文摘

罗格列酮(RGZ) thiazolidinedione配体的过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR) -,最近被描述为拥有antitumoral属性。我们调查RGZ对细胞增殖的影响在两个细胞系模型(SW13和H295R)人类的肾上腺皮质癌(ACC)及其相互作用的信号通路激活IGF-I受体(IGF-IR)。我们将演示高表达的两个细胞系和ACC IGF-IR。细胞增殖是由IGF-I刺激剂量和时间的方式,由RGZ抑制。分析的主要IGF-IR激活胞内信号通路下游,磷脂酰肌醇3-kinase (PI3K)一种蛋白激酶,和细胞外signal-regulated激酶(ERK1/2)级联显示RGZ迅速干扰一种蛋白激酶和ERK1/2磷酸化/激活介导IGF-I刺激增殖。总之,我们的研究结果表明,RGZ对人类ACC细胞增殖的抑制作用干扰和PI3K / Akt ERK1/2 IGF-IR下游信号通路的激活。

1。介绍

肾上腺皮质癌(ACC)是一种罕见肿瘤的发病率每年大约1 - 2每百万人口。ACC是一个非常积极的肿瘤,预后不良:大约有50%的病人不超过2年的诊断和5年死亡率为20%至60% (1]。其不良预后主要取决于有限的医疗资源。目前,一个完整的手术切除后肿瘤的早期诊断是唯一有价值的选择的治疗方法。此外,除了改善手术管理,ACC的预后明显没有改变在过去的三十年里(2]。抗肿瘤,事实上,广播和化疗和医疗很少导致完全缓解复发或转移性传播。尽管最近提出了新的医学治疗选项(3],目前先进的医疗ACC远非令人满意,由于我们可怜的知识分子机制导致肾上腺皮质细胞的恶性转化。事实上,尽管一些细胞内信号通路已经被证明在ACC细胞改变(4),努力识别事件导致肿瘤转化和肿瘤侵袭性已经会见了有限的成功。调停IGF-I系统扩散的作用和发展已有详细记载在几个癌症,包括肾上腺皮质癌(5]。特别是,ACC,以及H295R细胞系(6),过表达IGF-II [7]及其混杂受体IGF-IR [8)相比,肾上腺腺瘤和正常肾上腺组织。过表达IGF-II被认为法案以旁分泌的方式通过IGF-IR维持肿瘤细胞增殖(6,9,10]。

过氧物酶体扩散者激活受体(PPAR) -γ是一个ligand-activated transcriptor因子和核激素受体家族的一员。噻唑烷二酮类),这是一个家庭的PPAR -γ介绍了配体,在2型糖尿病的治疗(T2D),因为他们减少胰岛素抵抗的能力。在过去的几年里,越来越多的实验数据显示这些药物的能力施加额外的多效性的行为,如炎症过程的监管和癌症细胞生长已经发表(11]。

TZD效果似乎主要是由于他们绑定并激活PPAR的能力γ差异表达的脂肪和其他组织。在配体结合,PPARγ二聚化的9-cis视黄酸受体(RXR)特定响应元素在葡萄糖和胰岛素基因启动子的体内平衡,脂质代谢和细胞分化。除了这个transactivating活动,涉及PPAR ligand-dependent转录transrepression机制γ/ RXR复杂的被描述。根据这样一个模型,受体二聚化压制基因转录dna结合蛋白独立地通过物理隔离激活转录因子或辅活化因子(12]。最近,越来越多的TZD效果,特别是抗肿瘤药的,已经被证明是PPAR独立的γ活动(13]。最后,快速nongenomic服用tzd的活动,而不是导致调制基因转录,但影响转译后的修改参与细胞信号,已报告(14]。

服用tzd除了他们的行动是胰岛素增敏剂,抑制细胞生长在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺、胰腺、胃、甲状腺、肝脏、肾上腺肿瘤(15]。然而,这样的药理作用的分子机制还有待阐明。

罗格列酮(RGZ)和吡格列酮(PGZ),两个最广泛使用的PPARγ受体激动剂,已被证明人类肾上腺抑制生长和侵袭性癌症细胞系H295R [16)以及诱导细胞分化和凋亡10]。此外,H295R细胞正常和tumoral肾上腺组织表达PPARγ,没有水平的差异表达tumoral和正常组织之间没有相关性的临床参数如肿瘤大小、激素水平等(10,16]。

在这项研究中,我们研究两个不同的ACC细胞模型,即SW13 H295R行,是否TZD RGZ可能发挥其抗增殖作用对人类ACC细胞系IGF-IR通过干扰细胞内途径激活。

