N-乙酰半胱氨酸联合IGF-1增强对SH-SY5Y细胞蛋白酶体功能障碍诱导的神经毒性的神经保护作用

摘要

泛素蛋白酶体系统(UPS)功能障碍与许多神经元疾病的发展有关，包括帕金森病(PD)。以前的研究集中在单个神经保护剂和它们各自的能力，以防止神经毒性后，各种有毒的侮辱。然而，抗氧化剂n -乙酰半胱氨酸(NAC)对蛋白酶体损伤诱导的人神经元细胞凋亡的作用尚未被很好地描述。本研究的目的是确定NAC和胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)联合处理是否能有效地保护SH-SY5Y细胞免受蛋白酶体抑制剂诱导的细胞毒性。我们的研究结果表明，蛋白酶体抑制剂MG132可引发聚(adp -核糖)聚合酶(PARP)裂解、caspase 3活化、核缩合和断裂。此外，MG132处理导致内质网应激和自噬介导的细胞死亡。在MG132暴露前，首先分别或同时用NAC和IGF-1处理细胞，可以在不明显减少MG132诱导的蛋白泛素化的情况下减弱所有这些事件。此外，我们的数据表明，两者的结合被证明对神经元的保护更有效。因此，我们得出结论，同时使用生长/神经营养因子和自由基清除剂可能增加对UPS功能障碍介导的细胞毒性和神经退行性变的整体保护。

1.介绍

在散发性和家族性帕金森病(PD)中，导致神经元死亡的途径主要由两种关键的病理事件驱动:异常的蛋白质稳态，包括通常会被UPS系统处理的蛋白质的聚集，以及继发于蛋白病相关聚集的线粒体改变，这是由专性线粒体Ca引起的⁺⁺为响应此聚合而加载[1，2］.越来越多的证据表明氧化应激是这两个事件之间的一个重要的交叉点[3.］.神经元由于寿命长，尤其容易发生蛋白病(包括蛋白质异常聚集)[4]帕金森病的主要病理特征是多巴胺能神经元死亡和在黑质致密部和其他脑干核内聚集称为路易小体（LBs）的嗜酸性内含物[5]在PD的发展过程中，包括抗氧化剂、未折叠蛋白反应（UPR）、分子伴侣、泛素蛋白酶系统（UPS）和自噬在内的细胞防御机制受到严重损害[6］.每一种防御系统都提供了治疗靶点，以干预其在神经元中的启动和进展机制。

在神经元中，两种特殊的蛋白质清除途径，UPS和自噬途径，对维持细胞内环境平衡至关重要，包括ATP平衡、氨基酸循环和蛋白质质量控制。在这两种机制中，UPS对异常蛋白的降解更为重要。UPS过程遵循泛素“标记”异常蛋白的操作，泛素反过来将标记蛋白定位到蛋白酶体进行降解[7]然而，用引起蛋白酶体抑制的药物治疗培养的神经元会导致代偿性自噬，从而防止蛋白质积累和细胞毒性[7］.这表明，通过自噬途径清除蛋白质与它们的聚集倾向相关[8］.

PD患者黑质神经元中的LBs是由一种叫做α-synuclein，是UPS降解和自噬的底物[7，9]虽然神经元自噬似乎主要是神经系统中的一种保护过程，但它也可以在神经元死亡中发挥作用，因为单个细胞可以处理的自噬小泡（及其所含蛋白质）的数量有限[8，10］.

蛋白酶体抑制剂MG132 (Carbobenzoxy-Leu-Leu-Leucinal)，一种膜透性肽醛[11，有效地阻断了蛋白质体复合物的蛋白水解活性。当细胞感觉到异常蛋白的积累时，它的线粒体就开始积累钙⁺⁺，导致细胞色素c释放及线粒体功能障碍[12，引发PARP介导的细胞死亡。异常蛋白也会引发内质网应激，这可以通过诱导CCAAT/增强剂结合蛋白同源蛋白(CHOP)的表达来说明[13]，以及未展开的蛋白反应，导致细胞凋亡。

在真核细胞中，UPS是降解内质网输出的错误折叠蛋白的主要系统。然而，内质网应激作为UPR途径的一部分，也可以通过LC3(微管相关蛋白1轻链3)与膜脂的结合激活自噬[14］.

