文摘

过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs)调节脂质和葡萄糖稳态,是药品的目标,并通过环境污染物也被激活。几乎没有什么了解的表达PPARs在人类胎儿发育。本研究检视PPAR的表情 , , 信使rna和蛋白质在人类胎儿组织。随着年龄增加胎儿,PPAR的mRNA表达 和 增加肝脏,但PPAR 减少心脏和小肠,PPAR 减少肾上腺。成人和胎儿PPAR的意思表达 , , 信使rna在肠没有差别,但表达降低胎儿胃和心脏。PPAR 和 信使rna在肾脏和脾脏,PPAR 信使rna在肺癌和肾上腺降低胎儿和成人。PPAR 在肝脏和PPAR 信使rna在胎儿和成人胸腺更高。PPAR 蛋白质增加胎儿年龄在肠和减少肺、肾和肾上腺。PPAR 蛋白质在肾上腺和PPAR 与胎龄,肾功能下降。这项研究提供了新的信息PPAR亚型的表达在人类发展和将在评估潜在的重要发展中人类应对PPAR环境或药物受体激动剂。

1。介绍

过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARs)属于核激素受体超科有三个主要的亚型( , / , )[1]。这些受体扮演重要角色在胚胎和胎儿发育和胎盘功能(2,3),调节许多细胞和代谢过程4]。PPARs体内平衡控制能量,脂肪生成有重要的调控作用,脂质代谢、炎症反应、造血作用,并与慢性疾病如糖尿病、肥胖和动脉粥样硬化(5- - - - - -8]。PPAR 和 在早期胚胎生存和角色植入(9,10]。PPARs调节基因的表达被绑定到特定的DNA序列,过氧物酶体扩散者的反应元素(ppr),在目标基因的启动子区域。DNA结合PPAR之前形成的异质二聚体视黄素X受体(RXR) [11,12]。大量的内源性配体为每个PPAR亚型已确定,包括长链脂肪酸、亚麻油酸、花生四烯酸等多不饱和脂肪酸,饱和脂肪酸,和类花生酸(1]。各种合成配体已经开发用于药物治疗高脂血症等慢性疾病,糖尿病和代谢综合征。此外,一些化学物质和环境污染物激活PPARs,例如,邻苯二甲酸酯,三dichloroacetic酸,三氯乙烯,和全氟烷基磺酰酸化合物(PFAAs) [11- - - - - -14]。

PFAAs,包括并酸(PFOA) perfluorononanoic酸(PFNA)和perfluorooctane磺酸盐(卵圆孔未闭),是高度稳定的分子化学性质,使其卓越的表面活性剂(15]。多年来,这些化学物质被广泛应用于工业应用,现在发现持久的环境污染物,也存在于野生动物和人类的组织和血清(15- - - - - -17]。啮齿动物在实验室研究中,产前接触这些化合物对预处理和产后生存产生剂量相关性的影响,发育迟缓,产后增长和赤字18- - - - - -23]。PFAAs激活PPAR ,PFOA的发育毒性和PFNA在鼠标被证明是依赖PPAR的表情 在胎儿产前接触PFOA的影响或PFNA发生在野生型小鼠没有PPAR中观察到 淘汰赛的后代)[24,25]。PPARs表达在老鼠胚胎和胎儿(综述(26]),产前接触PFAAs被证明改变预处理和产后肝脏基因表达模式表明激活核受体(PPAR以及汽车27- - - - - -29日]。

几乎没有什么了解的表达PPAR在人类发展。目前,搜索的文献显示只有一篇描述PPARs的表达在人类胎儿,和纸描述表达的胃肠道(GI)束30.]。这种差距在科学知识的PPAR表达人类发展需要关注PFAAs,激活PPAR,改变基因表达,啮齿动物发育毒性,在环境中无处不在,被发现在血清和血液样本的人口在世界各地,包括样本的婴儿,儿童,在脐带血和牛奶(表明产前及产后婴儿的接触)17,31日- - - - - -36]。因此,为了评估潜在的这些环境化合物,和其他人,影响人类胎儿发育,重要信息的表达PPARs发展中人类胎儿。本研究报告为PPAR mRNA和蛋白表达 , , 在胚胎(ED) 54 - 125人类胎儿肝、心、肺、肾、胃、肠,肾上腺,脾脏和胸腺。

2。方法和材料

2.1。人类胎儿和成人样本

人类胎儿组织胚胎天(ED)年龄在54到125人从出生缺陷研究实验室获得大学的华盛顿,西雅图。组织标本的收集临床流产胎儿的出生缺陷研究实验室(包括知情同意捐赠和所有程序)进行了与人体机构审查委员会(IRB)批准。在EPA,这项研究是由人类研究伦理的办公室,UNC生物医学IRB和批准的国家健康的影响和环境研究实验室(NHEERL)人类研究协议办公室(HRPO)。