2。材料和方法

2.1。试剂

Anti-phospho [Akt (Ser473) ERK1/2 (T202 / Y204)]和anti-Akt抗体从细胞信号技术,Inc .(美国质量丹弗斯)。Anti-ERK1/2, anti-IGF-IRβ,anti-actin抗体来自圣克鲁斯生物技术有限公司(美国加州Santa Cruz)。Anti-PI3K p85调节亚基抗体来自北部生物技术(美国纽约普莱西德湖)。罗格列酮是亚历克西斯生化药剂(美国加州圣地亚哥)。MTS的解决方案是购自Promega(美国威斯康星州麦迪逊)。IGF-I从西格玛奥德里奇(美国密苏里州圣路易)。[甲基-³胸苷H] ([³H] TdR)购买从NEN生命科学产品(美国波士顿、质量)。NVP-AEW541由诺华提供(瑞士巴塞尔)。

2.2。组织标本和细胞培养

总共三个正常人的肾上腺,三个肾上腺癌,和三个腺瘤被用于这项研究。正常肾上腺被移除在扩大切除术由于肾癌或从器官捐赠者(32 - 72岁)。批准使用人类的材料是由当地伦理委员会。从每个病人知情同意了。肾上腺皮质的片段,收集后立即手术,在液氮快速冻结和存储80年^°C。

人类ACC H295R细胞系和SW13得到来自美国文化类型集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。SW13 DMEM / F-12培养基培养(Sigma-Aldrich)以10%的边后卫(Euroclone), 2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100克/毫升链霉素。H295R需要DMEM / F-12中富含的混合胰岛素/转铁蛋白硒(Sigma-Aldrich)。在37个细胞被孵化^°C湿润有限公司5%₂的气氛。

Subconfluent细胞饥饿24小时处理不同刺激无血清培养基。罗格列酮与IGF-I同时添加,在剂量和时间间隔(15分钟的免疫印迹分析和扩散实验24小时7天)表示在图传说。

细胞进行预处理与NVP-AEW541 1小时前添加其他刺激。对孵化项目超过24小时,每天被媒体和刺激。

2.3。MTS试验

SW13和H295R被播种在96孔板的密度0³和0³细胞/好,分别。24小时后采用无血清饥饿(SF)中,细胞治疗与不同刺激的科幻小说中表示时间(参见图传说)和细胞数量在每个被MTS试验(Promega)评估,根据制造商的指示。ELISA板样本分析的读者(Wallac 1420 - PerkinElmer)在490 nm波长测量光密度(OD)。每个实验点了一式五份至少在三个独立的实验。

2.4。细胞增殖检测

2.4.1。活细胞计数

细胞被播种在12-well板块(1,0⁴和0⁴细胞/对SW13和H295R,职责),24小时之后饥饿治疗2或4天在科幻小说中,然后trypsinizedand计入血球计。手机号是通过计算获得一式三份在三个不同的实验。死细胞被台盼蓝排斥试验排除在外。

2.4.2。DNA合成试验:(³H]胸苷吸收

DNA合成是根据评估的数量(³H]热带病研究和培训特别规划纳入三氯乙酸(TCA)沉淀材料。种子细胞在不同密度(0⁴或2,0⁴H295R细胞/在12或24孔板,0⁴SW13细胞/ 12孔板)的边后卫完全培养基生长在10%到70%的融合。24小时的饥饿后,细胞治疗与IGF-I或RGZ表示在1%的边后卫介质乘以(1 - 7天)脉冲1.0Ci /毫升(³H]热带病研究和培训特别规划(6.7 Ci /更易)前4小时停止扩散在冰冷的10%柠檬酸。在柠檬酸然后在甲醇洗涤后,细胞在0.2 N氢氧化钠可溶性,放射性测量闪烁计数器。实验进行了一式三份,至少重复三次。

2.5。免疫印迹分析

对提取细胞裂解缓冲(20毫米三,pH值7.4,150毫米氯化钠,特里同x - 100 0.5%, 1毫米Na₃签证官₄1毫米PMSF)。三十g蛋白质的衡量Coomassie试剂(美国加州BIO-RAD实验室,大力神)被加载到8 - 10%减少sds - page。分离后,蛋白质转移到硝化纤维膜被封锁在室温1小时5%的脱脂牛奶ttb (Tween-20 0.1%, 20毫米三,150毫米氯化钠)和孵化隔夜主要抗体在适当稀释紧随其后peroxidase-secondary免疫球蛋白(1:3000)。蛋白质被BM-enhanced化学发光显示系统(罗氏诊断、米兰、意大利)。图像采集与光密度分析进行数量上的一个软件ChemiDoc XRS仪器(美国加州BIO-RAD实验室,大力神)。所有的西方的屁股在至少3独立重复实验。膜re-probing剥离后执行程序(美国皮尔斯,罗克福德,Il)。

