文摘
致癌作用有关的损失稳态控制细胞过程受转录电路和表观遗传机制。其中,过氧物酶体的活动proliferator-activated受体(PPARs)和DNA甲基转移酶(DNMTs)是至关重要的和相互交织在一起的。PPARγ是一个细胞命运的关键调节器,营养传感与转录过程,其表达与昼夜节律性振荡。我们的研究的目的是评估PPAR的周期性γ和DNMTs胰腺癌(PC)。我们调查的与时间相关的模式PPARG, DNMT1,DNMT3B表达自己监控mRNA水平存在在不同的时间点BxPC-3 28-hour跨度,CFPAC-1 PANC-1, MIAPaCa-2 PC细胞同步后血清冲击。PPARG和DNMT1PANC-1细胞中表达PPARG表达MIAPaCa-2细胞被24小时内振荡特征,边缘显著的节奏被观察到PPARG, DNMT1,DNMT3B其他细胞系中的表达谱。基因表达的time-qualified概要文件显示不同形状和相位关系在PC细胞系。总之,PPARG和DNMTs表达的特点是不同的time-qualified模式在人类细胞系来源于PC,这异质性可能影响细胞表型和人类疾病的行为。
1。介绍
癌症统计排名胰腺癌在全球malignancy-related死亡的第四大原因(1),发病率和死亡率非常相似,由于早期诊断困难,攻击性升高,和化疗抵抗。糟糕的预后和缺乏有效的治疗负责高杀伤力,所以迫切的需要确定目标治疗预后评估和分子生物标志物。保护机体组织的完整性是至关重要的生存和依赖组织更新,由干细胞有能力应对损伤和修复组织损伤,引起的物理、化学、微生物、诱变剂。转录机制调节细胞过程底层细胞更新,包括增殖、分化、细胞死亡和细胞凋亡。致癌作用依赖于失去稳态机制调节细胞增殖、细胞分化和生存过程。在转录监管机构在其中扮演了一个重要的角色过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs) ligand-activated转录因子属于核激素受体的总科,这被认为是参与营养代谢和能量稳态的规定,在各种病理生理过程,如代谢紊乱、炎症和癌发生(2]。PPARs是至关重要的代谢和营养信号转导的转录反应和包括三个亚型,PPARα,PPARβ/δ,PPARγ,与高度的同源性,但不同的生物活性(3]。PPARα主要是参与脂类代谢,PPAR的功能β/δ不是完全清楚,PPAR吗γ调节细胞命运和分化的决定,以及脂肪形成和脂肪存储(4- - - - - -7]。PPARγ表达式的24小时周期振荡,其生理节奏性是至关重要的喂养/禁食周期之间的串扰,营养传感、代谢途径和转录过程。这个相声的错乱参与癌症发展(8,9]。合成配体的高亲和性,thiazolidinedione,促使PPAR的研究γ信号通路在调节代谢过程和目前正在评估,尽可能利用PPAR治疗工具γprodifferentiative作用在癌症治疗10]。
转录过程监管也通过表观遗传机制,如乙酰化/脱乙酰作用和甲基化/脱甲基作用。DNA甲基转移酶(DNMTs)发挥重要作用在表观遗传机制将甲基DNA,尤其是DNMT1保持甲基化模式在DNA复制,而种能阻碍DNMT3b DNMT3a和主要催化新创甲基化(11- - - - - -13]。PPAR之间的一个有趣的互动γ的差别和DNMTs最近提出的对这些DNA甲基转移酶可以在免疫细胞ligand-dependent PPARγ激活(14]。
我们的研究的目的是评估PPAR的与时间相关的变异模式γ和DNMTs胰腺癌在体外模型由胰腺癌细胞系同步后评估。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和血清的冲击过程
BxPC-3、CFPAC-1 PANC-1,米娅PaCa-2细胞培养在37°C公司5%2大气与10%胎牛血清的DMEM培养基补充(FCS), 100 U /毫升青霉素,100 ng / mL链霉素(生命表达载体技术,意大利米兰),而CFPAC-1和米娅PaCa-2维护RPMI介质(生命表达载体技术,意大利米兰)。通过血清细胞同步得到冲击表现如下:约细胞/ 6井是镀的前一天实验。天的实验中,培养基与serum-rich交换中有50%的边后卫,2小时后这一媒介取代[描述15]。这些细胞被收获超过28小时后在指定时间点血清冲击。
2.2。定量实时聚合酶链反应