组织快速冷冻后尽快收集和存储 直到装上干冰。在到达美国环保署,样本存储 直到处理对总RNA和蛋白质。九个组织分析包括肝脏、心脏、肺、肾、胃、肠,肾上腺,脾脏和胸腺。前处理胎儿组织准备RNA和蛋白质,样本称重和小样本为RNA制备,而更大的样本分为两个RNA和蛋白质制备,和任何多余样本返回(仍然冻结)存储 。处理样品的重量和分裂期间完成对干冰尽可能减少解冻。成人9组织的总RNA检查研究从首选获得人类总RNA调查小组,Ambion, Inc .,(每个成人样本由池总RNA从3个人)。此外,来自23个成年人类肝脏组织样本可供比较的PPAR mRNA表达在成人和胎儿肝脏。这些样本来自CellzDirect, Inc . (NC)达勒姆。冻成人肝组织的总RNA制备样品和qPCR执行,为胎儿样本描述。

2.2。qPCR实验设计和程序

每个组织都运行在独立的qPCR实验(例如,肝脏样本不与任何其他组织运行)。在qPCR实验中,PPAR的表情 , , 和内部控制基因检查在每个盘子,和样品板包括2复制每个胎儿的示例和适当的集中成人组织(首选人类总RNA)。在这种情况下,有太多样品的组织在一个板上运行所有的反应,样本遇到2板,这样每个年龄是代表尽可能同样在每个盘子里。检查样品的实际数量为每个组织是在结果部分,但可用数量范围从23日至46标本,除了胸腺11标本。PPAR基因表达相对于一个内部控制基因表达。每个组织的胎儿样本进行表达 肌动蛋白, 2-microglobulin, glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH),作为潜在的内部控制基因。回归分析的执行周期阈值(Ct)为每一个潜在的控制基因,以发现任何表达式随着年龄的变化。基于良好的回归结果在所有的组织中(没有随着年龄的增长而显著变化), 2-microglobulin (B2M)被选为内部控制基因(数据未显示)。

组织均质和提取三试剂(σ化学,圣路易斯,密苏里州)根据制造商的指示,和RNA丸被存储在70%的乙醇 直到进一步使用。后再悬浮在水中nuclease-free (Promega公司麦迪逊,WI),纯洁的RNA是量化和评估(260海里/ 280 nm和260 nm / 230 nm)比率)使用NanoDrop nd - 1000分光光度计(NanoDrop技术,威明顿、德)。qPCR之前,2 使用2 g总RNA消化单位DNaseI (Promega公司麦迪逊,WI) 30分钟 其次是10分钟 在一个缓冲区包含40毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值8.0),液10毫米 ,1毫米 。DNase-treated RNA被量化使用Quant-iT RiboGreen RNA分析工具根据制造商的协议(英杰公司公司,卡尔斯巴德,CA)。大约1 g DNase-treated RNA的反向转录使用高容量cDNA归档工具根据提供的协议(应用生物系统公司)。放大了在应用生物系统公司7900型ht快速实时PCR系统重复使用25 ng cDNA TaqMan普遍PCR反应混合液(应用生物系统公司)12的总量 l。以下TaqMan化验(应用生物系统公司)被包括在研究:PPAR (Hs00947539_m1), PPAR (Hs00602622_m1), PPAR (Hs00234592_m1), 肌动蛋白(Hs99999903_m1) GAPDH (Hs99999905_m1), 2微球蛋白(Hs99999907_m1)。

PPAR mRNA Ct值,计算了应用生物系统公司SDS2.2.2软件,是规范化的减法Ct对于内部控制,B2M,生成 Ct值。的意思是 Ct对每个样本计算从2复制然后分析评估的变化表达胎儿年龄(回归分析)。之间的差异表达亚型测定使用方差分析的意思 Ct值(不考虑年龄),Bonferroni检测后申请的成对比较(Prism 4.0, GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。数据日志块用图表表示 。所有组织除了肝脏,胎儿和样品的比较单一的成人池示例使用Ct值和执行 分配测试(样本容量小于30)或 分布测试(样本容量大于或等于30)的概率来确定一个成年人这种极端的价值或更极端的会发现胎儿的分布值(使用概率可用计算器在线http://faculty.vassar.edu/lowry/tabs.html或http://davidmlane.com/hyperstat/z_table.html)。随着内部控制基因表达在成人和胎儿组织,不一样的Ct值,而不是 Ct值,用于这种比较。数据比较胎儿(平均2复制)的Ct和成人Ct(每个复制情节所示)是Ct的画作为垂直的散点图。对肝脏,有23个成人肝脏标本与胎儿肝脏样本可供比较。成人样本来自男性和女性,年龄从21岁到86岁,但分析Ct或dCt显示没有影响的性别或年龄在PPAR的表达 , ,或 或B2M(数据未显示)。成人和胎儿肝脏样本内部控制基因的水平相当,B2M,因此可以比较规范化的Ct值(dCt)使用方差分析与Bonferroni检测后申请成对比较(Prism 4.0, GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。

