肿瘤抑制候选人5基因的分子特征:由PPAR监管和识别TUSC5编码变异在精益和肥胖的人类

文摘

肿瘤抑制候选人5 (TUSC5)是一个基因表达在白色脂肪组织(窟),棕色脂肪组织(BAT)和外周传入神经元。强大的脂肪细胞表达和过氧物酶体扩散国受体激活后表达增加(PPAR)受体激动剂治疗3 t3-l1组织建议的角色Tusc5脂肪细胞增殖和/或新陈代谢。然而,在窟Tusc5的规定及其潜在的协会与肥胖表型尚不清楚。我们测试的假设TUSC5基因是一个真正的PPAR目标和评估是否窟表达式或单核苷酸多态性(snp) TUSC5编码区与人类肥胖相关联。3 t3-l1脂肪细胞诱导Tusc5 mRNA水平troglitazone GW1929遵循了一个剂量反应符合这些代理PPAR的结合亲和力。染色质免疫沉淀反应实验证实,PPAR(芯片)蛋白结合kb赞助者的小鼠TUSC5瞬变期间序列3 t3-l1脂肪形成,并发与组蛋白H3乙酰化作用。无明显Tusc5信使rna和蛋白质含量变化与吡格列酮治疗2型糖尿病患者。Tusc5表达没有明显诱导肝脏准备overexpressing PPARs,表明组织因素调节PPARTUSC5基因的响应能力。最后,我们没有观察到的差异Tusc5窟表达式或编码区单核苷酸多态性在精益和肥胖的患病率人类主题。这些研究坚定地建立小鼠TUSC5 PPAR基因位点目标,但是Tusc5的意义在肥胖表型或PPAR的药物的行为受体激动剂在人类仍然是模棱两可的。

1。介绍

肿瘤抑制候选人5 (TUSC5,也称为LOST1或BEC-1)最初被确定为一个基因位点在一些肺癌和中断,因此,假设参与衰减的癌症细胞增殖(1]。符合这一假设,Tusc5蛋白质包含CD225干扰素诱导蛋白跨膜域(2),发现原型interferon-responsive十全十美的蛋白质与干扰素抗增殖行动(3]。现在坚定Tusc5表情非常组织特定的啮齿动物和人类,在白色和棕色脂肪细胞成熟健壮的表达式(2,4,5)和外周传入神经元(2]。这种独特的表达模式显示的重要函数Tusc5在脂肪组织和周围神经系统。

对脂肪组织,我们提出工作假说,Tusc5参与途径调节脂肪细胞的增殖或促进细胞周期增长逮捕/脂肪细胞成熟应对环境或中枢神经系统信号(2]。该模型主要基于Tusc5的假定的肿瘤抑制功能(见上图),同时表达Tusc5与脂肪细胞标记增加3 t3-l1脂肪细胞退出有丝分裂克隆扩张阶段晚期分化和成熟2),镇压“增殖”Tusc5表达式的褐色脂肪组织(蝙蝠)冷暴露啮齿动物([4];也看到[2])。根据这一模型,Tusc5“总督”作用,抑制脂肪细胞增长信号触发时(即。通过冷或肥胖)。然而,确切的生理功能Tusc5仍然难以捉摸。

尽管最近进步Tusc5生物学特性的脂肪细胞,其监管机构和潜在的基因与肥胖表型仍有待澄清。确定因素影响Tusc5基因表达并获得更好的理解Tusc5基因序列之间的关联,表达模式,和肥胖将使更深入地理解其生理功能。以前,我们报道,Tusc5信使rna和蛋白质丰度增加短期(后1天)或1周治疗3 t3-l1脂肪细胞与高浓度的过氧物酶体扩散者激活受体(PPAR)受体激动剂GW1929 [2),支持TUSC5是一个真正的PPAR的假设目标基因。如果得到证实,这将有力地证明Tusc5 metabolically-relevant因素,因为PPAR目标基因通常参与脂肪细胞功能和其他重要的代谢过程。为了进一步解决这个问题,我们寻找潜在的PPAR响应元素(根据DR1网站)在小鼠TUSC5启动子,执行染色质免疫沉淀反应(芯片)研究确定PPAR与这些网站在3 t3-l1脂肪形成,并评估是否这些交互发生并发与染色体组蛋白乙酰化作用的变化。来洞察PPAR的临床意义-TUSC5交互,Tusc5 mRNA水平相比在存档人类窟活检样本与PPAR之前和之后的治疗受体激动剂吡格列酮或罗格列酮。在互补的研究中,我们调查了肥胖和Tusc5之间的关系,通过比较Tusc5基因编码变异及其在肥胖和nonobese窟mRNA表达人类的主题。我们假设窟Tusc5转录水平将会降低在州以白色脂肪细胞的增殖,如肥胖,Tusc5编码区序列变异的频率将精益和肥胖的人类之间的不同。我们的结果支持这一观点,小鼠TUSC5 PPAR目标基因,但Tusc5之间的关系,肥胖,PPAR的药理作用受体激动剂仍然是模棱两可的。

2。方法

材料
胰岛素,地塞米松,3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)和GW1929买来σ。DMEM和上标三世第一链合成装备从英杰公司购买。组织培养的菜肴和多井板块来自BD猎鹰。新生牛血清得到从Hyclone lot-tested胎牛血清(的边后卫)从阿特拉斯购买生物制剂。