在许多神经元细胞类型和中枢神经系统（CNS）中，蛋白酶体抑制导致线粒体功能障碍，减少谷胱甘肽水平，并增加自由基的产生[15]。这导致细胞内活性氧（ROS）升高，导致氧化应激。自由基水平的增加会增加蛋白质氧化，并进一步损害蛋白酶体的降解能力。通过这些活动，氧化应激可能助长一个恶性循环，将线粒体功能障碍与蛋白酶体抑制和自噬联系起来，两者都会导致神经退行性变[16］.

既往研究表明，PD患者的抗氧化治疗可以通过解除神经毒性和自噬中细胞氧化应激引起的线粒体损伤耦联来减轻神经元损伤[16]N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一种膜透性抗氧化剂和自由基清除剂，通过将半胱氨酸输送到细胞并作为谷胱甘肽合成的前体来增加细胞内GSH。其神经保护作用已在非PD神经退行性疾病的动物模型和细胞培养研究中得到证实[16- - - - - -19]，并已成功用于治疗精神疾病[20.］.在本研究中，我们评估了两类药物的单独和联合功效，一种是抗氧化剂，一种是神经营养因子，它们在蛋白酶体抑制剂MG132损伤后防止培养的神经元细胞死亡的能力。抗氧化成分选用NAC，神经营养成分选用胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)。后者是一种70个氨基酸长的多肽，具有已知的神经营养、神经源性、神经保护和抗凋亡作用，它对神经系统的发育至关重要，调节细胞生长、分化和神经元及其支持细胞的存活[21，22］.IGF-1诱导这些作用的主要机制是PI3/AKT通路[23］.据我们所知，NAC和IGF-1结合保护受蛋白酶体抑制的人多巴胺能细胞系的能力尚未得到测试。

2.材料和方法

2．1.试剂

n -乙酰半胱氨酸、IGF-1、MG132、MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑]和3-甲基腺嘌呤(3- ma)购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)和Hoechst 33342; 2 '，7 ' -二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFDA)购自Life Technologies (Eugene, OR, USA)。

2.2。细胞培养

人SH-SY5Y细胞和细胞培养基购自美国型培养库(Manassas, VA, USA)。细胞在5% CO条件下培养₂在emem中的37°C：Ham的F-12K培养基（1：1）含有10％胎牛血清（FBS），青霉素（100个单位/ ml）和链霉素（100 μg / mL)。细胞每周在60 mm或100 mm细胞培养皿中传代，在85-90%汇合时进行实验。每2-3天更换一次培养基。Hoechst 33342核酸染色，细胞在4孔腔载玻片中培养。

2．3.抑制剂治疗

用蛋白酶体抑制剂MG132诱导SH-SY5Y培养物的细胞毒性。以DMSO作为对照，其在细胞培养基中的终浓度小于0.1%。将IGF-1悬浮于无菌水中，NAC溶解于培养基中。在神经保护实验中，SH-SY5Y细胞分别用IGF-1 (20 nM)和NAC (3 mM)单独或用相同浓度的两者联合处理18 h。然后用MG132 (5μM) 24小时，除非另有说明。为了避免任何可逆的作用，在整个实验过程中都保持抑制剂。

２.４.细胞生存能力分析

细胞在24孔培养皿中孵育，并使用MTT分析法测定细胞活力数据，测量MTT[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴]转化为formazan的转化率，如前一研究所述[24］.之后，用含0.25 mg/mL MTT的新鲜培养基在37℃下处理细胞2小时。然后去除培养基，用等量的DMSO溶解紫色福马赞盐，100μ每个样品的L转移到96孔板。在490 nm吸收处测定分光光度密度。每个处理至少6个重复。