PI3激酶试验
对提取细胞裂解缓冲(20毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4,137毫米氯化钠,CaCl 1毫米₂1毫米MgCl₂,1% NP-40, 1毫米Na₃签证官₄1毫米PMSF)。蛋白质测量后,包含相同数量的蛋白质(300整除50 g)是事先批准蛋白质G-Sepharose l。事先批准溶解产物在一夜之间被免疫沉淀反应在4^°C与3克的兔子anti-p85 PI3K 50抗体的存在蛋白质A-Sepharose l。琼脂糖珠洗在10毫米Tris-HCl EGTA (pH值7.4)包含0.1毫米和5毫米氯化锂,悬浮在一个激酶缓冲区(10毫米Tris-HCl 150毫米氯化钠5毫米EDTA)包含20g (L -α磷脂酰肌醇(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),MgCl 25毫米₂和10Ci (γ³²P] ATP和孵化20分钟在室温下。反应是停止的60l 6 M盐酸+ 160l (chlorofor乙醇(1:1)。脂质被解决通过薄层色谱板(薄层色谱硅胶60)(默克Laborchimica,佛罗伦萨,意大利)在氯仿、甲醇、水和氢氧化铵(60:47:11 3:2)。干TLC表是由放射自显影法。乐队进行量化与ChemiDoc XRS仪器(美国加州BIO-RAD实验室,大力神)。

2.6。统计分析

结果表示为±SE。不同浓度的影响IGF-I和RGZ对细胞增殖是由单向方差分析进行测试。多个事后比较是由Bonferroni调整。学生的以及成对或未配对的数据是在适当的时候申请的比较两组数据。被认为是重要的。

3所示。结果

肾上腺肿瘤的特点是增加表达IGF-IR相比nontumoral和adenomal肾上腺组织所证明的特定抗体的免疫印迹分析β亚基的IGF-IR(图1(一))。明显的表达这种受体也存在于SW13特别是H295R肾上腺皮质肿瘤细胞(图1(一)),这表明这两个组织和细胞系统可能是积极响应IGF-I和IGF-II的影响。

为了研究IGF-IR的作用,其下游的细胞内信号通路在细胞增殖,刺激SW13和H295R细胞受体的选择性配位体浓度增加,IGF-I。IGF-I能够诱导细胞增殖以时间和剂量依赖性的方式,评估细胞生存能力通过MTS试验SW13(图所示1 (b))和H295R(图1 (c)浓度增加)细胞刺激IGF-I(1到50 nM) 24小时7天。这样的刺激效果确认(³H]胸苷吸收实验H295R细胞(图1 (d))。

24小时的治疗后,RGZ减少细胞生存能力在SW13细胞治疗剂量依赖性的方式(图2 (b))(图2(一个))与10 nM IGF-I,显示一个集成电路₅₀的米(变异系数6.9%)计算ALLFIT项目(17),图2 (c)。有趣的是,集成电路₅₀年代来自两个RGZ剂量反应曲线获得IGF-I-treated可行性和未经处理的细胞不是统计不同,表明RGZ的影响独立于外源性IGF-I刺激相似。因此,我们选择使用20M RGZ在所有的实验。RGZ对细胞增殖的抑制作用基底条件显著增加孵化所评估的时间(³H]胸苷吸收实验在SW13(图2 (d))和H295R(图2 (e))细胞。对细胞生存能力的负面影响所RGZ IGF-I处理和未经处理的SW13细胞(类似数据3(一个)- - - - - -3 (e))。相反,在H295R细胞RGZ需要更长时间的影响变得明显,RGZ也能够恢复IGF-I-stimulation(数字3 (f)- - - - - -3 (h))。IGF-I-stimulated扩散和RGZ的抑制效果都证实了SW13(图3(我))和H295R(图3 (j))在2 - 4天孵化,细胞计数。

阐明的细胞内机制RGZ影响肾上腺肿瘤细胞增殖,我们调查的影响药物的两个主要由IGF-IR激活胞内信号通路参与,即磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)一种蛋白激酶级联以及细胞外signal-regulated (ERK)信号18]。