2.1。实验评价Tusc5 PPAR基因位点目标

Tl1脂肪细胞的分化和PPAR受体激动剂剂量反应研究
GW1929治疗的影响和troglitazone Tusc5 mRNA丰富测试小鼠3 t3-l1脂肪细胞模型。细胞生长如前所述[2),除了胰岛素被撤回在最初两天分化期和细胞生长在6-well裸板。postdifferentiation成熟脂肪细胞(10 - 12天,每3 - 4天)媒体改变了18个小时包含强有力的媒体non-thiazolidinedione PPAR受体激动剂GW1929 [6]或引起的thiazolidinedione (TZD)受体激动剂troglitazone为了生成一个剂量反应关系的Tusc5表达式(/每剂);控制生长在媒体含有二甲亚砜车辆(DMSO溶液;0.1%卷)。两次重复了同样的实验。RNA制备使用Trizol-based细胞培养方法的样品按照制造商的指示(Ambion、奥斯汀、TX)和目标基因的转录丰度测量在“基因表达分析”一节所述。Parallel-treated板被用来生成蛋白质溶解产物Tusc5测量蛋白质免疫印迹,如下所述。

染色质免疫沉淀反应(芯片)化验
芯片分析进行如前所述[7]。总之,支流preadipocytes(0)和分化3 t3-l1脂肪细胞(在第四天或8分化的鸡尾酒后,增加了一天1 - 2)在1%甲醛交联37°C 10分钟和200年resuspendedL(诺乃清洁剂P-40-containing缓冲区(5毫米管道、pH值8.0,85毫米氯化钾,和0.5% NP-40)。200年原油核被孤立和细胞溶解L裂解缓冲(1% SDS、EDTA 10毫米和50毫米Tris-HCl, pH值8.1),与免疫沉淀反应和溶解产物用稀释10倍缓冲区(16.7毫米Tris-HCl (pH值8.1),氯化钠167毫米,1.2毫米EDTA, 0.01% SDS和1.1% Triton x - 100)。溶菌产物免疫沉淀反应了antiacetylated-histone H3 (K9) (1g), antiacetylated-histone H4 (pan) (1g),或者antiPPAR(1g)抗体在4°C为12小时。免疫复合物与蛋白质孵化A-Sepharose CL-4B (Amersham-Biosciences) 2小时在4°C。“输入”表示输入染色质总数的10%。经过连续水洗,免疫复合物含有DNA筛选了,沉淀DNA被PCR扩增。这些实验重复三次。启动子引物对用于这项研究如下:(1)301个基点为假定的扩增子−8 kb DR-1 (:GTTCCACATATGTTGAACT,:GAAGGAAGAAAGACAGACT);(2)假定的−1.8 kb DR-1扩增子(289个基点:CACCAAGCAAACATGCTTT,:ACAACATGCACGTAAGTGC);(3)假定的−1.1 kb DR-1扩增子(304个基点:AAAGCCACCCTTCCCATAC;:CCTAAAGCCACCAAGGGAA);374个基点(4)非特异性扩增子附近的假定的−8 kb DR-1序列(:AGTCTGTCTTTCTTCCTTC,:TGCTACAAGAAACCTTTCA)。抗体acetylated-histone H3 (K9) acetylated-histone H4 (pan)从北部生物技术、购买和对PPAR的抗体来自Abcam。

Tusc窟转录丰度在受试者服用tzd治疗类型糖尿病(TDM)
在第一项研究中,归档样本可以从一个子集的志愿者参与之前的一项研究描述(8]。与2型糖尿病的受试者接受吡格列酮(PIO)(30毫克/天;:5男,11女)或安慰剂(:7男9女)17岁周。如果空腹血浆葡萄糖100 mg / dL或糖化血红蛋白7.0%在8周的研究中,PIO的剂量增加到45毫克/天。腹部皮下脂肪组织(窟)活检获得的Bergstrom针在研究的开始和结束在一夜之间迅速,与当地利多卡因麻醉,和样本flash冷冻和储存在−80°C到加工mRNA和目标基因定量记录如下所述。临床研究机构审查委员会批准的彭宁顿生物医学研究中心。

在二线的研究,档案组织样本来自27个2型糖尿病受试者参与研究的目标是生成表达谱TZD之前和之后的治疗。一些报道从个体先前发表的临床研究9,10]。主题是一个更大的一个子集,三条学习队列用于研究表达谱与胰岛素抵抗和TZD有关治疗(11]。吡格列酮研究包括八个科目(所有男性,年龄年,体重指数公斤/米²、空腹血浆葡萄糖mg / dL)。罗格列酮研究包括19个学科(6女/ 13男,年龄年,体重指数公斤/米²、空腹血浆葡萄糖mg / dL)。腹部皮下脂肪组织的活检针收获之前和之后的12周的治疗与吡格列酮(45毫克/天)或罗格列酮(8毫克/天)。活检是flash在液态氮冷冻和储存在−80°C。人类基因组寡核苷酸微阵列(U133 + 2.0, Affymetrix, Inc .,圣克拉拉,CA)被用来生成样品从每个脂肪组织基因表达谱。描述了RNA制备和阵列分析(11]。基因表达水平,表示为平均差异分数,确定使用Affymetrix MAS 5.0软件。实验协议制度审查委员会批准的人类受试者的加州大学圣地亚哥分校和通知书面同意了从每个主题。

2.2。研究由PPAR Tusc5基因的激活外的脂肪细胞

分析Tusc在小鼠肝脏基因表达Overexpressing PPAR或PPAR在肝脏
检查肝PPAR的效果1过度Tusc5表达式,从先前发表的研究中使用的样本PPAR基因敲除小鼠与静脉输液治疗剂量的小鼠PPAR腺病毒制剂包含1 ()或LacZ控制()过表达contructs驱动主要表达在肝脏(见[12)相关动物治疗和RNA隔离)。使用Taqman总RNA进行定量PCR引物和探针针对Tusc5或PPAR积极控制目标基因adipoQ(编码脂联素),如下所述。