2.3。免疫印迹实验设计和程序

样品每个组织的运行在不同的免疫印迹试验(例如,肝脏样本不与任何其他组织运行)。一般来说,大多数的组织需要2 - 3西方墨迹来容纳所有的样品(每凝胶样品只有12车道),和样品被封锁在印迹,年龄范围是代表尽可能统一在每一个污点。检查样品的实际数量为每个组织是在结果部分,但可用数量范围从5到36个标本,而且只有胸腺和脾脏少于22标本。每个污点是检查表达式的PPAR亚型之一,内部控制蛋白质。GAPDH被选为内部控制蛋白的表达并没有改变与年龄(基于回归分析GAPDH蛋白表达在每个年龄9组织,数据未显示)。积极控制PPAR的抗体检测 , ,或 也运行在每一个污点。积极控制消息灵通的G2完整的细胞提取物(圣克鲁斯,sc - 2227), Jurkat细胞核提取(圣克鲁斯,sc - 2132),和U937细胞提取(圣克鲁斯,sc - 2239), PPAR的表达式 , ,或 ,分别。毕竟以这种方式组织检查,额外的西方印迹运行在所有9组织代表在吸干,大多数组织相同的91天的胎儿(尽可能,因为并不是所有组织都可以从任何一个胎儿胸腺并没有提供91天的胎儿)。三个“across-tissue”为每个PPAR亚型墨迹运行(例如, 胎儿/组织检查“across-tissue”调查)。

西方的屁股跑了25 克总细胞溶解产物或积极控制每道。丙烯酰胺凝胶都是7.5%预制凝胶(Biorad大力神,CA)和运行在125 V 90分钟。蛋白质转移到硝酸纤维素(Biorad)做了40分钟使用Biorad半干的传输系统。膜被封锁的1小时5%牛奶和孵化一夜之间在初级抗体在5%牛奶。主要抗体PPAR (sc - 9000)和PPAR (sc - 7196)是来自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)和在1:200稀释使用。PPAR 从Abcam (Abcam 21209)获得了抗体,Inc ., (Cambridge, MA)和用于1:750稀释。GAPDH抗体(sc - 25778)是来自圣克鲁斯生物技术和稀释在1:10000。隔夜孵化后主要抗体,探讨了屁股1小时与辣根peroxidase-conjugated二级抗体在5%牛奶。二次抗体稀释1:5000年,包括山羊anti-rabbit Jax 111-035-144(西树林,PA)、山羊anti-rabbit KPL 074 - 1506抗体和兔KPL 14-13-06 (KPL,马里兰州)。化学发光成像是使用Biorad Fluor-S机2或5分钟曝光。Biorad数量一个软件被用来执行卷整改与背景减法微化学发光图像,生成数据PPAR和GAPDH乐队。PPAR蛋白表达是相对于内部控制基因表达,GAPDH和回归分析的相关值进行检测的任何重大变化斜率随着年龄(4.0棱镜,GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。

3所示。结果

PPARs的表达了对于每个组织,报告任何变化与孕龄蛋白质或mRNA的表达,比较同形像的mRNA表达的相对水平,和比较mRNA表达在胎儿器官观察成人样本的组织。蛋白质和mRNA PPAR同形像被发现在所有的9组织和结果总结在表1,也列出了组织从最高到最低为每个PPAR mRNA的表达。表2总结的相对表达同形像在每个组织。数据显示使用相同的表示格式为每个组织。给出一个完整的叙事呈现第一组织(肝脏),提出为了简洁起见,其他组织省略重复的解释的结果适用于所有的数据集。

表1
相对 为每个亚型表达(从最高到最低上市意味着表达式), RNA和蛋白表达的时代,相对于成人和胎儿mRNA的表达。
表2
相对的RNA表达PPAR同形像在每个组织。
3.1。肝

人类胎儿肝PPAR表示 , , 信使rna从ed54 - 125(数据从39胎儿获得)。PPAR的表达 和PPAR 显著增加而PPAR 年龄范围(图保持不变1(一), 和 、职责)。表达水平的PPAR 和 在所有年龄没有显著不同,两人都比PPAR高度表达 ( )。 2 m mRNA表达显著高于任何PPAR亚型(的意思 SEM Ct在所有年龄,注意,Ct意味着更丰富的mRNA低于Ct高: ,PPAR ,PPAR ,PPAR )。PPAR mRNA的表达在胎儿肝脏相比,在23个成人肝脏样本。成人样本来自男性和女性,年龄从21岁到86岁,但性别或年龄的分析显示没有影响PPAR的表达 , , 或B2M(数据未显示)。B2M的表达、内部控制基因在成人和胎儿肝脏样本没有明显不同( , ,意思是 SEM、职责),从而可以分析PPAR值归一化B2M (dCt)。未经调整的分析Ct或dCt给了相同的结果,和图1(b)显示了情节的成人和胎儿肝脏Ct值。人类胎儿和成人肝脏PPAR表示 和 信使rna水平没有显著不同(图1(b)),但PPAR 在胎儿肝脏明显高于( ,更低的平均Ct显示更高的mRNA出现在一个示例)。PPAR的总体结果 和 相同的池总RNA从3捐助者(Ambion首选肝脏样本,数据未显示),从23人;成人和胎儿肝脏表达没有明显不同。Ambion首选汇集成人肝RNA表明PPAR 成人和胎儿肝脏之间没有差别,但是23个人的数据显示,胎儿明显高于表达式,和更大的” “化验的支持这个结果的有效性。在胎儿肝脏,PPAR , , 蛋白表达与胎儿并没有改变年龄(图1(c);数据从22个胎儿,ed54 - 120)。