快速刺激(15分钟)SW13(图4(一))和H295R(图4 (b))细胞10 nM IGF-I Ser473决定增加一种蛋白激酶的磷酸化,导致酶的激活(图4、上、下面板)。伴随增加20M RGZ 15分钟IGF-I干扰存在与否的一种蛋白激酶磷酸化/激活SW13(图4(一))和H295R(图4 (b))细胞。RGZ的抑制作用是显著和IGF-I,但这一趋势也出现在活跃的Akt基底条件(图4较低的面板)。PI3K的体外immunokinase试验进行SW13(图5(一个))和H295R(图5 (b))溶菌产物演示了一个快速激活IGF-I(15分钟)的酶,由co-incubation恢复RGZ。RGZ的抑制作用明显只H295R细胞基底条件(数据5(一个),5 (b))。同样,RGZ干扰IGF-I-rapid刺激磷酸化/激活ERK1/2 SW13(图6(一))和H295R(图6 (b)),但相反,RGZ的影响只在SW13细胞基底条件明显(数字6(一),6 (b))。

为了进一步证明Akt的参与和ERK信号下游IGF-IR在调节细胞增殖,我们使用NVP-AEW541(一步法)IGF-IR酪氨酸激酶活性的抑制剂。如图7(一)一步法是能够阻止一种蛋白激酶的磷酸化(上半部分)和ERK1/2(中间面板)都在15分钟后的基础条件和IGF-I刺激。块IGF-IR系统通过一步法结果在IGF-I-stimulated细胞增殖抑制评估在SW13(图2和4天的治疗7 (b)分别)和H295R(图7 (c))。此外,进一步增加RGZ抑制剂的结果没有显著减少细胞增殖与一步法相比,存在IGF-I + IGF-I(数字7 (b),7 (c))表明RGZ增长抑制是通过IGF-IR信号介导的。

最后,我们调查是否RGZ IGF-IR不仅可能影响下游的信号,而且受体本身的水平。图8表明IGF-IR水平不改变后的为期4天的刺激SW13 (a) d H295R (b)与20个细胞M RGZ。

4所示。讨论

尽管肾上腺皮质癌非常罕见的肿瘤,他们非常积极的和高度,对化疗和放疗。此外,使用抗肾上腺素的代理,米托坦(o, p-DDD),是目前唯一可用的药物治疗。因此,一个更好的知识分子机制肿瘤生长和进展是强制性的为了发展更有选择性和特殊治疗。

最近,PPARγ配体已经被描述为抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡和分化表型在几种类型的癌症15),包括肾上腺皮质癌(10,16),因此建议这些药物的使用作为一个潜在的新的抗癌治疗。然而,所有这些研究要么执行了体内,在动物模型上,或在体外,在人类癌症细胞。此外,这些抗癌效应与浓度的PPAR曾被观察到γ受体激动剂,不仅高于临床剂量用于还影响PPAR T2D治疗α和δ亚型,不再为PPAR选择性γ。然而,RGZ治疗剂量高于治疗8毫克/死耐受性良好,不会引起任何不良事件的百分比的增加相比安慰剂组在双盲临床试验19]。

目前,只有三篇论文地址PPAR的影响γ配体在使用H295R ACC细胞作为体外模型(10,16,20.]。RGZ和吡格列酮(PIO),最PPAR使用γTZD配体,抑制细胞生长的影响关键元素和诱导细胞凋亡(细胞周期10,16),也通过减少抑制细胞侵袭性的金属蛋白酶2 (MMP2)表达和活动16]。此外,在这些细胞,RGZ PIO诱导更分化表型,类固醇生成增加是由于MC2-R和明星的一个重要upregulation表达式(10]。

在本文中,我们使用两个不同的ACC细胞模型,H295R, SW13。H295R细胞保留合成类固醇激素的能力,虽然SW13,来自四期肿瘤,不这样做,因此建议他们不如H295R分化。两种细胞系似乎是合适的模型为研究RGZ IGF-I / IGF-IR轴的影响,因为他们表达高水平的IGF-IR,类似于ACC组织。为了刺激IGF-IR及其下游信号级联,我们添加到细胞选择性配体的浓度,增加IGF-I。事实上,IGF-IR结合IGF-I与亲和力15倍高于IGF-II [21]。然而,H295R细胞被描述为生产高水平的IGF-II行为在一个autocrine-paracrine循环刺激IGF-IR轴甚至在基础条件(8]。出于这个原因,在我们的实验过程中,我们改变了细胞孵化媒体每天删除产生的内生IGF-II从而使受体体内添加IGF-I更加敏感。