测定小鼠PPAR的肝脏超表达的影响2肝Tusc5,存档样本使用从以前公布的实验:C57BL / 6小鼠静脉输液治疗小鼠PPAR腺病毒制剂包含2 ()或LacZ(控制,)超表达结构13]。互补脱氧核糖核酸的总RNA(低聚糖−dT影射)准备从肝组织和基因表达分析如下所述。

过度的PPAR HepG亚型肝胚细胞瘤细胞
这些研究在大阪大学,严格四环素(春节)-regulatable HepG2-tet-off-hPPAR (PPAR亚型,,1,2)肝胚细胞瘤细胞用于这些实验、细胞培养条件下,和RNA制备技术已经在详细描述(14]。简单地说,在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(高糖DMEM)含10% heat-inactivated的边后卫,青霉素100单位/毫升,100年300年g / mL链霉素0.5 g / mL G418抗生素,g / mL嘌呤霉素,和2克/毫升春节。PPAR配体治疗,细胞培养在中补充10% heat-inactivated炭/ dextran-treated的边后卫。过度表现的PPAR亚型,HepG2-tet-off-hPPAR细胞(细胞/盘)被播种在6厘米菜没有春节24小时(14]。细胞被PPAR对待配体(1M GW7647 PPAR100 nM GW501516 PPAR,或1M罗格列酮对PPAR)或车辆(0.1% DMSO) 24小时。总RNA分离使用QuickGene RNA从细胞培养细胞HC工具包(富士)根据制造商的指示。信使rna准备这些样品被转移到WHNRC定量PCR分析,如下所述。RNA在NanoDrop nd - 1000分光光度计和量化处理如下所述目标基因的转录丰度的测量包括人类Tusc5和积极控制pan-PPAR-target基因脂肪分化相关蛋白(ADRP或ADFP) + phosphoenolypyruvate PPAR目标1 (PEPCK1 / Pck1)酰coa氧化酶1 (ACOX1),肉碱palmitoyltransferase 1 b (Cpt1b)。有一个总3-sample /治疗组。

2.3。研究评估Tusc5在人类肥胖

临床调查每个参与中心的机构审查委员会批准,并根据执行《赫尔辛基宣言》。

表达Tusc信使rna在人类肥胖窟
肥胖与脂肪仓库之间的差异的影响对Tusc5 mRNA分析了大量使用存档人类窟nonobese样本()和肥胖()科目。样本来源于女性志愿者接受手术,如前所述[15];样品是我们最近使用的相同特征的另一个adipocyte-neuron基因-核蛋白-(SNCG;(16])。内脏脂肪组织(网膜的)过程中收集腹腔镜检查或剖腹手术胃成形术或妇科手术,和SC脂肪获得并行的腹部。信使rna准备这些样品被转移到WHNRC定量PCR分析,如下所述。

TUSC序列变异在精益和肥胖的科目
细节关于这个主题的人口,排斥和入选标准,测序方法,和数据分析技术已经先前描述(17]。基因组DNA样本来自极端肥胖群体的(,平均体重指数公斤/米²和非常瘦,平均体重指数公斤/米²)分析了白色的欧洲血统的人在美国能源部联合基因组研究所(变得),莱恩·a . Pennacchio博士的实验室。TUSC5 (NM_172367)编码外显子及其接头网站使用gene-specific测序引物集,和序列多态性等位基因频率精益和肥胖组之间比较。主题招聘来自渥太华社区(精益课程)或渥太华大学的体重管理诊所和心脏研究所脂诊所17]。

基因表达分析
RNA是准备从3 t3-l1脂肪细胞和人类窟活检样本使用Ribopure工具包(应用Biosystems-AM1924)。RNA丰度量化使用NanoDrop nd - 1000分光光度计(NanoDrop技术)。互补脱氧核糖核酸合成使用上标三世从总RNA逆转录酶(表达载体)其次是前体治疗根据制造商的指示。基因表达分析的定量PCR利用gene-specific Taqman引物和FAM-MGB标记探针(Assays-on-Demand,应用生物系统公司,Inc .)和分析了重复或为每个样本一式三份使用ABI 7900 ht乐器。反应进行了384孔格式包含以下每个:互补dna相应的原始总RNA(3到10 ng t3-l1 PPAR剂量反应研究),2 ng (PPAR)或10 ng (Tusc5 ARBP / 36 b4, AdipoQ)小鼠PPAR1和PPAR2肝超表达研究,20 ng (HepG2 PPAR超表达研究),或5 ng(人类窟样本);互补脱氧核糖核酸在每个干好之前添加qPCR试剂促进一个8L /分析。井也包含1 x大师混合(ABI普遍PCR主混合或Taqman基因表达主混合)和1 x特定primer-probe混合。循环条件50°C 2分钟,95°C 10分钟,40 95°C的周期为1分钟15秒/ 60°C。扩增循环数(Ct)控制的信使rna(真核18岁)确定使用商业引物和探针(ABI)为模板加载正确的差异,确定和表达式的值相对于治疗控制转录水平使用数学公式如前所述[2]。引物和探针ABI标识符老鼠研究Tusc5 (Mm00624784_m1), aP2 / FABP4 (Mm00445880_m1), PPAR(Mm00440945_m1)和脂联素/ adipoQ (Mm00456425_m1)。标识符是人体细胞和组织研究ADFP (Hs00605340_m1),脂联素/ AdipoQ (Hs00605917_m1) Cpt1b (Hs00992664_m1) PEPCK1 / Pck1 (Hs00159918_m1),瘦素(Hs00174877_m1) ACOX1 (Hs00244515_m1)和LPL (Hs00173425_m1)。