图1
肝脏。(一)PPAR的表达 α , β , γ 信使rna在显示胎儿的年龄范围。日志的意思 ± SEM Ct规范化 β 2-microglobulin (B2M)。(b)胎儿PPAR的表情 α , β , γ 显示相对于表达在成人肝脏。每个符号代表每个胎儿的平均Ct值2复制(圆圈)和成人(满圆圈)样品(总体的意思是每组显示为一条水平线)。(c) PPAR α , β , γ 蛋白表达是在胎儿的年龄范围。免疫印迹密度是规范化glyceraldehyde-3-phophate脱氢酶(GAPDH)。向上箭头指示PPAR α ,箭头PPAR β ,钻石PPAR γ 。如果只有一个样本用于一个特定的年龄,然后一个误差项无法计算和SEM栏所示。随着年龄的增长回归分析评估变化。图中虚线C的95%置信区间。
3.2。心

PPAR 和 表情没有变化,但PPAR 表达式下降( (图)与胎儿的年龄2(一)、ed54 - 125, 胎儿).PPAR ,PPAR ,PPAR 相对表达式如表所示2同形像和差异是显著的 。 2 m mRNA表达高于PPAR(平均Ct 扫描电镜: ,PPAR ,PPAR ,PPAR )。胎儿PPAR , , 信使rna表达低于成人样本(图2(b); 、措施。001年,职责)。PPAR蛋白表达与胎儿并没有改变年龄(图2(c);36个胎儿,ed54 - 125)。


图2
的心。(一)PPAR的表达 α , β , γ 信使rna在显示胎儿的年龄范围。日志的意思 ± SEM Ct规范化 β 2-microglobulin (B2M)。(b)胎儿PPAR的表情 α , β , γ 相对于显示表达式在成人心脏。每个符号代表平均Ct值2为每个胎儿(圆圈)复制示例和成人(满圆圈)个人复制所示(总体的意思是每组显示为一条水平线)。(c) PPAR α , β , γ 蛋白表达是在胎儿的年龄范围。免疫印迹密度规范化glyceraldehyde-3-phophate脱氢酶(GAPDH)。向上箭头指示PPAR α ,箭头PPAR β ,钻石PPAR γ 。如果只有一个样本用于一个特定的年龄,然后一个误差项无法计算和SEM栏所示。随着年龄的增长回归分析评估变化。图中虚线C的95%置信区间。
3.3。肺

PPAR mRNA表达胎儿肺随着年龄的增长并没有改变(图3(一)、ed54 - 120, 胎儿)。PPAR 同形像统计图表达的是最高度( 、表2)。 2 m mRNA表达高于PPAR(意味着Ct 扫描电镜: ,PPAR ,PPAR ,PPAR )。胎儿和成人PPAR 和 信使rna表达没有不同,但胎儿PPAR 较低(图3(b); )。PPAR 蛋白质含量降低( ),但PPAR 和 并没有改变胎儿的年龄(图3(c), ED57到120年, 胎儿)。


图3
肺。(一)PPAR的表达 α , β , γ 信使rna在显示胎儿的年龄范围。日志的意思 ± SEM Ct规范化 β 2-microglobulin (B2M)。(b)胎儿PPAR的表情 α , β , γ 显示相对于表达在成人的肺。每个符号代表平均Ct值2为每个胎儿(圆圈)复制示例和成人(满圆圈)个人复制所示(总体的意思是每组显示为一条水平线)。(c) PPAR α , β , γ 蛋白表达是在胎儿的年龄范围。免疫印迹密度规范化glyceraldehyde-3-phophate脱氢酶(GAPDH)。向上箭头指示PPAR α ,箭头PPAR β ,钻石PPAR γ 。如果只有一个样本用于一个特定的年龄,然后一个误差项无法计算和SEM栏所示。随着年龄的增长回归分析评估变化。图中虚线C的95%置信区间。
3.4。肾脏

