR的系膜伊诺表达式α受体激动剂据报道(28]。作为以挪士[L-NAME显示一些特异性29日),在目前的研究中使用的低剂量可能是特别有害的因为它抑制内皮没有生产,而伊诺活动不受影响。

综上所述,表达数据的限制完全基于mRNA水平,数据显示,PPAR的存在α是宽容的表达伊诺的主动脉高fat-fed ApoE-null老鼠。这随后的氧化压力增加可能是动脉粥样硬化的程度的差异我们观察ApoE-null和DKO控制动物之间。

总之,研究结果表明,在高fat-fed ApoE-null鼠标,减少endothelial-derived没有释放了PPARα端依赖无对手的prooxidative proatherogenic暗生的影响,由NADPH氧化酶介导都通过其Nox1同种型,并进一步诱导伊诺。我们进一步证明,不仅是PPAR生成α中央在无对手的还的有害作用,而且它的存在可能会驱动更大的主动脉RAS合成活动响应降低NO(图表总结该机制图5)。我们因此提出,在ApoE-null老鼠,PPAR的缺席α减轻了proatherogenic endothelium-derived没有供应减少的效果。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究是由一个批准号从卫生部首席科学家3 _3093 Karen m . Tordjman年轻研究人员的科研补助金从以色列社会的研究和治疗动脉粥样硬化玛雅Ish-Salom。作者希望感谢汉娜Levkovitz女士与FPLC她宝贵的帮助。