蛋白质的提取和免疫印迹分析
短暂、组织样本均质在均化冰缓冲区(50毫米管道、150毫米生理盐水、1.5% n-Octyl --D-glucopyranoside;300年与1 x L / 100毫克组织)停止蛋白酶和磷酸酶抑制剂(皮尔斯)。3与PBS t3-l1细胞被洗一次,与Tusc5同质化缓冲与抑制剂细胞溶解,用近5 s。溶菌产物是旋转在4°C 20000克10分钟。使用bicinchoninic酸测定蛋白质浓度测定的数量(皮尔斯)。Tusc5, 2.5 - 5克总蛋白分离Bis-Tris 12% SDS凝胶使用2 - (N-morpholino) ethanesulfonic (MES)酸运行缓冲(表达载体)。蛋白质被转移到聚乙二烯二氟化物膜和兔子anti-Tusc5抗体(免疫印迹)PBST过夜。特定的信号检测辣根peroxidase-conjugated二级抗体(山羊antirabbit合使用微孔止动剂西方化学发光底物(微孔)。墨迹成像使用一种Fluorochem 8800仪器(αInnotech)。微强度下降在线性范围内确定试点研究评估低到高载荷的窟溶解产物。

统计数据
比较两种治疗多个组织在细胞培养和分子生物学研究是由单向方差分析与评估posthoc Dunnett测试对比组的控制(圣地亚哥PrismGraph 4.0, GraphPad CA)。人类窟肥胖基因表达的结果,重复测量双向方差分析是用来评估的影响肥胖、窟仓库,和肥胖x得宝互动:在变量存在显著的交互作用,posthoc Bonferroni测试使用。未配对测试被用来检测安慰剂,pioglitizone-treated团体之间的显著差异对窟目标基因转录水平的变化治疗后,或者当比较agonist-treated与控制HepG2细胞PPAR同种型研究。基因表达微阵列研究比较Tusc5窟2型糖尿病治疗服用tzd、配对测试了荧光信号的值进行比较预处理和后处理。意味着介绍了SEM,被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。实验建立小鼠TUSC5 PPAR基因位点目标

以前,我们观察到3 t3-l1脂肪细胞短期(24小时)和长期(7 d)治疗与non-thiazolidinedione GW1929在一个高剂量增加Tusc5信使rna和蛋白质丰度(2]。确保通过PPAR这种感应激活,而不是特定于GW1929不相干的事件,剂量反应研究进行了使用两种不同的PPAR 3 t3-l1脂肪细胞成熟分化受体激动剂(GW1929和troglitazone)显示大效能差异PPAR的水平绑定和激活(GW192935 -强66倍;参见[6分子)和代表non-thiazolidinedione TZD类,分别。如图1,这两个受体激动剂增加Tusc5 mRNA丰富决定控制超过200%的,与troglitazone vehicle-treated细胞,大约50倍电子商务₅₀而GW1929。也建立了PPAR mRNA水平变化目标基因,aP2显示相同的模式为Tusc5所看到的。Tusc5蛋白质水平也增加了受体激动剂治疗(补充图在网上补充材料doi: 10.1155 / 2009/86768)。Tusc5基因表达的激活剂,以及电子商务的大小₅₀差异与已知的效力的绑定和激活PPAR这些分子符合Tusc5是选择性地受PPAR的概念激动。

寻找潜在的(PPAR根据DR1网站响应元素)启动子地区的鼠TUSC5透露至少三个潜在的网站(相对于启动密码子,+ 1)约为−1.1 kb (AGGTCATAGGCCA: 1162年1174−−)−1.8 kb (AGGTCAGAGGTTG: 1829年1840−−)和−8.4 kb (AGGTCATTGGTAA: 8467−−8455)。确定PPAR蛋白质与TUSC5交互过程中启动子正常3 t3-l1脂肪细胞的分化,芯片的研究专注于根据DR1网站进行绑定,在分化(0)和4和8 d post-initiation脂肪细胞的分化。PPAR蛋白结合在假定的网站根据DR1−1.8 kb没有检测到任何条件下(数据没有显示)。强烈的PPAR绑定−1.1 kb观察到网站,但仅是暂时性的,在第四天(图2)。可见但非常温和的绑定−8.4 kb网站可以发现,只在第四天(图2)。因为染色体的特定区域组蛋白乙酰化是一个重要因素在促进DNA转录因子的可访问性,PPAR组蛋白乙酰化作用的大小绑定的网站。有更高的组蛋白乙酰化作用的假定的根据DR1−1.1 kb−8.4 kb场所与脂肪形成的进展,但这不是明显non-DR1地区(图2在假定的)或根据DR1网站没有绑定PPAR−1.8 kb(数据没有显示)。

考虑到强劲的诱导小鼠脂肪细胞药理学PPAR Tusc5 mRNA和蛋白水平受体激动剂在细胞培养(图1和补充图),我们认为,如果这些是可翻译的临床,Tusc5转录和蛋白质丰度会增加人类2型糖尿病志愿者的皮下窟对待thiazolidinediones噻唑烷二酮类)。然而,如图3,Tusc5窟转录丰度并没有增加长达吡格列酮治疗,与增加观察转录水平的PPAR建立目标基因PEPCK1和LPL (和、职责)。引人注目的是Tusc5基因表达变化的大变化随着时间的推移在安慰剂——和pioglitizone-treated科目。使用一个子集的患者来说,存档窟是用于测量Tusc5蛋白质丰富,符合mRNA结果大Tusc5表达的人与人之间的差异和没有吡格列酮治疗对Tusc5蛋白质含量相比预处理和后处理窟(补充图)。

微阵列基因表达的结果从一个单独的队列的2型糖尿病患者接受pioglitizone 12周也没有增加Tusc5窟的转录水平相比预处理和后处理匹配样本(任意的荧光信号单位):与分别在预处理和后处理()。然而,在受试者使用罗格列酮治疗相同的时间但是,有一个趋势增加Tusc5 mRNA表达:与()。