PPAR mRNA表达并没有改变与年龄(图4(一),46个胎儿,ed54 - 125)。PPAR 高于PPAR表达式 和PPAR ( , 、职责),和PPAR 高于PPAR ( )。 2 m mRNA表达高于PPAR(平均Ct 扫描电镜: ,PPAR ,PPAR ,PPAR )。PPAR 和 胎儿mrna水平低于成人(图4(b); , 分别为。),但PPAR 是类似的( )。PPAR 蛋白表达与胎儿并没有改变年龄( ),但PPAR 和 减少( ,图4(c);36个胎儿,ed57 - 125)。


图4
肾脏。(一)PPAR的表达 α , β , γ 信使rna在显示胎儿的年龄范围。日志的意思 ± SEM Ct规范化 β 2-microglobulin (B2M)。(b)胎儿PPAR的表情 α , β , γ 显示相对于表达在成人肾脏。每个符号代表平均Ct值2为每个胎儿(圆圈)复制示例和成人(满圆圈)个人复制所示(总体的意思是每组显示为一条水平线)。(c) PPAR α , β , γ 蛋白表达是在胎儿的年龄范围。免疫印迹密度规范化glyceraldehyde-3-phophate脱氢酶(GAPDH)。向上箭头指示PPAR α ,箭头PPAR β ,钻石PPAR γ 。如果只有一个样本用于一个特定的年龄,然后一个误差项无法计算和SEM栏所示。随着年龄的增长回归分析评估变化。图中虚线C的95%置信区间。
3.5。胃

PPAR mRNA表达并没有改变与年龄(图5(一)、35胎儿,ed54 - 120)。PPAR 同形像统计图表达的是最高度( 、表2)。 2 m mRNA表达高于PPAR(平均Ct 扫描电镜: ,PPAR ,PPAR ,PPAR )。PPAR , , 胎儿的mRNA表达低于成人胃(图5(b); , 。, . 05,职责)。PPAR蛋白表达与胎儿并没有改变年龄(图5(c);26个胎儿,ed59 - 120)。


图5
胃。(一)PPAR的表达 α , β , γ 信使rna在显示胎儿的年龄范围。日志的意思 ± SEM Ct规范化 β 2-microglobulin (B2M)。(b)胎儿PPAR的表情 α , β , γ 在成人的胃里显示相对于表达。每个符号代表平均Ct值2为每个胎儿(圆圈)复制示例和成人(满圆圈)个人复制所示(总体的意思是每组显示为一条水平线)。(c) PPAR α , β , γ 蛋白表达是在胎儿的年龄范围。免疫印迹密度规范化glyceraldehyde-3-phophate脱氢酶(GAPDH)。向上箭头指示PPAR α ,箭头PPAR β ,钻石PPAR γ 。如果只有一个样本用于一个特定的年龄,然后一个误差项无法计算和SEM栏所示。随着年龄的增长回归分析评估变化。图中虚线C的95%置信区间。
3.6。肠

PPAR 和 信使rna表达并没有改变随着年龄的增长,但PPAR 减少( ,图6(一),32个胎儿,ed54 - 120)。PPAR , , 表示在相似的水平(表吗2)。 2 m mRNA表达高于PPAR(平均Ct 扫描电镜: ,PPAR ,PPAR ,PPAR )。胎儿的肠道PPAR mRNA没有明显不同于成人小肠或成人结肠(图6(b))。PPAR 蛋白表达增加( ),而PPAR 和 蛋白质并没有改变胎儿的年龄(图6(c);29胎儿,ed57 - 120)。


图6
肠。(一)PPAR的表达 α , β , γ 信使rna在显示胎儿的年龄范围。日志的意思 ± SEM Ct规范化 β 2-microglobulin (B2M)。(b)胎儿PPAR的表情 α , β , γ 显示相对于表达在成人小肠和结肠(满圈显示上面的2复制的小肠和结肠2复制以下线指示的均值联合组织值)。每个开放的象征代表每个胎儿的平均Ct值2复制样本(总体的意思是显示为一条水平线)。(c) PPAR α , β , γ 蛋白表达是在胎儿的年龄范围。免疫印迹密度是规范化glyceraldehyde-3-phophate脱氢酶(GAPDH)。向上箭头指示PPAR α ,箭头PPAR β ,钻石PPAR γ 。如果只有一个样本用于一个特定的年龄,然后一个误差项无法计算和SEM栏所示。随着年龄的增长回归分析评估变化。图中虚线C的95%置信区间。
3.7。肾上腺

PPAR 信使rna随着年龄下降( ),而PPAR 和 保持不变(虽然 对于PPAR ;图7(一),46个胎儿,ed54 - 120)。PPAR 和 比PPAR mrna表达更有高度 ( 、表2)。 2 m mRNA表达高于PPAR(意味着Ct 扫描电镜: ,PPAR ,PPAR ,PPAR )。胎儿和成人PPAR 和 信使rna并没有不同,但PPAR 在胎儿肾上腺(低 ;图7(b))。PPAR 和 蛋白表达降低与胎儿年龄( , 、职责;图7(c);36个胎儿,ed67 - 120)。