总RNA提取BxPC-3、CFPAC-1 PANC-1,和米娅PaCa-2细胞后在指定时间点血清冲击使用RNeasy迷你包(试剂盒S.P.A.意大利米兰),随后消化DNase 50 ng总RNA的互补脱氧核糖核酸合成,和定量实时PCR(存在)进行使用QuantiFast Sybr绿色PCR设备后一步协议。实时rt - pcr,我们使用以下SYBR绿色QuantiTect底漆购买试剂盒:PPARG(QT00029841)人DNMT1(QT00034335)和DNMT3B(QT00032067)。反应是建立在96 - 7700孔板使用实时PCR系统(应用生物系统公司,培育城市,CA),和所有样本化验一式三份。光学数据分析使用默认和可变参数在SDS软件包(版本1.9.1;应用生物系统公司,培育城市,CA)。目标基因的表达水平是规范化使用管家控制基因tata结合蛋白(真沸点,QT00000721)。
2.3。统计分析
基因表达值归一化,为每一个变量对于每个细胞株,第一次点的表达式的值(T0)的样本收集血清后休克减少interassay水平变化。周期性模式进行分析,为每一个时间序列的归一化基因表达值,通过拟合最小二乘线性回归的一个组件(24小时)余弦波形16),使用MATLAB统计软件包(美国马萨诸塞州MathWorks,纳蒂克)。下面的参数估计:“mesor”(波的总体平均水平);“振幅”(,从最佳曲线的最大值和最小值的峰值),和“acrophase”(Ø,在角度,从当地午夜Ø,波的峰值:开头=峰值)。值从为每个安装单cosinor模型统计报告,测试零假设的零振幅(波没有周期性)。此外,一种新的统计方法来比较不同时间限定的进化的基因表达细胞系,通过合适的统计对比从多元周期线性混合模型。特别是,对于每一个比较,两个统计对比评估,测试节奏是否有相同或相反的波形,分别为(17]。周期线性混合模型可以被认为是加入不同cosinor评估模型(包括每一个特定数量的谐波计算)。这部小说对cosinor分析、统计方法使多个生物节律的进化的比较共同代表他们的正弦和余弦级数为多元线性混合模型,考虑到他们的相互依赖关系(内部和interoutcome相关结构),以及随着时间间隔的不平等的措施和基因表达式之间的异质性。此外,任何特定的成对比较的生物节奏可以通过执行适当的统计对比。值< 0.05被认为是统计学意义。使用MATLAB和SAS统计分析进行释放9.1.3 (SAS研究所,卡里,NC)。
3所示。结果
从cosinor分析结果报道在表1和证据明确24小时time-qualified变化的周期性的表达PPARG(),DNMT1(在PANC-1细胞PPARG(在米娅PaCa-2细胞,而其他观察边缘显著的节奏PPARG,DNMT1,和DNMT3B表达谱检测细胞株(图1)。
从多元周期性回归分析结果报道在表2。两两比较表明,在BxPC-3细胞的时间配置文件PPARG和DNMT1显示平面形状,而时间的PPARG和DNMT3B,以及DNMT1和DNMT3B反对。在CFPAC-1细胞的时间配置文件的所有表情PPARG,DNMT1,DNMT3B是不同的(既不相同也不反对)。在PANC-1细胞的时间配置文件PPARG和DNMT1是不同的,时间的PPARG和DNMT3B相反,时间的DNMT1和DNMT3B平面形状。在米娅PaCa-2细胞的时间配置文件的所有表情PPARG,DNMT1,DNMT3B是不同的(既不相同也不反对)(图2)。
4所示。讨论
Nycthemeral变化24小时周期(昼夜,从拉丁语大约在和死)描述行为和生理在大活的有机体的一部分,有助于体内平衡维护确保细胞现象的最佳时机在身体系统中,由一个复杂的转录网络电路(18- - - - - -20.]。昼夜节律性驱动在身体层面由中央起搏器和主振荡器位于下丘脑视交叉上核(SCN)携入的光/暗周期通过retinohypothalamic道(21]。在组织和单细胞水平的昼夜节律性是由分子时钟滴答作响转录/翻译反馈回路由一组基因(所谓的生物钟基因:BMAL1,时钟,每1 - 3,哭1 - 2)及其编码的蛋白质,携入的视交叉上核通过体液和神经输出,和组织的方式,其他因素,如喂养和温度波动(22- - - - - -28]。生物钟控制细胞过程和组织/器官功能驱动基因编码转录因子的表达,比如菲律宾(白蛋白D-site结合蛋白)和E4BP4 (adenoviral E4此种蛋白质),引导所谓的时钟控制基因的表达和组织产出的基因。转录因子和E4BP4以及其他类似的流程控制PPAR的昼夜节律性γ通过绑定PPARG第一外显子D-sites功能启动子活动(9]。
混乱的生物钟电路和生理生理节奏性的改变被认为是参与肿瘤发生的过程(29日- - - - - -36]。
考虑的重要作用等表观遗传机制在转录过程的可逆或不可逆的附件甲基所催化的DNA DNMTs [37),最近证明PPAR之间的交互γ和DNMTs14如果PPAR],我们试图评估γDNMTs告诉记者在胰腺癌振荡,分析它们的变化与时间相关的模式同步胰腺癌细胞系。