3.2。PPAR的影响可以忽略不计激动Tusc5表达式的上下文之外脂肪细胞

Tusc5独特的组织特异性表达的基础还有待开发,但健壮的PPAR Tusc5基因表达的激活受体激动剂在小鼠脂肪细胞促使我们考虑是否缺乏表达在某些组织内生PPAR源自有限表达式。为了解决这个问题,我们检查是否PPAR的操纵表达肝细胞可能引发Tusc5表达式。

伺机首先,我们研究了存档来自小鼠肝脏样本处理包含LacZ控制超表达腺病毒结构或病毒传递PPAR1、主要的PPAR在肝脏和其他nonadipocyte细胞(12),或PPAR2 (13),主PPAR在脂肪细胞类型。正如预期的那样,我们发现明显PPAR的感应信使rna表达PPAR的肝脏1或PPAR相对于控制(图2 adenovirus-treated老鼠4符合之前发表报道,使用这些示例:[12,13]),表明成功交付的转录因子在体内肝脏。整个肝脏的准备工作可以表达PPAR微量的信使rna目标基因脂联素(AdipoQ,可能来自Kuppfer细胞),并遵循PPAR的过度同种型脂联素的相对丰度大大增加相对而言(图4像预期的那样),根据之前的报告使用这些肝脏样本(12,13]。值得注意的是,虽然大相对而言,仍AdipoQ感应导致mRNA丰富1%的样本,测量小鼠窟并行分析(数据没有显示)。相比之下,微量肝Tusc5 mRNA丰富并不是增加了PPAR的过度1(图4左面板)和仅略有增加%控制PPAR的微量水平2-overexpressing老鼠(图4右面板)。总的来说,这些结果表明,PPAR增加2活动,但不是PPAR1活动,在小鼠肝体内能诱导Tusc5基因表达,但只有一小部分的水平通常决定在小鼠窟和两个数量级少相对而言为AdipoQ观察到的感应。

其次,在另一组研究解决Tusc5表达式是否可以诱导non-adipocytes overexpressing PPAR,人类HepG2肝母细胞癌包含Tet-off构造稳定的细胞系(HepG2-tet-off-hPPAR细胞:PPAR亚型,,1,2)检查PPAR表达诱导条件下,有或没有治疗特定的配体来触发PPAR同种型活动。模仿那些前面描述的条件证明成功诱导PPAR目标基因在这个模型(14]。与积极的控制人类窟cDNA并行分析,Tusc5 mRNA在HepG2细胞无法探测在所有条件下(瘦素和脂联素AdipoQ /成绩单也没有检测到)。缺乏Tusc5感应HepG2细胞与各种PPAR目标基因诱导的条件下PPAR激活(表1)。其中,PEPCK1和ADFP被所有PPAR激动剂治疗诱导强烈isoform-expressing细胞。ACOX1和CPT1b被PPAR诱导激动,但有趣的是ACOX1也显著增加了PPAR和PPAR受体激动剂在细胞中表达的转录因子。CPT1b转录水平,相比之下,没有增加了PPAR激活。

3.3。缺乏Tusc5编码序列多态性与窟协会在人类肥胖基因表达

影响人类的肥胖和窟得宝网站Tusc5 mRNA的表达
与皮下脂肪组织(SC)和内脏(网膜的)mRNA样本人群肥胖和nonobese法国女性,先前描述的表达谱研究脂肪11ß-hydroxysteroid脱氢酶(15)和-核蛋白-(16),被用来确定Tusc5是否差异表达在人类肥胖或跨脂肪仓库。相对于非肥胖SC窟Tusc5 mRNA丰富20%减少肥胖SC和内脏窟(图5肥胖),但这温和的影响无统计学意义。一个重要得宝效果()和仓库肥胖交互()是观察,解释为显著降低Tusc5表达式的内脏和SC窟非肥胖受试者在肥胖人群中没有观察到(图5)。

TUSC编码变异在人类肥胖和苗条
我们测序TUSC5外显子和内含子/外显子边界在非常瘦,非常肥胖受试者是否罕见或常见的编码变异与人类肥胖的差异有关。五个错义和两个突变引起的,而是每个瘦没有差异的基因型频率和肥胖的人,并没有发现(表胡说或移码突变2)。两个罕见变异预测保守氨基酸序列(V109V & A167A)。一个罕见的错义突变(A18T)导致替换卸货,极地苏氨酸为非极性的疏水性丙氨酸有等位基因频率的0.017和0.016在肥胖和苗条的人。其他几个比较常见的错义突变观察:脯氨酸卸货极地丝氨酸(P15S),非极性疏水性苯丙氨酸(S20F)丝氨酸,无电荷的极性甘氨酸,丝氨酸(G57S)。最后,6精益和3肥胖受试者杂合的一种罕见的错义突变携带者(I106T),将导致从非极性疏水性异亮氨酸苏氨酸,和这个序列变异中高度保守的CD225 Tusc5领域(见图6)。氨基酸的变化与突出显示了这些错义突变有关哺乳动物Tusc5对齐(图6),尤其是上述S20F和G57S变体也观察到在人类Tusc5基因库蛋白质序列条目。

4所示。讨论

Tusc5显示一个有趣的生物学,它是强劲coexpressed脂肪细胞和外周传入神经元,但是它的作用仍然是难以捉摸的,很少有人了解Tusc5的分子调控基因的表达。发现迄今为止表明冷环境温度显著降低啮齿动物窟和蝙蝠Tusc5 mRNA水平,和增加Tusc5表达式在白色和棕色脂肪细胞脂肪形成2,4,5]。Tusc5表达式的cold-suppression似乎没有通过激活3-adrenergic受体(5]。Tusc5基因表达的调节由一个PPAR的浓度未成熟和成熟3受体激动剂GW1929 t3-l1脂肪细胞(2)让我们来评估小鼠TUSC5基因是否是一个真正的PPAR目标基因。PPAR目标明确或脂肪细胞中高度表达通常涉及重要的途径代谢调节,所以Tusc5的生物学特征及其与PPAR协会应进一步说明它在新陈代谢和脂肪组织功能中的作用。