图7
肾上腺。(一)PPAR的表达 α , β , γ 信使rna在显示胎儿的年龄范围。日志的意思 ± SEM Ct规范化 β 2-microglobulin (B2M)。(b)胎儿PPAR的表情 α , β , γ 显示相对于表达成人肾上腺。每个符号代表平均Ct值2为每个胎儿(圆圈)复制示例和成人(满圆圈)个人复制所示(总体的意思是每组显示为一条水平线)。(c) PPAR α , β , γ 蛋白表达是在胎儿的年龄范围。免疫印迹密度是规范化glyceraldehyde-3-phophate脱氢酶(GAPDH)。向上箭头指示PPAR α ,箭头PPAR β ,钻石PPAR γ 。如果只有一个样本用于一个特定的年龄,然后一个误差项无法计算和SEM栏所示。随着年龄的增长回归分析评估变化。图中虚线C的95%置信区间。
3.8。脾

PPAR mRNA表达并没有改变与年龄(图8(一)、23个胎儿,ed67 - 125)。PPAR 同形像统计图表达的是最高度( 、表2)。 2 m mRNA表达高于PPAR(平均Ct 扫描电镜: ,PPAR ,PPAR ,PPAR )。胎儿PPAR 和 mrna水平低于成人( ,图8(b))。PPAR , , 蛋白表达与胎儿并没有改变年龄(图8(c);11个胎儿,ed85 - 125)。


图8
脾脏。(一)PPAR的表达 α , β , γ 信使rna在显示胎儿的年龄范围。日志的意思 ± SEM Ct规范化 β 2-microglobulin (B2M)。(b)胎儿PPAR的表情 α , β , γ 相对于成人脾表达式所示。每个符号代表平均Ct值2为每个胎儿(圆圈)复制示例和成人(满圆圈)个人复制所示(总体的意思是每组显示为一条水平线)。(c) PPAR α , β , γ 蛋白表达是在胎儿的年龄范围。免疫印迹密度是规范化glyceraldehyde-3-phophate脱氢酶(GAPDH)。向上箭头指示PPAR α 和向下箭头PPAR β ,钻石PPAR γ 。如果只有一个样本用于一个特定的年龄,然后一个误差项无法计算和SEM栏所示。随着年龄的增长回归分析评估变化。图中虚线C的95%置信区间。
3.9。胸腺

PPAR mRNA表达并没有改变与年龄(图9(一)、11个胎儿,ed74 - 120)。PPAR 信使rna表达高于PPAR 或 ( ),PPAR的 高于PPAR ( )。 2 m mRNA表达高于PPAR(平均Ct SEM Ct: ,PPAR ,PPAR ,PPAR )。PPAR 胎儿mRNA表达高于成人( ,图9(b))。PPAR蛋白表达与胎儿并没有改变年龄(图9(c);5胎儿,ed101 - 120)。


图9
胸腺。(一)PPAR的表达 α , β , γ 信使rna在显示胎儿的年龄范围。日志的意思 ± SEM Ct规范化 β 2-microglobulin (B2M)。(b)胎儿PPAR的表情 α , β , γ 相对于成人胸腺表达。每个符号代表平均Ct值2为每个胎儿(圆圈)复制示例和成人(满圆圈)个人复制所示(总体的意思是每组显示为一条水平线)。(c) PPAR α , β , γ 蛋白表达是在胎儿的年龄范围。免疫印迹密度是规范化glyceraldehyde-3-phophate脱氢酶(GAPDH)。向上箭头指示PPAR α 和向下箭头PPAR β ,钻石PPAR γ 。如果只有一个样本用于一个特定的年龄,然后一个误差项无法计算和SEM栏所示。随着年龄的增长回归分析评估变化。图中虚线C的95%置信区间。
3.10。PPAR的比较 , , 表达水平在不同的组织

表1列出了订单中组织基于RNA表达水平在胎儿组织这样列出的第一个组织为每个子类型列表中的最后一个最高最低的表情。RNA表达的排名是基于平均Ct为每一个组织在所有年龄。PPAR的表达 信使rna在肠中最高,肝脏和肺和胃和脾脏中相对较低。PPAR 最高的肠,肾上腺,在脾脏和胃和肺,而表达相对较低。PPAR 是最高的胸腺、肠和脾脏,但不善表达心脏和肾上腺。在所有的组织中,小肠是独一无二的在高的所有三个亚型的表达,尽管肺PPAR表达高水平的 和 。胃不好表达了所有三个亚型相对于其他组织。脾两PPAR显示弱表达 和 ,而PPAR的表情 和 是软弱的心。