2．5．免疫印迹分析

通过蛋白质印迹分析测量蛋白质表达量的变化。对于蛋白质印迹，细胞在含有新鲜蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰冷ripa裂解缓冲液中裂解。通过在13,000rpm下在4℃下离心20分钟澄清裂解物，用BCA蛋白质测定试剂盒（Pierce，Rockford，IL，USA）测量它们的蛋白质浓度。等量的蛋白质样品（25-30 μg） 在10%或4-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶（美国加利福尼亚州大力士Bio-Rad Laboratories）上装载和分离蛋白质。将蛋白质转移到硝化纤维素膜上并封闭1小时 h室温下或4°C下过夜，含0.1%吐温20（TBST，pH值7.4）和5%的Tris缓冲盐水 （w/v）脱脂奶粉。

抗parp、抗cleaved caspase 3、抗chop、抗lc3b抗体购自Cell Signaling公司(Beverly, MA, USA)。抗泛素抗体来自Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)。反β-actin购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。用一抗在室温下孵育1小时或在4℃下过夜。然后用适当的辣根过氧化物酶结合的二抗洗涤并孵育1小时。根据制造商的说明，使用增强化学发光(ECL)方法显示蛋白质条带。采用Instat生物统计学程序(GraphPad软件)，采用单向方差分析和Tukey比较检验对条带密度进行定量分析。

2.6。细胞凋亡测定

用免疫印迹法检测对照和预处理培养细胞的PARP和caspase 3裂解。采用Hoechst 33342染色，共聚焦显微镜观察细胞核形态变化。用Hoechst 33342核染料进行染色，细胞在玻璃底皿中培养。处理后用3.7%多聚甲醛固定细胞20 min, PBS洗涤3次，用1μg / ml溶液30分钟。使用Vectashield安装介质安装染色的细胞，用于荧光（矢量实验室，CA，USA）和使用Olympus FV10-ASW3.1软件与Olympus FV1000共聚焦显微镜进行成像。

2.7。氧化压力分析

如前所述，使用细胞渗透的荧光染料2 '，7 ' -二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFDA)检测ROS的产生[25].处理后，细胞装载DCFDA（10 μM)，孵育30分钟。然后用PBS冲洗细胞，立即用荧光微孔板阅读器(SpectraMax, Molecular Devices)测量荧光。激发和发射波长分别为485和520 nm。

2.8。减少谷胱甘肽的测量

谷胱甘肽水平的测定如Kamencic等人2000年所述[26］.在有或没有上述处理试剂的情况下，在37°C下培养细胞，用PBS洗涤，并与一氯二胺(MCB, 40μmol/L)， 37°C，避光30min。PBS洗涤两次后，荧光分光光度计(SpectraMax, Molecular Devices)测量荧光，激发波长和发射波长分别为405和510 nm。样品按三个重复进行测定。

2.9。数据分析

采用GraphPad统计软件对数据进行单因素方差分析和Tukey比较检验。数据显示为至少三个独立实验的平均值±SEM。在图中，星号表示不同处理过的细胞培养物与处理对照或特别提到的(，，分别）。

3.结果

３．１．IGF-1和NAC联合使用可增强SH-SY5Y细胞对MG132诱导毒性的保护作用

用3 mM NAC或20 nM IGF-1处理细胞，或两者联合处理18小时，然后用MG132 (5μM) 24小时。IGF-1和NAC暴露剂量和持续时间的选择是基于以前报道的结果[24]和初步剂量效应数据分别显示最大限度的保护。

如图所示1， MG132处理的细胞在24小时孵育后，相对于未处理的对照组细胞，细胞活力显著降低()．与MG132处理的细胞相比，IGF-1和NAC预处理的细胞毒性降低，细胞存活率分别提高了15.7%±2.26%和7.82%±1.41%。NAC和IGF-1联合给药对SH-SY5Y细胞的保护效果最好，其细胞活力提高了25.4% ()(图1)．