结果在此确认鼠TUSC5 PPAR基因目标在脂肪细胞和强调TUSC5基因之间的相互关系和PPAR是相当复杂的。首先,剂量反应实验3 t3-l1脂肪细胞使用TZD PPAR激动剂(troglitazone)和一个non-TZD (GW1929)导致显著增加Tusc5 mRNA丰富,电子商务₅₀差异匹配PPAR已知的这些化合物的效能受体(见[6])。这表明,老年病Tusc5表达的这些化合物并不是因为脱靶效应,而不是特定的受体激动剂类。第二,染色质免疫沉淀反应研究内生小鼠PPAR证明直接绑定一个预测TUSC5根据DR1网站强烈(−1.1 kb PPAR-response元素),另一个弱(−8.4 kb网站)在3 t3-l1脂肪形成。虽然这些结果证明PPAR之间发生的相互作用和小鼠TUSC5基因3 t3-l1脂肪细胞,PPAR绑定到小鼠TUSC5启动子元素是瞬态(图2),只发现在脂肪细胞成熟的中期发展阶段(第四天post-differentiation)而不是更多的成熟脂肪细胞(8天)。这不是已知的基础,但时间的内源性配体浓度的变化和/或PPAR活化剂/阻遏蛋白的变化DNA结合可能的解释。后者有先例。PPAR的活动在LPL基因启动子是减毒在复杂的配体形成PPARhypophosphorylated视网膜母细胞瘤(RB)蛋白和组蛋白脱乙酰酶3 (HDAC3) [18]。这种抑制复杂脂肪生成stage-dependent,这样在脂肪生成(即。在第四天),hyperphosphorylation RB最小化复杂地层(从而使最大PPAR活动LPL启动子),但后来在脂肪生成(在第8天)PPAR-RB-HDAC3复杂地层更明显(18]。然而,LPL的表情依然强劲在充分发展组织(2,18,19),这表明其他因素维持PPAR LPL表达的减少绑定到LPL启动子在脂肪生成。它还有待在将来的研究中建立PPAR-RB-HDAC3交互发挥作用的时间规定TUSC5基因位点的成熟脂肪细胞。

有一些支持想法更多的根据DR1网站参与驱动净Tusc5基因表达。耦合与全基因组芯片花砖数组(ChIP-chip方法)在完全成熟,10天postdifferentiated 3 t3-l1脂肪细胞,拉扎尔和他的同事发现了三人UTR PPAR小鼠TUSC5基因上的结合位点(见PPAR_4579 PPAR_4580, PPAR_4581补充表在[20.])。这些调查人员没有遵守PPAR绑定到−1.1 kb根据DR1站点,没有意想不到的考虑我们的研究结果表明,脂肪形成的约束力下降后4天。额外的网站在第一内含子TUSC5也观察到在进一步检查原始ChIP-chip数据(Lefterova和麻风病患者、个人通信),和intronic PPAR联想能明显影响基因表达(即。视黄醇saturase, (21])。因此,进一步的研究采用多种TUSC5 promoter-intronic-luciferase构造有或没有PPAR配体的治疗需要帮助解开这些PPAR如何结合位点单独或结合改变基因的表达。

PPAR之间的复杂关系和Tusc5进一步凸显了投机取巧的存档窟样本分析2型糖尿病患者治疗的临床研究PPAR 11周受体激动剂吡格列酮(8),我们没有检测增加窟Tusc5信使rna定量PCR或蛋白质尽管增加其他目标基因的表达(图3)。脂肪组织微阵列表达数据从不同的人类2型糖尿病TZD研究证实上述观察吡格列酮治疗不会增加Tusc5 mRNA水平。相比之下,罗格列酮倾向于增加Tusc5 mRNA水平,但这是高度可变的个人测试。后一种观察可能是由于ligand-selective基因调控(即。,(22])所解释的选择性PPAR调制器(SPPARM)模型(23]。在这种模式下,配体PPAR可以假设ligand-specific分子三维结构,赋予ligand-specific通过微分代数余子式互动和DNA binding-specificity转录活动。PIO的缺乏影响触发窟Tusc5表达人类军团(与健壮的增加小鼠脂肪细胞)可能指向潜在Tusc5-PPAR种专一性差异协会或大变化在这个协会在个人不同的代谢状态或疾病严重程度。最后,考虑到样本获得只在一个计算末吡格列酮治疗后,有可能是窟Tusc5表达积极监管在早期TZD治疗的更有活力的阶段。

几个PPAR目标基因,包括脂肪细胞脂联素标志,可以诱导non-adipocytes PPAR的实验过度,表明后者是充分的激活“adipocyte-specific”基因表达外脂肪组织的上下文。例如,adenoviral PPAR交付1在小鼠肝脏明显增加脂联素mRNA水平和增加肝脏脂肪堆积(12]。同样,adenoviral PPAR的注入2在老鼠身上导致肝脏脂肪生成的几个PPAR的表型和归纳目标基因(13]。我们推断Tusc5表达式,就像经典的PPAR目标脂联素表达PPAR应该上调在肝癌亚型。然而,肝脏后肝PPAR Tusc5信使rna变化超表达体内名义在最好的情况下,特别是当相比,大规模相对增加脂联素mRNA水平。Tusc5不能诱导的表达在人类肝细胞细胞系HepG2即使演习PPAR活动增加,因此各种PPAR目标基因的表达(表2;也看到[14])。这些结果表明,与脂联素和其他一些PPAR目标基因因素存在于脂肪细胞,但缺乏肝脏所需Tusc5基因的诱导内源性或药物PPAR受体激动剂。non-adipocyte细胞类型,强烈表达Tusc5外围传入神经元,这将是有趣的,以确定是否可以增加了PPAR Tusc5表达式在这些细胞受体激动剂。