比较的相对水平为每个PPAR亚型蛋白表达不了。GAPDH没有改变的表达随着年龄的增长,这使得一个合适的加载控制的标准化PPAR来自西方的屁股微密度值为每个组织跨年龄(数据未显示);然而,GAPDH表达显著不同的组织和不恰当的比较或等级之间的规范化表达不同的组织。即使考虑到GAPDH的水平不一致表示在不同的组织中,很明显,有不同程度的PPAR , , 蛋白质的各种组织。这个图中可以看到10这说明了PPAR的表达蛋白在所有9组织为每个子类型单一的屁股。在这些化验,所有9组织出现在每一个污点,尽可能,组织每个污点来自相同的91天的旧的胎儿。胸腺是只能从101 - 108年,110天的旧的胎儿。三个cross-tissue化验(每个使用不同胎儿的组织)为每个PPAR亚型和示例的运行多个组织墨迹图所示10。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图10
西方的屁股,所有9所示组织存在在每一个污点。在PPAR α 吸干,黑暗组织的酒吧都从一个91天的胎儿,肾上腺和肾脏(白色酒吧)来自不同的91天的胎儿,胸腺是胎儿从101天。PPAR的屁股 β 和PPAR γ 样本使用91天的胎儿(黑暗的酒吧,PPAR相同的样本集 β 和 γ )与肾脏和来自不同胎儿胸腺样品(白色酒吧)(91年,108天,职责)。污点标记图像显示的位置PPAR乐队,GAPDH乐队,莱恩包含积极的控制(消息灵通的G2完整的细胞提取物,Jurkat细胞核提取、和U937细胞提取物,PPAR的表达式 α , β ,或 γ 、职责)。微数据(GAPDH PPAR表达规范化)对于每个凝胶所示图像污点。通道1 - 9包含样品上市 x 设在酒吧的图表。

4所示。讨论

这项研究提供了新的信息PPAR亚型的表达在人类胎儿发育。PPAR , 和 表达在人类胎儿从胚胎天54到125。蛋白质和mRNA为所有三个PPAR亚型9组织检查中被发现。在某些器官,信使核糖核酸或蛋白质的表达变化在发育期间检查。相对水平PPAR亚型的mRNA表达不同的组织。在某些器官,信使rna表达水平相当或高于成人组织。

人类胎儿PPAR亚型的表达可以被认为是类似的表达模式报告实验室啮齿动物,综述(26]。在老鼠和老鼠,PPAR mRNA和/或蛋白质检测在产前及产后发展肝脏,肾脏,心脏,肺,肾上腺,脾脏,脊椎,中枢神经系统(CNS)的组织,大脑,脂肪,脂肪,肌肉和皮肤。表达不同的模式组织依赖于发展阶段。很难做出具体对比PPAR表达的发展模式在实验室动物和人类胎儿组织的研究比较相似的发展阶段成为复杂的器官发生[结束后26]。在目前的研究中,人类胎儿发育时期的范围从8到18周,一段时间后器官形成,包括胎儿快速增长阶段,分化和器官系统的功能成熟。器官发生的结束和开始胎儿时期通常被认为是发生在怀孕的第8周(37),进入胎儿阶段的里程碑式的融合是次要的口味。腭开始融合在人类胎儿在胚胎54天,通常是完成56-57-day-old胎儿(37,38]。老鼠和老鼠,上颚的融合发生在ED14-15 16 - 17,分别,虽然这一两天可以随这取决于应变。因此,它可能是合理的考虑ED14鼠标,ED16鼠,ED54-56人类胎儿组织处于类似发展阶段为目的的PPAR表达式的比较。限制讨论特定发育时期(年底器官形成,上颚的融合),人类和啮齿动物PPAR表达的比较可能会有限制。总的来说,如下面所讨论的,有相似之处,还有一些差异,表达的PPAR在啮齿动物和人类胎儿器官形成的末尾。

在ED15.5鼠肝、温和的PPAR mRNA水平 和 被发现和PPAR 蛋白质在肝脏和PPAR ED15老鼠 2蛋白被发现在一个较早的阶段(ED13)在小鼠肝脏39,40]。在目前的研究中,PPAR 高度表达在人类胎儿肝和相对丰富的比其他组织(只有肠更高)。当评估在所有年龄,PPAR 和 更丰富的比 在肝脏。

大鼠心脏和肺部PPAR表示 和 ,PPAR 蛋白表达是报道小鼠心脏和肺40,41]。在目前的研究中,人类胎儿的肺和心脏PPAR的高表达 和肺PPAR强烈表达 和 相对于其他器官。在人类胎儿心脏和肺部,PPAR 更丰富的比 或 心里, 是最低的亚型的表达。

ED15.5鼠和14.5老鼠肾脏PPAR表示 信使rna。PPAR 信使rna在鼠和PPAR被发现 和 在老鼠的肾脏(弱探测到41,42]。在人类胎儿肾脏,PPAR 表达水平高于 或 , 在肾脏最丰富的亚型。