3.2。IGF-1和NAC的组合衰减Mg132诱导SH-Sy5Y细胞凋亡

众所周知，蛋白酶体抑制与凋亡的诱导有关[12].确认并扩展图中的结果1Western blot检测了两种凋亡标志物，分别是PARP裂解和cleaved caspase 3在处理和未处理细胞中的表达。如图所示2(一个)和2 (b)，与对照细胞相比，SH-SY5Y细胞在MG132作用24小时后，裂解的PARP和caspase 3水平均显著升高()．然而，用NAC或IGF-1预处理细胞可显著降低这两种标志物的水平()，而未受保护的细胞则暴露于MG132。与图一致1，经NAC和IGF-1预处理的细胞对MG132诱导的毒性具有完全的保护作用()（数字2(一个)和2 (b))．

除了上述凋亡标记外，我们还比较了未保护和保护细胞的细胞核形态变化。用DNA染料Hoechst 33342对细胞进行染色，观察细胞核形态。由于MG132的剂量较低，如5μM, 24小时后不引起明显的染色质凝结，MG132浓度较高为10μ单独使用MG132孵育的细胞表现出广泛的染色质浓缩和核碎裂，而单独使用NAC或IGF-1预处理的细胞中这些结构相对较少。此外，与NAC和IGF-1共同处理几乎完全阻止了细胞中凋亡小体的出现（图2）2 (c)和2 (d))．

３．３．NAC和IGF-1单独或联合可减弱MG132诱导的活性氧(ROS)的产生和细胞谷胱甘肽的消耗

将SH-SY5Y细胞单独或用NAC或IGF-1处理或处理18小时，然后加入5 μM MG132，如图所示，再延长24小时3.．然后用10µ我是DCFDA还是40 µM -一氯二胺(MCB)孵育30 min，测定其相对荧光。结果表明，MG132显著降低了细胞内总谷胱甘肽含量()．然而，NAC或IGF-1单独或联合预处理均可减轻MG132诱导的GSH耗竭(图)3(一个))．进一步注意，与对照相比，用Mg132处理的细胞中升高了DCFDA强度。然而，Mg132诱导的ROS产生在NAC预处理的细胞中显着抑制了（)或IGF-1 ()，而两者合在一起则进一步减少()(图3(一个))．

3．4．NAC和IGF-1预处理不降低MG132诱导的蛋白泛素化，但可抑制蛋白酶体诱导的自噬

蛋白酶体抑制导致大量泛素化蛋白质的积累[24，27不管维甲酸或IGF-1预处理提供的保护。因此，在本研究中，我们试图确定NAC单独使用或与IGF-1联合使用是否可以减少蛋白质泛素化或影响自噬，而自噬是蛋白酶体功能失调的神经元使用的默认蛋白处理途径[8].图4（a）证实了我们之前从其他保护剂的研究中发现的结果，即蛋白酶体抑制剂处理的细胞无论是否存在NAC或IGF-1，都含有显著增加的泛素化蛋白水平。为了确定自噬是否部署在NAC/IGF-1保护的细胞中，我们测试了受攻击的细胞，受保护的细胞激发细胞和未处理细胞的自噬体膜（脂质结合）水平为LC3。该标记物是酵母中自噬相关基因8的哺乳动物同源物[28是监测自噬的最可靠的标志物之一[29].图s4（a）和4（b）显示mg132处理的细胞中脂质结合的LC3水平升高()．在NAC或IGF-1单独处理的细胞中，LC3水平的部分下降虽然不显著。然而，与NAC和IGF-1共同处理可逆转MG132诱导的LC3表达()．此外，与单独使用IGF-1或NAC治疗相比，NAC和IGF-1联合治疗，LC3-II进一步降低()．这些结果将自噬鉴定为蛋白质质量控​​制中的中央球员，并且在随后的NAC / IGF-1保护细胞的随后的细胞死亡与细胞存活中。