类似于模式观察其他基因标志着脂肪细胞成熟过程(脂联素,ADD1 aP2,例如)(24),我们已经证明,早在脂肪生成组蛋白乙酰化作用在Tusc5 PPAR结合位点的增加。这种特有的染色体修饰与基因调控因素包括PPAR的访问,最好的例子就是细胞周期蛋白D1 PPAR的抑制绑定LPL和aP2根据DR1网站通过HDAC招聘和减少组蛋白H3乙酰化作用[25,26]。增加脂肪细胞基因的组蛋白乙酰化作用,部分原因是明显下调的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)酶水平和减少交互的HDAC成熟脂肪细胞标志基因位点几天后诱导3 t3-l1脂肪细胞分化[24]。值得注意的是,从有限的转变Tusc5基因组蛋白乙酰化作用preadipocytes乙酰化增加了至少4天开始后脂肪细胞的分化和感应Tusc5动力学是一致的在这个细胞基因表达模式2]。因此,这些结果与假设一致Tusc5表情,像其他基因在脂肪生成程序触发,在PPAR监管通过增加组蛋白乙酰化作用在小鼠Tusc5基因染色体结合位点。有趣的是,PPAR绑定Tusc5启动子是瞬态尽管维护组蛋白乙酰化作用在3 t3-l1脂肪细胞成熟,根据DR1网站表明乙酰化作用,因此伴随的转录因子可访问性这些网站不单独解释颞PPAR的变化绑定。

尽管新兴证据Tusc5在脂肪细胞的作用函数,健壮的窟表达的基因,其被PPAR监管在培养的脂肪细胞受体激动剂,它不知道如果Tusc5表达式或活动与肥胖表型相关。只有一个其他研究解决这个问题,使用Zucker脂肪大鼠瘦素缺乏适当的信号,因此变得非常肥胖:Tusc5信使rna和蛋白质含量略微增加皮下窟,在肠系膜不变,但大大减少在附睾的窟4]。我们观察到成年肥胖和非肥胖女性之间没有显著差异的窟Tusc5转录水平(图5)。TUSC5编码序列变异的频率在758年精益和肥胖志愿者决定如果罕见或常见变异与人类身体成分表型。数个snp,但这些并没有不同的频率相比精益和肥胖受试者(见表2)。突变导致氨基酸残基改变守恒在哺乳动物Tusc5 orthologues CD225域(或)预计将导致physiologically-important蛋白质功能变化,特别是I106T转变一个高度保守的部分CD225域检测,介绍了一个带电残留在那个网站(图6)。的功能的影响还有待评估。因此,我们的结果不支持假设窟基因表达差异或编码在TUSC5多态性与精益或肥胖表型有关。

总之,这些实验建立了小鼠TUSC5基因是PPAR在脂肪细胞调控位点,但这种联系是否发生在人类脂肪细胞还有待建立。的PPAR-TUSC5互动是高度复杂的,temporally-regulated在脂肪生成,包括组织特定的驱动因素表达的基因在脂肪细胞实验PPAR在回应激动。没有证据表明Tusc5窟表达差异的一个主要角色在肥胖发展,虽然我们确定几个错义Tusc5基因的突变位点,没有大的人类群体与肥胖有关。Tusc5生物学因此,未来的研究应该少关注协会的蛋白质与脂肪组织大量表型和更多参与脂肪细胞功能的其他方面。

确认

第一和第二作者的贡献同样这项工作。作者要感谢Drs。丹尼尔·克雷格•h .狱长黄,米切尔a . Lazar佩德罗·f·马雷罗,迭戈哈罗德,玛蒂娜Lefterova有用的编辑和翻译输入的手稿和表达感谢塔玛拉·n·邓恩女士技术援助。作者还感谢Len a . Pennacchio博士实验室的DNA测序的努力Tusc5在精益和肥胖的科目。利益冲突:没有利益冲突声明。这项工作的部分资金由以下几点:校内USDA-ARS项目5306 - 51530 - 016 - 00 - d和维生素的情况下消费结算资金chnr08 - 801 (S.H.A.),韩国的干细胞研究中心21世纪的前沿研究项目(sc - 3230)和韩国国家研究基金会由政府(最高明的)(2009 - 0091913)(J.B.K),授予DK083163和GM23750 (J.K.R.),和HSFO na - 5413(智慧)。主题为序列变异工作招聘的部分资金支持智慧化和葛兰素史克公司的r。