在这种情况下,IGF-I能够刺激细胞增殖的剂量和时间的方式在两个细胞模型通过两个主要的下游的激活细胞内的信号级联涉及磷脂酰肌醇3-kinase (PI3K)一种蛋白激酶和细胞外signal-regulated激酶(ERK1/2) [21),所述也为其它肿瘤(18]。然而,这两个通路已经活跃甚至在基础条件,证明了相当高水平的ERK和一种蛋白激酶磷酸化以及PI3K活动中缺乏IGF-I刺激的情况下,可能由于paracrine-autocrine效应产生的内生IGF-II [8]。

RGZ已经证明损害IGF-I系统在体内和体外都通过减少IGF-I生产骨髓细胞和肝脏中22]。此外,troglitazone抑制IGF-I小鼠皮肤肿瘤促进活动通过影响细胞内途径包括腺苷酸激酶(23]。

在H295R SW13以及细胞,RGZ能够显著减少细胞增殖剂量和时间的方式所进行的不同的技术(MTS、胸苷吸收和细胞计数),计算IC₅₀的 m .这个浓度高于RGZ等离子体水平估计从血浆浓度时间曲线下的面积(Cmax 1.33米)获得的药代动力学研究与治疗剂量的受试者接受口服RGZ政府8毫克/死(24]。然而,与剂量目前在完美的协议用于在体外研究中,特别是在肿瘤细胞(10,16]。虽然RGZ对细胞增殖抑制作用和活力已经报道H295R细胞(10,16),这是第一次,RGZ IC₅₀和最大效应与适当的统计分析计算(17),从而验证当前的剂量为20M用于癌症研究和建议的anti-proliferative影响RGZ得到更高浓度的有效的胰岛素敏感性(13]。与药代动力学研究来定义相关的毒性研究RGZ口服剂量可导致一系列20M RGZ循环浓度,探讨可能的毒性作用这样的剂量有关,是强制性的,以假设可能的治疗使用RGZ和其他TZD ACC治疗。

除了在基础条件下对细胞增殖的影响,RGZ也有效的增加引起的细胞生长IGF-I浓度增加。有趣的是,这种抑制作用相似的存在或缺乏IGF-I只有在SW13细胞,而H295R RGZ也防止IGF-I的刺激效果。然而,RGZ的抑制作用是在H295R达到更慢比SW13(4 - 7天)(1 - 2天),可能由于动能的差异之间的重复两个细胞系。此外,在H295R RGZ抑制IGF-I剂量的增加,在SW13,效果是类似的独立于生长因子的剂量。因此,集成电路₅₀计算出RGZ对SW13细胞增殖曲线相似IGF-I的存在与否。

为了阐明这一级RGZ干扰激活IGF-I轴在基底条件(从内部产生IGF-II IGF-IR激活),之后进一步激活受体的外生IGF-I,我们调查了受体下游信号通路的表演。RGZ能块的快速激活PI3K-Akt IGF-I引起的轴。在协议与细胞增殖实验中,我们发现,在H295R细胞,RGZ对IGF-I-treated比未经处理的细胞更有效。RGZ也影响了通过抑制ERK通路的快速phosphorylation-activation ERK1和2亚型。类似RGZ对快速erk的磷酸化的影响最近所描述的内皮细胞的炎症反应14]。这样的效果是过快(15分钟)归因于PPAR的古典transactivation机制γ在特定的目标基因,表明PPARγ独立的机制或nongenomic受体的活性。有趣的是,在H295R RGZ施加的抗癌作用,PPARγ依赖和独立的影响似乎在这些细胞共存,因为PPARγ拮抗剂GW9662已经证明阻止RGZ MC2R表达的诱导和皮质醇分泌而不是RGZ抑制细胞增殖(贝茨et al ., 2005)。还需要进一步的研究来阐明PPAR的确切机制γ配体影响这些细胞的快速信号。有趣的是,没有检测到4天RGZ效果stimulationon IGF-IR水平两个细胞系。根据,贝茨和他的同事描述了IGF-II生产随着时间的增加,尽管清楚growth-suppressive RGZ和PIO H295R [10]。我们的研究表明,RGZ抑制作用于信号通路下游但不是IGF-IR的水平。

总之,我们的结果揭示细胞增殖的分子机制和发展肾上腺癌,导致证明RGZ施加于细胞生长抑制效应是由于TDZ干扰的两个主要的下游信号通路激活IGF-IR。RGZ能力阻止IGF-IR轴显示这个分子的潜在应用ACC的治疗。

确认

支持的Tuscany再保险进行了年代帆布上OfRosiglitazone(拥抱我)我stitutoToscanoTumori (ITT)。我们感谢博士f . Frasca(卡塔尼亚大学)对他有用的建议。