3．5．NAC和IGF-1协同处理可减轻内质网应激

内质网(ER)应激在PD神经元损伤中的作用已被证实[30.，31］.蛋白酶体活性的抑制诱导了CCAAT/增强剂结合蛋白同源蛋白(CHOP)在ER中的积累[32］.为了评估内质网应激参与MG132诱导SH-SY5Y细胞死亡的程度，我们评估了NAC和IGF-1对CHOP表达的影响。数字5(一个)结果表明，MG132可导致CHOP的表达。然而，在MG132暴露前用NAC、IGF-1或同时用NAC和IGF-1处理细胞会降低其表达。事实上，在MG132暴露前与这两种药剂共同处理降低了对照组中MG132诱导的应激反应的基础水平。密度分析显示CHOP水平显著升高14.5±3倍()，而IGF-1、NAC或两者均预处理的细胞中，IGF-1和NAC的水平分别显著下降()(图5 (b))．

3.6。MG132对SH-SY5Y细胞自噬抑制作用的影响

为了研究自噬对凋亡的贡献，细胞培养如图所示1- - - - - -5，但存在或不存在自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)，它通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)阻止自噬小体的形成。如图所示6， MG132诱导的细胞凋亡表现为裂解PARP的表达(图)6 (b))和cleaved caspase 3(图6 (c)）;然而，当用自噬抑制剂3-mA处理细胞时，PARP和Caspase 3裂解裂解，表明自噬部分部分参与SH-SY5Y细胞的Mg132诱导的凋亡细胞死亡。

4.讨论

联合治疗的疗效取决于具有不同但互补作用机制的药物的使用。由于PD病理是由多种因素驱动的，联合神经保护治疗可能比单一药物治疗更有效。一些与PD相关的公认异常是异常蛋白h引起黑质多巴胺能神经元凋亡的内分泌失调、氧化应激、兴奋毒性和炎症过程[33，34］.因此，能够预防这些事件的药物可能具有神经保护作用，当使用联合疗法时，它们对疾病进展的影响甚至是预防作用可能会显著增强。

本研究通过探讨蛋白酶体抑制后氧化应激、内质网应激、自噬和凋亡细胞死亡之间的关系，评估NAC和IGF-1单药和联合治疗对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞蛋白酶体功能障碍诱导的神经毒性的神经保护潜力。NAC的神经保护作用主要是由于其清除ROS的能力和对细胞GSH的维持[16]，而IGF-1通过PI3k/ akt介导的FKHRL1磷酸化(一种翼螺旋家族转录因子的亚类)在内的细胞内途径保护神经元免受细胞死亡[24，35，36]抑制氧化应激[37，38］.这两种药物的结合可能通过作用于包括氧化应激和多种抗凋亡信号通路的多种机制来拓宽保护范围。

我们发现MG132处理显着降低了SH-SY5Y细胞的活力。评估各种参数，例如核缩合和颅骨的碎裂和激活和PARP切割清楚地表明了MG132刺激的明显促凋亡效应。这种细胞死亡途径涉及ROS形成，GSH耗尽，ER应激和诱导自噬。该研究再次证实，使用MG132的SH-SY5Y细胞的处理可以是可靠的模型，可复制Pd的所有神经病理异常，例如线粒体功能障碍，氧化应激和蛋白酶体功能的丧失[15］.