我们的数据放在证据重要的差异在周期性和相位关系PPARG,DNMT1,DNMT3B不同的细胞系中表达水平检测,可能与不同的遗传背景不同的胰腺癌细胞(38]。
BxPC-3细胞系,mucin-producing细胞来源于人类原发性胰腺腺癌,边缘显著24 h周期性的证明PPARG,DNMT1,DNMT3B表达模式,time-qualified概要文件PPARG和DNMT3B合格的概要文件,以及时间DNMT1和DNMT3B反对。
CFPAC-1细胞,来源于胰腺导管腺癌肝转移的囊性纤维化患者,边缘明显的节奏性与24小时内被发现的PPARG,DNMT1,DNMT3B表达模式,time-qualified概要文件显示不同的形状。
PANC-1细胞,epithelial-like细胞系来源于人类的胰脏癌,一个清晰的观察24小时周期时间限定的变化PPARG和DNMT1表达式,边缘明显的节奏性与24小时内观察到的DNMT3B表达模式,时间限定的PPARG和DNMT3B是对立的,而那些的PPARG和DNMT1是不同的,合格的DNMT1和DNMT3B显示平面形状。
米娅PaCa-2细胞株,建立从人类胰腺腺癌,一个清晰的观察24小时周期的时间限定的表达变化PPARG,边缘明显的节奏性与24小时内观察到的DNMT1和DNMT3B表达模式和时间限定的PPARG和DNMT1以及那些PPARG和DNMT3B和时间限定的DNMT1和DNMT3B是不同的(既不相同也不反对)。
不同的时间限定概要文件和相位关系证明在胰腺癌细胞系检查表明,他们依靠不同的转录电路和时序架构的表观遗传机制,这可能影响癌症细胞行为表型和可能对治疗的反应。
正常胰腺导管上皮细胞似乎并不表达PPARγ,而人类胰腺癌细胞系表达核受体和药物thiazolidinedione类的transactivate过氧物酶体扩散国的转录响应element-driven剂量依赖性的方式启动子(39]。此外,免疫组织化学染色的切除标本通过多克隆PPARγ抗体已经证明PPARγ在癌的细胞核蛋白表达在人类胰腺腺癌(90%的40]。选择性PPARγ配体剂量依赖性地抑制胰腺癌细胞生长和减少肿瘤细胞的侵袭性,表明这些药物的潜在作用的辅助治疗胰腺癌(41]。此外,一线药物治疗不可切除的胰腺癌是由模拟吉西他滨,核苷和PPARγ配体加强其在人类胰腺癌细胞的细胞毒性作用是剂量依赖性的方式和测试改善胰腺癌患者的预后(42]。
肿瘤抑制基因的失活是中心所有常见形式的人类癌症的发展,和失活来自表观遗传沉默而不是基因内的突变。肿瘤抑制基因失活在肿瘤疾病的普遍机制是由转录沉默的CpG岛甲基化,和DNA甲基转移酶,被DNMT1,占大多数老鼠细胞的甲基化,但人类癌症细胞缺乏DNMT1保留重要的基因组甲基化和相关基因沉默(11]。在人类细胞中,机制locus-specific或全球甲基化模式尚不清楚,但两种能阻碍DNMT3b DNMT1和几乎消除了甲基转移酶基因的破坏活动,减少大于95%的基因组DNA甲基化。DNA甲基转移酶的重要性DNMT1的维护细胞甲基化和它在肿瘤发生中的作用凸显了遗传实验。DNMT1是必要的,足以维持全球甲基化和甲基化异常的CpG岛在人类癌症细胞,和选择性耗尽DNMT1的反义抑制剂已被证明诱导脱甲基作用和激活沉默肿瘤抑制基因等CDKN2A。失活的DNMT1和DNMT3B诱发DNA甲基化水平低,而有选择性的删除DNMT1等位基因在癌细胞产生克隆保留CpG岛甲基化和肿瘤抑制基因沉默相关,表明这两个DNMTs合作保持DNA甲基化和基因沉默在人类癌症细胞,提供令人信服的支持这样的甲基化是必不可少的最佳可能的肿瘤扩散(11,35]。
总之,人类胰腺癌细胞系来源于具有不同的时间数组合格资料基因表达的表观遗传修饰,这可能与特定的遗传背景和可能影响癌症细胞表型,表明变量时间组织的细胞过程,将conditionate疾病行为和反应时间交付常规化疗。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突对本文的作者和/或出版。
确认
作者感谢教授阿尔多斯卡帕提供他们胰腺癌细胞系。拨款支持的研究从意大利卫生部医学科学学系研究实验室和分裂的胃肠病学(RC1203GA58)和内科与生物钟单元(RC1203ME46) IRCCS科学研究所和地区综合医院“德拉Casa Sollievo Sofferenza”歌剧di Padre Pio da Pietrelcina圣乔凡尼Rotondo (FG),意大利和“5×1000”自愿捐款。