我们不知道任何公布的数据表达胸腺和脾脏的PPAR发展中啮齿动物。在人类胎儿脾脏,PPAR 和 表示在低但等效水平和PPAR吗 与相对较高的表达最丰富的亚型(只有胸腺和肠更高)。在人类胎儿胸腺,PPAR 信使rna很丰富(高于任何其他组织)和PPAR 和 发现了比PPAR下级 。

在大鼠胃肠道,PPAR mrna 和 ,但不 (报告没有发现),表示,PPAR 蛋白在小鼠胃肠道组织(40,41]。目前的研究发现高表达肠PPAR亚型相对于其他器官,和PPAR , , mrna在同等水平。胃,分别检查,所有亚型的表达较低相对于肠,和PPAR 是最高度表达亚型在肚子上。Huin et al。30.)检查PPAR蛋白表达在人类胎儿消化道(年龄7 - 22周)使用免疫组织化学和发现时空表达模式在食道、胃、空肠、髂骨、结肠癌。在目前的研究中,使用qPCR和免疫印迹方法,不随年龄变化中检测出胃PPAR的表达式 , ,或 。Huin PPAR的报告发现略低 在19周相比,12和15周的年龄,而PPAR 和 略高15 - 16周,分别比在12或19周的妊娠。Huin尊观测的研究是目前研究的年龄范围之外,但蛋白质的轻微变化报道Huin信使rna和蛋白质的不同于我们的观察在早期的年龄。肠道的PPAR Huin不同地区观测到的报道的研究作为一个整体模式类似,本研究发现;然而,在目前的研究是不可能分离肠道的地区。Huin报道增加PPAR 回肠从12到22周的时代,类似于PPAR随着年龄增加 蛋白质从8到18周观察目前的研究。同样,Huin PPAR的报道 和 蛋白表达在空肠和髂骨相似跨越时间(7 - 16周和12日至22日,职责),和现在的研究还发现PPAR的蛋白表达无显著变化 或 随着年龄的增长。

目前研究的一个重要的发现是,胎儿组织可以表达PPAR水平相当于成人的PPAR的组织(或更高 在肝脏和PPAR 在胸腺)。然而,一些谨慎是需要成年人的数据对于每个组织(除了肝脏)是基于一个池总RNA样本3捐赠者和它类似的结果是否会不知道来自更多的成人捐助者。然而,在肝脏中,23个人支持的数据集中的数据样本,也就是说,PPAR的表达 和 在成人和胎儿肝脏没有显著不同。然而,合并样本没有检测PPAR表达的增加 在胎儿肝脏相对于成年人,在23个人观察肝脏样本。因此,成人和胎儿比较提供数据,以前没有和代表这个端点的唯一信息。然而,重要的是要认识到,比较这些数据与其他分析从大成人组织集将是可取的。

总之,本研究的独特之处在于PPAR的表达提供大量信息 , , 在人类胎儿发育。在这项研究的优势是蛋白质和mRNA的收购数据相同的样本,从大多数胎儿包含多种组织,大量的个人代表的样本集。表示组织一系列年龄支持评估是否PPAR表达变化发展进步。qPCR方法支持估计的相对表达亚型在组织以及支持比较每个亚型的表达在不同的组织。在介绍中提到的,本研究的一个重要方面是提供信息用于评估潜在的人类胎儿应对PPAR激动剂。研究在人类胎儿的组织反应PPAR激动剂一般是不可行的;因此,重要的是至少有发育PPAR的表达和信息如何比较成人的表情。本研究有助于我们知识的表达PPAR在开发和比较胎儿和成人PPAR表达式。这项研究的一个重要的发现是,胎儿组织可以表达水平相当于成人的PPAR的组织(或更高 在肝脏和PPAR 在胸腺)。PPAR亚型在胎儿发育的作用尚不清楚,但很有可能,这些核受体的角色类似描述成人组织,包括能量调节体内平衡以及脂质和葡萄糖的利用率。在胎儿阶段检查在这项研究中,器官迅速发育、分化、和收购功能。外生的代理改变PPAR信号在成年人的,比如环境代理、化学物质,或药物,能够影响脂质和葡萄糖利用率,胆固醇生物合成,和其他代谢途径,这些属性使药品PPAR信号一个有吸引力的目标针对管理疾病(糖尿病、代谢综合征、高脂血症)4,40]。本研究表明,PPAR亚型表达在人类胎儿发育在许多器官和PPAR表达式和函数很可能在开发过程中有严格的规定。目前尚不清楚具体的代理扰乱PPAR表达式在胎儿或函数,这种扰动是否会有后果或影响是否会出现或持续到很久以后的生活阶段。然而,PPAR的示范的表达 , , 在9个主要器官在人类胎儿发育呈现高度相关的考虑这样的问题。

确认

Drs。迈克尔Devito和克里斯·哥尔顿葡萄酒(美国EPA)慷慨地提供样品的成年人类肝脏,他们来自CellzDirect, Inc .(达勒姆数控)。作者还欣赏辛西娅·j·沃尔夫的援助和杰森Stanko动物在这项研究工作。