MTT实验表明MG132对SH-SY5Y细胞有明显的细胞毒性作用，NAC和IGF-1预处理均可保护细胞免受MG132的损伤。与这两种药剂共同治疗可显著增加保护作用。这种作用可能是减轻细胞凋亡、增强细胞内GSH、减少ROS和/或减弱内质网应激和自噬的结果。NAC的抗凋亡作用已被证实在体外［12，39] 和体内［40］.虽然有报道称NAC对MG132诱导的细胞死亡有保护作用，包括神经元细胞系，但相似的是在体外NAC剂量不能减轻MG132对N27细胞的有害影响[41.］.这种相互矛盾的结果可能归因于所使用的细胞系的特性。

蛋白泛素化途径中一个重要的调控元件是细胞谷胱甘肽的氧化还原状态，它的消耗可能导致细胞死亡[42.]在MG132诱导的细胞死亡之前，GSH明显耗尽。用NAC、IGF-1或两者对MG132处理的细胞进行预处理，可产生类似的恢复GSH水平的效果。NAC和IGF-1作为GSH的前体并促进其生物合成，从而分别维持降低的GSH含量[43.］.

NAC、IGF-1或两者的预处理均可显著抵消MG132诱导的ROS生成。NAC作为一种直接清除剂，与单独处理相比减少了更多的ROS。ROS的产生是MG132诱导凋亡的中间步骤[44.，45.]，因此NAC和IGF-1预处理对细胞的保护，强烈强调了细胞氧化还原状态在这两种药物的神经保护机制中的关键作用。一些证据也表明，ROS和细胞氧化还原状态参与了自噬的调节[46.］.当我们问及是否通过抑制自噬来区分MG132处理后的细胞和未处理的细胞时，我们发现，自噬衰减是NAC/ igf -1处理后的细胞在MG132作用下存活的一个决定性特征。在NAC和IGF-1预处理的细胞中，自噬标志物LC3-II的部分降低，而两者共同处理的细胞完全可以防止MG132诱导的自噬，药物或两者的保护作用与细胞的保护程度相关。

自噬和ER压力密切相关[47.自噬和自噬在于ER压力下的细胞中加速[14］.事实上，NAC或IGF-1对自噬的损害已经有报道[16，48.］.因此，NAC和IGF-1的增强作用表明，与这两种药物联合治疗具有潜在的强大治疗策略，以对抗蛋白酶体功能障碍引起的神经毒性。此外，通过证明自噬在NAC和IGF-1神经保护中发挥作用，我们的研究表明自噬是PD治疗的潜在靶点。

尽管最近取得了相当大的进展，但自噬究竟是由细胞触发的一种细胞保护反应，以在细胞压力下存活，还是与细胞死亡相关的细胞毒性现象，仍存在争议[49.]自噬失调在包括帕金森病在内的神经退行性疾病中已被描述[50.，51.］.然而，根据细胞环境的不同，自噬可能促进细胞的生存或死亡[52.，53.]为了从不同角度评估自噬在我们系统中的作用，我们测量了在自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）存在下MG132诱导的细胞死亡。3-MA治疗部分阻断了MG132诱导的细胞凋亡（图5)，提示自噬参与了mg132介导的SH-SY5Y细胞神经毒性。综上所述，MG132对蛋白酶体的抑制增加了受损和错误折叠蛋白的聚集。作为主要的细胞毒性应激源，聚集的蛋白然后通过caspase级联和/或自噬触发下游ROS积累、内质网应激和细胞死亡(图)7)NAC和IGF-1对细胞凋亡的完全抑制（仅部分减少LC3-II）强调了涉及ROS形成和GSH消耗以及内质网应激和自噬的多种保护途径的参与。

5.结论

SH-SY5Y细胞中的蛋白酶体抑制可引发凋亡细胞死亡。由NAC和IGF-1组成的药物联合治疗完全缓解了与蛋白酶体功能障碍相关的细胞毒性。神经保护作用依赖于与凋亡相关的多种途径的调节，包括减少ROS、谷胱甘肽耗损、降低内质网应激和防止自噬(图)7)因此，采用神经营养因子（IGF-1）和自由基清除剂（NAC）的联合治疗可能为UPS功能障碍介导的神经细胞变性提供一种新的、有希望的治疗策略。

相互竞争的利益

所有作者宣布没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了创新研究和发展计划(德克萨斯州)的资助。

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