补充材料

引用

1. h . Konishi m . Sugiyama k .美津浓et al .,“详细描述一个纯合子地删除区域对应一个候选人在远端肿瘤抑制轨迹17 p13.3在人类肺癌,”致癌基因,22卷,不。12日,第1905 - 1892页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. p . j .奥尔特c . h .狱长t·k·鲍曼t·a·诺特和s h·亚当斯”Tusc5的描述,一个脂肪细胞基因中的神经元,外围”分子和细胞内分泌学,卷276,不。1 - 2,巢族,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. g . a . Deblandre共和党Marinx s . s . Evans et al .,”表达的克隆interferon-inducible 17-kDa膜蛋白参与细胞生长的控制,”《生物化学》杂志上,卷270,不。40岁,23860 - 23866年,1995页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. t .柴田h . Koide r . Hayashi et al .,”老鼠大脑内皮细胞衍生的分子克隆和表征基因1(肿瘤抑制候选人5)表达在脂肪组织,”分子和细胞内分泌学,卷263,不。1 - 2,38-45,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. h . Koide t柴田:山田et al .,“肿瘤抑制候选人5 (TUSC5)是棕色脂肪细胞中表达,“生物化学和生物物理研究通信,卷360,不。1,第145 - 139页,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. k·k·布朗,b·r·亨特s·g·布兰查德et al .,“过氧物酶体小说N-aryl酪氨酸活化剂proliferator-activated受体-$\mathrm{吗?}$的糖尿病表型逆转Zucker糖尿病脂肪老鼠,”糖尿病,48卷,不。7,1415 - 1424年,1999页。视图:谷歌学术搜索
7. j·b·Seo m . j .能剧,e . j . Yoo et al .,“人类抵抗素启动子的功能描述与脂肪细胞的决心,differentiation-dependent因素1 /固醇调节元件结合蛋白1 c和CCAAT增强子结合蛋白-$\mathrm{一个}$”,分子内分泌学,17卷,不。8,1522 - 1533年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. 谢Bogacka, h·g·a·布雷和s . r .史密斯”,吡格列酮的影响在过氧物酶体proliferator-activated受体-$\gamma$目标基因与脂肪储存在体内,“糖尿病护理,27卷,不。7,1660 - 1667年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. j·g·k . Bandyopadhyay j·g . Yu Ofrecio,和j . m . Olefsky malonyl-CoA水平肌肉增加肥胖和2型糖尿病受试者导致脂肪酸氧化,增加脂肪生成减少;thiazolidinedione治疗逆转这些缺陷。”糖尿病,55卷,不。8,2277 - 2285年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. j·g . Yu s Javorschi a . l . Hevener et al .,“thiazolidinediones在血浆脂联素水平的影响正常,肥胖和2型糖尿病,”糖尿病,51卷,不。10日,2968 - 2974年,2002页。视图:谷歌学术搜索
11. a d·d·西尔斯·g·萧,萧et al .,”机制的人类胰岛素抵抗和thiazolidinedione-mediated胰岛素敏感,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷106,不。44岁,18745 - 18750年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. s . Yu k . Matsusue p Kashireddy et al .,”老鼠Adipocyte-specific基因表达和脂肪形成的脂肪变性肝由于过氧物酶体proliferator-activated受体$\mathrm{吗?}$1 (PPAR$\mathrm{吗?}$1)超表达。”《生物化学》杂志上,卷278,不。1,第505 - 498页,2003。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. 山田k Uno, h片瞳,t . et al .,”神经通路从肝脏调节能量消耗和系统性胰岛素敏感性,”科学,卷312,不。5780年,第1659 - 1656页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. 立花,k . y .小林,田中t . et al .,“基因表达分析潜在的过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR)目标基因在人类肝胚细胞瘤细胞系诱导表达不同的PPAR亚型,”核受体,3卷,第三条,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. r . Desbriere诉Vuaroqueaux诉Achard et al .,”11$ß$-hydroxysteroid脱氢酶1型mRNA增加内脏和皮下脂肪组织的肥胖患者,”肥胖,14卷,不。5,794 - 798年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. p . j .奥尔特·t·a·诺特m . Grino等。”$\mathrm{吗?}$-核蛋白是一个adipocyte-neuron基因的协调表达瘦素和增加人类肥胖,”营养学杂志》,卷138,不。5,841 - 848年,2008页。视图:谷歌学术搜索
17. n . Ahituv n . Kavaslar w . Schackwitz et al .,”一个PYY组Q62P变异与人类肥胖,”人类分子遗传学,15卷,不。3、387 - 391年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. l . Fajas诉egl, r . Reiter et al .,“retinoblastoma-histone脱乙酰酶抑制PPAR 3复杂$\mathrm{吗?}$和脂肪细胞的分化。”细胞发育,3卷,不。6,903 - 910年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. r·f·莫里森和s . r .农民”的角色PPARgamma在调节级联的表达细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,p18 p21 (INK4c)和(Waf1 / Cip1),在脂肪生成,“《生物化学》杂志上,卷274,不。24日,第17097 - 17088页,1999年。视图:谷歌学术搜索
20. 张Lefterova, y, PPAR d . j . Steger et al。。$\mathrm{吗?}$和C / EBP因素编排脂肪细胞生物学通过相邻绑定在全基因组范围内,“基因和发展,22卷,不。21日,第2952 - 2941页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. m·思楚普Lefterova, j . Janke et al .,“视黄醇saturase促进脂肪生成和表达下调在肥胖,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷106,不。4、1105 - 1110年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. d·d·西尔斯萧,j . m . Ofrecio j·查普曼,w .他和j·m·Olefsky“选择性调制的启动子招聘和PPAR的转录活动$\gamma$”,生物化学和生物物理研究通信,卷364,不。3、515 - 521年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. j . m . Olefsky”治疗胰岛素抵抗与过氧物酶体proliferator-activated受体γ激动剂”《临床研究杂志》上,卷106,不。4、467 - 472年,2000页。视图:谷歌学术搜索
24. e . j . Yoo j j。钟,s s崔承哲,k . h . Kim和j·b·金”下调的组蛋白去乙酰酶抑制剂刺激脂肪细胞的分化,《生物化学》杂志上,卷281,不。10日,6608 - 6615年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. m·傅m . Rao t·布拉绸et al .,“细胞周期蛋白D1抑制过氧物酶体proliferator-activated受体$\mathrm{吗?}$通过招聘组蛋白脱乙酰酶介导的脂肪形成,”《生物化学》杂志上,卷280,不。17日,第16941 - 16934页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. m·m·傅c . Wang Rao et al .,“细胞周期蛋白D1压制p300 transactivation通过细胞周期蛋白依赖性kinase-independent机制,“《生物化学》杂志上,卷280,不。33岁,29728 - 29742年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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